Name: 15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale
Uploaded: 2021-04-19T15:00:00
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Ce travail a été soutenu par des fonds du NIGMS R35GM133488 et du Roy J. Carver Charitable Trust à V.V.

1. Préparation de l’échantillon RMN
<ol><li>Exprimer et purifier un échantillon 2H,15N-labled de la protéine d’intérêt. REMARQUE: Bien qu’un échantillon de protéines marqué 15N puisse être utilisé pour l’acquisition de l’expérience CPMG RD, la perdeutérisation (dans la mesure du possible) augmente considérablement la qualité des données obtenues. Des protocoles pour la production de protéines perdeutérérées sont disponibles dans la littérature<sup class...

<ol>
	<li>Anthis, N. J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy.">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).</li><li>Lisi, G. P., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+NMR+spectroscopy+for+the+study+of+enzyme+allostery.">Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery.</a> Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).</li><li>Mittermaier, A., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+provide+new+insights+in+NMR+studies+of+protein+dynamics.">New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics.</a> Science. 312 (5771), 224-228 (2006).</li><li>Venditti, V., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+selection+and+substrate+binding+regulate+the+monomer/dimer+equilibrium+of+the+C-terminal+domain+of+Escherichia+coli+enzyme+I.">Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).</li><li>Venditti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+interdomain+rearrangement+triggered+by+suppression+of+micro-+to+millisecond+dynamics+in+bacterial+Enzyme+I.">Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I.</a> Nature Communications. 6, 5960 (2015).</li><li>Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+cycle+scheme+that+significantly+suppresses+offset-dependent+artifacts+in+the+R2-CPMG+15N+relaxation+experiment.">A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment.</a> Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).</li><li>Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+slow+(micros-ms)+time+scale+dynamics+in+protein+side+chains+by+(15)N+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy:+application+to+Asn+and+Gln+residues+in+a+cavity+mutant+of+T4+lysozyme.">Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TROSY+CPMG+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+in+large+proteins.">A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).</li><li>Dotas, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+thermophilic/mesophilic+enzymes+reveal+a+role+for+conformational+disorder+in+regulation+of+bacterial+Enzyme+I.">Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).</li><li>Purslow, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+site+breathing+of+human+Alkbh5+revealed+by+solution+NMR+and+accelerated+molecular+dynamics.">Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics.</a> Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+relaxation-compensated+Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+by+NMR+Spectroscopy.">A relaxation-compensated Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).</li><li>Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+15N+relaxation+dispersion+experiment+for+the+measurement+of+millisecond+time-scale+dynamics+in+proteins.">An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins.</a> Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).</li><li>Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope+labeling+strategies+for+the+study+of+high-molecular-weight+proteins+by+solution+NMR+spectroscopy.">Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).</li><li>Niklasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+NMR+data+using+advanced+line+shape+fitting.">Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).</li><li>Palmer, A. G., Kroenke, C. D., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+methods+for+quantifying+microsecond-to-millisecond+motions+in+biological+macromolecules.">Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules.</a> Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).</li><li>Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+dynamics+in+folded+and+unfolded+states+of+an+SH3+domain.">Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).</li><li>Carver, J. P., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+two-site+solution+for+the+chemical+exchange+produced+dependence+of+T2+upon+the+Carr-Purcell+pulse+separation.">A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).</li><li>Egner, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Contrast'+NMR+Reveals+Non-innocent+Role+of+Support+in+Pd/CeO2+Catalyzed+Phenol+Hydrogenation.">Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation.</a> ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).</li><li>Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Insight+into+Nanoparticle+Surface+Adsorption+by+Solution+NMR+Spectroscopy+in+an+Aqueous+Gel.">Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).</li><li>Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+energetics+of+a+three-state+protein+folding+system+probed+by+high-pressure+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy.">The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).</li><li>Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+slow+dynamics+in+high+molecular+weight+proteins+by+methyl-TROSY+NMR+spectroscopy:+application+to+a+723-residue+enzyme.">Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).</li><li>Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+backbone+(13)CO+and+(15)N+relaxation+dispersion+at+high+resolution.">Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).</li><li>Pritchard, R. B., Hansen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+side+chains+in+large+proteins+by+protonless+(13)C-detected+NMR+spectroscopy.">Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy.</a> Nature Communications. 10, 1747 (2019).</li></ol>

Ce manuscrit décrit le protocole mis en œuvre en laboratoire pour l’acquisition et l’analyse de données 15N RD sur les protéines. En particulier, les étapes cruciales pour la préparation de l’échantillon RMN, la mesure des données RMN et l’analyse des profils RD sont couvertes. Ci-dessous, certains aspects importants concernant l’acquisition et l’analyse des expériences de RD sont discutés. Cependant, pour une description plus approfondie de l’expérience et de l’analyse des données,...

Les expériences de dispersion de relaxation (RD) de Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) sont utilisées sur une base de routine pour caractériser les équilibres conformationnels se produisant sur l’échelle de temps μs-ms par spectroscopie RMN en solution1,2,3,4,5. Comparativement à d’autres méthodes d’étude de la dynamique conformationnelle, les techniques cpmg sont relativement faciles à mettre en œuvre sur les spectromètres RMN modernes, ne nécessitent pas d’étapes spécialisées de préparation d’échantillon (c.-à-d. cristallisation, congélation ou alignement d’échantillon, et/ou conjugaison covalente avec une étiquette fluorescente ou paramagnétique), et fournissent une caractérisation complète des équilibres conformationnels renvoyant des informations structurelles, cinétiques et thermodynamiques sur les processus d’échange. Pour qu’une expérience CPMG rende compte d’un équilibre conformationnel, deux conditions doivent s’appliquer : (i) les spins RMN observés doivent posséder différents décalages chimiques dans les états subissant un échange conformationnel (micro-états) et (ii) l’échange doit se produire à une échelle de temps allant de ~50 μs à ~10 ms. Dans ces conditions, le taux de relaxation transversale observé ( <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq01v2.jpg"> ) est la somme duR2 intrinsèque (leR2 mesuré en l’absence de dynamique μs-ms, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq02v3.jpg"> ) et de la contribution d’échange à la relaxation transversale (Rex). La contribution Rex àR2obs peut être progressivement trempée en réduisant l’espacement entre les impulsions de 180° constituant le bloc CPMG de la séquence d’impulsions, et les courbes RD résultantes peuvent être modélisées en utilisant la théorie de Bloch-McConnell pour obtenir la différence de décalage chimique entre les micro-états, la population fractionnaire de chaque micro-état, et les taux d’échange entre les micro-états(Figure 1)1,2,3.
Plusieurs séquences d’impulsions et protocoles d’analyse différents ont été rapportés dans la littérature pour 15expériences cpmg de N. Ici, le protocole mis en œuvre en laboratoire est décrit. En particulier, les étapes cruciales pour la préparation de l’échantillon RMN, la mise en place et l’acquisition des expériences RMN, ainsi que le traitement et l’analyse des données RMN seront introduites (Figure 2). Pour faciliter le transfert du protocole à d’autres laboratoires, le programme d’impulsions, les scripts de traitement et d’analyse et un exemple d’ensemble de données sont fournis sous forme de fichiers supplémentaires et peuvent être téléchargés à l’adresse (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). La séquence d’impulsions fournie intègre un cycle de phase en quatre étapes dans le bloc CPMG pour la suppression des artefacts dépendants du décalage6 et elle est codée pour l’acquisition de plusieurs expériences entrelacées. Ces expériences entrelacées ont une période de relaxation identique mais des nombres différents d’impulsions recentrantes afin d’obtenir différents champs CPMG7. Il est également important de noter que le programme d’impulsions décrit mesure les 15N R2 de la composante TROSY du signal RMN8. Dans l’ensemble, le protocole a été appliqué avec succès pour la caractérisation des échanges conformationnels dans des protéines de taille moyenne et grande4,5,9,10. Pour les systèmes plus petits (<20 kDa), l’utilisation d’une séquence d’impulsions11, 12 basée sur la cohérence quantique unique hétéronucléaire (HSQC) est recommandée.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryoprobe</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe</td>
			<td>Improve sensitivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium Oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>756822-1</td>
			<td>&#62;99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand driven centrifuge</td>
			<td>United Scientific supply</td>
			<td>CENTFG1</td>
			<td>Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Field NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800</td>
			<td>acquisition of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td>
			<td>Modeling of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pasteur Pipette</td>
			<td>Corning Incorporation</td>
			<td>7095D-NMR</td>
			<td>Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tube</td>
			<td>Willmad Precision</td>
			<td>535-PP-7</td>
			<td>5mm thin wall 7&#39;&#39; cylinderical glass tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRPipe</td>
			<td>Institute of Biosciences and Biotechnology research</td>
			<td>https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html</td>
			<td>NMR data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPARKY</td>
			<td>University of California, San Francisco</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/</td>
			<td>Analysis of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tospin 3.2 (or newer)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html</td>
			<td>acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale

La dynamique conformationnelle des protéines joue un rôle fondamental dans la régulation de la catalyse enzymatique, de la liaison au ligand, de l’allostery et de la signalisation, qui sont des processus biologiques importants. Comprendre comment l’équilibre entre la structure et la dynamique régit la fonction biologique est une nouvelle frontière dans la biologie structurale moderne et a déclenché plusieurs développements techniques et méthodologiques. Parmi ceux-ci, les méthodes RMN de la solution de dispersion de relaxation CPMG fournissent des informations uniques de résolution atomique sur la structure, la cinétique et la thermodynamique des équilibres conformationnels des protéines se produisant sur l’échelle de temps μs-ms. Ici, l’étude présente des protocoles détaillés pour l’acquisition et l’analyse d’une expérience de dispersion de relaxation de 15N. À titre d’exemple, le pipeline pour l’analyse de la dynamique μs-ms dans le domaine C-terminal des bactéries enzyme I est montré.

Le protocole décrit ici entraîne l’acquisition de profils RD pour chaque pic du spectre TROSY 1H-15N (Figure 3A). A partir des profils RD acquis, il est possible d’estimer la contribution d’échange à la relaxation transversale de 15N de chaque groupe amide de la dorsale(figure 3A,3B). En traçant le Rex sur la structure 3D de la protéine à l’étude, il est possible d’identifier les rég...

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15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

Ici, une description détaillée du protocole mis en œuvre en laboratoire pour l’acquisition et l’analyse de profils de dispersion de relaxation de 15N par spectroscopie RMN en solution est fournie.

15 ans N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the μs-ms Timescale

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Ce protocole peut être utilisé pour la détection et la caractérisation de la dynamique conformationnelle des protéines, qui sont essentielles pour comprendre une grande variété de processus cellulaires. Par rapport à d’autres méthodes, cette méthode ne nécessite pas d’étapes spécialisées dans la préparation de l’échantillon et fournit une caractérisation complète de la cinétique, de la thermodynamique et des aspects structurels de l’équilibre de confirmation. La dispersion de relaxation CPMG peut être appliquée plus largement pour la caractérisation de la dynamique de confirmation dans les acides nucléiques et autres biomolécules, ainsi que pour la caractérisation des interactions entre les nanoparticules de ligands.Notre protocole s’adresse aux nouveaux utilisateurs de CPMG. C’est donc un bon point de départ. Cependant, nous nous attendons à ce que les utilisateurs connaissent les étapes de base pour exécuter des expériences RMN conventionnelles.Pour configurer une expérience RMN pour la première fois, commencez par télécharger et décompressez ces fichiers supplémentaires. Copiez les bits. vv et trosy_15N_CPMG.vv dans le dossier du programme pulse dans le répertoire du programme pulse. Ouvrez le logiciel d’acquisition et utilisez la commande EDC pour copier une expérience HSQC d’azote 15 d’hydrogène précédemment exécutée dans une nouvelle expérience. Utilisez la commande pulse program pour charger le trosy_15N_CPMG.vv pulse fichier de programme dans l’expérience nouvellement créée. Utilisez ensuite les instructions de la fin du fichier de programme d’impulsions pour configurer l’expérience CPMG. Pour mettre en place une expérience RMN de routine, introduisez l’échantillon dans l’aimant et effectuez toutes les étapes d’acquisition RMN de base.Réglez P1 sur la durée des impulsions dures à l’hydrogène de 90 degrés et P7 sur la durée des impulsions dures de 90 degrés de l’azote 15. Dans la fenêtre d’acquisition, définissez le centre et la largeur spectrale pour les dimensions 15 de l’hydrogène et de l’azote. Placez le retard de relaxation à 0,7 T2 et utilisez la commande de liste de circuit virtuel pour créer une liste de nombres entiers correspondant à N.Après avoir confirmé que chaque entrée dans la liste correspond à un champ cpmg différent selon CPMG classé est égal à des fois 4N divisés par D30, vérifiez que le premier nombre dans la liste est zéro.Définissez L8 sur le nombre d’entrées dans la liste VC, L3 sur le nombre de points réels pour la dimension indirecte et 1TD sur L8 fois L3 fois deux. Pour optimiser la suppression de l’eau, réglez le gain du récepteur sur un et tapez EDC pull pour ouvrir le fichier de programme d’impulsions. À la ligne 91, supprimez le point-virgule précédant la commande 999 et enregistrez le fichier.À l’aide de la commande GS, ajustez les paramètres SPDB0 pour minimiser l’intensité du signal FID. Lorsque l’intensité du signal a été modifiée, réintroduire un point-virgule à la ligne 91 du fichier programme d’impulsions et enregistrer le fichier. Pour optimiser SPDB11, définissez le gain du récepteur sur un et le type EDC pull pour ouvrir le fichier programme pulse.À la ligne 168, supprimez le point-virgule précédant go à 999 et enregistrez le fichier. À l’aide de la commande GS, ajustez les paramètres SPDB11 pour minimiser l’intensité du signal FID. Lorsque l’intensité du signal a été modifiée, réintroduisez le point-virgule à la ligne 168 et enregistrez le fichier.Pour optimiser SPDB2, définissez le gain du récepteur sur un et entrez EDC pull pour ouvrir le fichier de programme pulse. À la ligne 179, supprimez le point-virgule précédant le mot « 999 » et enregistrez le fichier. À l’aide de la commande GS, ajustez les paramètres SPDB2 pour minimiser l’intensité du signal FID.Lorsque l’intensité du signal a été modifiée, réintroduisez le point-virgule à la ligne 179 du fichier de programme d’impulsions et enregistrez le fichier. Pour optimiser PLDB2, réglez le gain du récepteur sur un et entrez EDC pull pour ouvrir le fichier de programme pulse. À la ligne 184, supprimez le point-virgule précédant l’option 999 et enregistrez le fichier.À l’aide de la commande GS, ajustez les paramètres PLDB2 pour minimiser l’intensité du signal FID. Lorsque l’intensité du signal a été modifiée, réintroduire le point-virgule à la ligne 184 du fichier de programme d’impulsions et enregistrer le fichier. Exécutez la commande RGA pour optimiser le gain du récepteur.Exécutez ensuite la commande ZG pour démarrer l’expérience. Sur cette figure, on peut observer les résultats des profils de dispersion de relaxation acquis pour chaque pic du spectre de Trosy de l’azote hydrogène 15. À partir des profils de dispersion de relaxation acquis, il est possible d’estimer la contribution d’échange à la relaxation transversale de l’azote 15 de chaque groupe AMI de base.En traçant la relaxation transversale sur la structure 3D de la protéine à l’étude, il est possible d’identifier les régions structurelles subissant un échange de confirmation sur l’échelle de temps de la microseconde milliseconde. La modélisation des courbes de dispersion de relaxation à l’aide des équations de Carver-Richards renvoie les paramètres thermodynamiques et cinétiques du processus d’échange, tels que les populations fractionnaires des états en équilibre et le taux d’échange entre ces états. La dépendance à la température de ces paramètres thermodynamiques et cinétiques peut ensuite être modélisée à l’aide des équations van’t Hoff et I-ring, respectivement, pour obtenir des informations détaillées sur l’énergie de l’échange de confirmation.Il est crucial d’optimiser soigneusement tous les paramètres d’acquisition, en particulier P7. Il est également important de produire des échantillons très purs et homogènes pour éviter les dispersions parasites. Les paramètres cinétiques, thermodynamiques et chimiques des puces obtenus à l’aide de ce protocole peuvent être utilisés pour dériver des informations énergétiques et structurelles sur les espèces subissant l’échange de confirmation. La caractérisation de la dynamique de confirmation des protéines obtenue par les méthodes CPMG fournit des informations cruciales pour comprendre la signalisation et l’activité enzymatique, ainsi que de nouvelles perspectives pour la conception des médicaments.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

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Recherche

Biochimie

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The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

À l’aide au transfert d’énergie Fluorescence in Vitro pour étudier la dynamique des protéines Complexes à une échelle de temps de milliseconde

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Échelle du protéome Quantification d’homogénéité à l’échelle de la molécule unique d’étiquetage

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisation de la dynamique des récepteurs T-Cell de surface à quatre dimensions à l'aide de microscopie à feuilles de lumière en treillis

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Examiner la dynamique de l'adhérence cellulaire et la propagation des cellules épithéliales sur la fibronectine pendant le stress oxydatif

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Aspects pratiques de la préparation des échantillons et de la configuration des expériences de dispersion de relaxation 1H R1ρ de l’ARN

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...