Name: 15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale
Uploaded: 2021-04-19T15:00:00
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Diese Arbeit wurde durch Mittel von NIGMS R35GM133488 und vom Roy J. Carver Charitable Trust an V.V. unterstützt.

1. Vorbereitung der NMR-Probe
<ol><li>Exprimieren und reinigen Sie eine 2H,15N-labierte Probe des interessierenden Proteins. HINWEIS: Während eine 15N-markierte Proteinprobe für die Erfassung des CPMG RD-Experiments verwendet werden kann, erhöht die Perdeuteration (wo möglich) die Qualität der erhaltenen Daten dramatisch. Protokolle zur Herstellung von perdeuterierten Proteinen sind in der Literatur13verfügbar.</li>
	<li>Puffer tauschen die gereinigte Pr...

<ol>
	<li>Anthis, N. J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy.">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).</li><li>Lisi, G. P., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+NMR+spectroscopy+for+the+study+of+enzyme+allostery.">Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery.</a> Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).</li><li>Mittermaier, A., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+provide+new+insights+in+NMR+studies+of+protein+dynamics.">New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics.</a> Science. 312 (5771), 224-228 (2006).</li><li>Venditti, V., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+selection+and+substrate+binding+regulate+the+monomer/dimer+equilibrium+of+the+C-terminal+domain+of+Escherichia+coli+enzyme+I.">Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).</li><li>Venditti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+interdomain+rearrangement+triggered+by+suppression+of+micro-+to+millisecond+dynamics+in+bacterial+Enzyme+I.">Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I.</a> Nature Communications. 6, 5960 (2015).</li><li>Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+cycle+scheme+that+significantly+suppresses+offset-dependent+artifacts+in+the+R2-CPMG+15N+relaxation+experiment.">A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment.</a> Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).</li><li>Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+slow+(micros-ms)+time+scale+dynamics+in+protein+side+chains+by+(15)N+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy:+application+to+Asn+and+Gln+residues+in+a+cavity+mutant+of+T4+lysozyme.">Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TROSY+CPMG+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+in+large+proteins.">A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).</li><li>Dotas, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+thermophilic/mesophilic+enzymes+reveal+a+role+for+conformational+disorder+in+regulation+of+bacterial+Enzyme+I.">Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).</li><li>Purslow, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+site+breathing+of+human+Alkbh5+revealed+by+solution+NMR+and+accelerated+molecular+dynamics.">Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics.</a> Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+relaxation-compensated+Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+by+NMR+Spectroscopy.">A relaxation-compensated Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).</li><li>Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+15N+relaxation+dispersion+experiment+for+the+measurement+of+millisecond+time-scale+dynamics+in+proteins.">An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins.</a> Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).</li><li>Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope+labeling+strategies+for+the+study+of+high-molecular-weight+proteins+by+solution+NMR+spectroscopy.">Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).</li><li>Niklasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+NMR+data+using+advanced+line+shape+fitting.">Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).</li><li>Palmer, A. G., Kroenke, C. D., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+methods+for+quantifying+microsecond-to-millisecond+motions+in+biological+macromolecules.">Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules.</a> Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).</li><li>Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+dynamics+in+folded+and+unfolded+states+of+an+SH3+domain.">Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).</li><li>Carver, J. P., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+two-site+solution+for+the+chemical+exchange+produced+dependence+of+T2+upon+the+Carr-Purcell+pulse+separation.">A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).</li><li>Egner, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Contrast'+NMR+Reveals+Non-innocent+Role+of+Support+in+Pd/CeO2+Catalyzed+Phenol+Hydrogenation.">Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation.</a> ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).</li><li>Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Insight+into+Nanoparticle+Surface+Adsorption+by+Solution+NMR+Spectroscopy+in+an+Aqueous+Gel.">Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).</li><li>Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+energetics+of+a+three-state+protein+folding+system+probed+by+high-pressure+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy.">The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).</li><li>Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+slow+dynamics+in+high+molecular+weight+proteins+by+methyl-TROSY+NMR+spectroscopy:+application+to+a+723-residue+enzyme.">Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).</li><li>Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+backbone+(13)CO+and+(15)N+relaxation+dispersion+at+high+resolution.">Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).</li><li>Pritchard, R. B., Hansen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+side+chains+in+large+proteins+by+protonless+(13)C-detected+NMR+spectroscopy.">Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy.</a> Nature Communications. 10, 1747 (2019).</li></ol>

Dieses Manuskript beschreibt das im Labor implementierte Protokoll zur Erfassung und Analyse von 15N RD-Daten über Proteine. Insbesondere werden die entscheidenden Schritte zur Vorbereitung der NMR-Probe, zur Messung der NMR-Daten und zur Analyse der RD-Profile behandelt. Im Folgenden werden einige wichtige Aspekte bezüglich der Erfassung und Analyse von RD-Experimenten diskutiert. Für eine eingehendere Beschreibung des Experiments und die Datenanalyse wird jedoch ein sorgfältiges Studium der Originalliter...

Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) Relaxation Dispersion (RD) Experimente werden auf einer Routinebasis verwendet, um Konformationsgleichgewichte auf der μs-ms-Zeitskala durch Lösungs-NMR-Spektroskopie1,2,3,4,5zu charakterisieren. Im Vergleich zu anderen Methoden zur Untersuchung der Konformationsdynamik sind CPMG-Techniken auf modernen NMR-Spektrometern relativ einfach zu implementieren, erfordern keine speziellen Probenvorbereitungsschritte (z. B. Kristallisation, Probengefrieren oder -ausrichtung und/ oder kovalente Konjugation mit einem fluoreszierenden oder paramagnetischen Tag) und bieten eine umfassende Charakterisierung von Konformationsgleichgewichten, die strukturelle, kinetische und thermodynamische Informationen über Austauschprozesse liefern. Damit ein CPMG-Experiment über ein Konformationsgleichgewicht berichten kann, müssen zwei Bedingungen gelten: (i) Die beobachteten NMR-Spins müssen unterschiedliche chemische Verschiebungen in den Zuständen aufweisen, die einem Konformationsaustausch unterzogen werden (Mikrozustände) und (ii) der Austausch muss auf einer Zeitskala von ~ 50 μs bis ~ 10 ms stattfinden. Unter diesen Bedingungen ist die beobachtete Querrelaxationsrate ( <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq01v2.jpg"> ) die Summe des intrinsischenR2 (das in Abwesenheit von μs-ms-Dynamik gemesseneR2) <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq02v3.jpg"> und des Austauschbeitrags zur Querrelaxation (Rex). Der Rex-Beitrag zuR2-Obs kann schrittweise abgeschreckt werden, indem der Abstand zwischen den 180°-Pulsen, die den CPMG-Block der Pulssequenz ausmachen, verringert wird, und die resultierenden RD-Kurven können mit der Bloch-McConnell-Theorie modelliert werden, um die chemische Verschiebungsdifferenz zwischen Mikrozuständen, die fraktionierte Population jedes Mikrostaates und die Austauschraten zwischen Mikrozuständen zu erhalten (Abbildung 1)1,2,3.
Für 15N-CPMG-Experimente wurden in der Literatur mehrere verschiedene Pulssequenzen und Analyseprotokolle berichtet. Hierin wird das im Labor implementierte Protokoll beschrieben. Insbesondere werden die entscheidenden Schritte zur Vorbereitung der NMR-Probe, zum Aufbau und zur Erfassung der NMR-Experimente sowie zur Verarbeitung und Analyse der NMR-Daten vorgestellt (Abbildung 2). Um die Übertragung des Protokolls auf andere Labore zu erleichtern, werden das Pulsprogramm, Verarbeitungs- und Analyseskripte sowie ein Beispieldatensatz als Supplemental Files zur Verfügung gestellt und stehen unter (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html) zum Download zur Verfügung. Die bereitgestellte Pulssequenz beinhaltet einen vierstufigen Phasenzyklus im CPMG-Block zur Unterdrückung von offsetabhängigen Artefakten6 und ist für die Erfassung mehrerer verschachtelter Experimente codiert. Diese verschachtelten Experimente haben eine identische Relaxationsperiode, aber eine unterschiedliche Anzahl von Refokussierpulsen, um verschiedene CPMG-Felder zu erreichen7. Wichtig zu beachten ist auch, dass das beschriebene Pulsprogramm die 15N R2 der TROSY-Komponente des NMR-Signals8 misst. Insgesamt wurde das Protokoll erfolgreich zur Charakterisierung des Konformationsaustausches in mittelgroßen und großformatigen Proteinen4,5,9,10angewendet. Für kleinere Systeme (<20 kDa) empfiehlt sich die Verwendung einer auf Heteronukleärer Single Quantum Coherence (HSQC) basierenden Pulssequenz11,12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryoprobe</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe</td>
			<td>Improve sensitivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium Oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>756822-1</td>
			<td>&#62;99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand driven centrifuge</td>
			<td>United Scientific supply</td>
			<td>CENTFG1</td>
			<td>Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Field NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800</td>
			<td>acquisition of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td>
			<td>Modeling of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pasteur Pipette</td>
			<td>Corning Incorporation</td>
			<td>7095D-NMR</td>
			<td>Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tube</td>
			<td>Willmad Precision</td>
			<td>535-PP-7</td>
			<td>5mm thin wall 7&#39;&#39; cylinderical glass tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRPipe</td>
			<td>Institute of Biosciences and Biotechnology research</td>
			<td>https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html</td>
			<td>NMR data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPARKY</td>
			<td>University of California, San Francisco</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/</td>
			<td>Analysis of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tospin 3.2 (or newer)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html</td>
			<td>acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale

Die Proteinkonformationsdynamik spielt eine grundlegende Rolle bei der Regulierung der enzymatischen Katalyse, Ligandenbindung, Allostersion und Signalisierung, die wichtige biologische Prozesse sind. Zu verstehen, wie das Gleichgewicht zwischen Struktur und Dynamik die biologische Funktion steuert, ist eine neue Grenze in der modernen Strukturbiologie und hat mehrere technische und methodische Entwicklungen ausgelöst. Unter diesen liefern CPMG-Relaxationsdispersionslösungs-NMR-Methoden einzigartige, atomar aufgelöste Informationen über die Struktur, Kinetik und Thermodynamik von Proteinkonformationsgleichgewichten, die auf der μs-ms-Zeitskala auftreten. Hier präsentiert die Studie detaillierte Protokolle zur Erfassung und Analyse eines 15 NRelaxationsdispersionsexperiments. Als Beispiel wird die Pipeline zur Analyse der μs-ms-Dynamik in der C-terminalen Domäne des Bakteriums Enzym I gezeigt.

Das hier beschriebene Protokoll führt zur Erfassung von RD-Profilen für jeden Peak im 1H-15N TROSY-Spektrum (Abbildung 3A). Aus den gewonnenen RD-Profilen ist es möglich, den Austauschbeitrag zur 15N Querrelaxation jeder Backbone-Amid-Gruppe abzuschätzen (Abbildung 3A,3B). Durch die Darstellung des Rex auf der 3D-Struktur des untersuchten Proteins ist es möglich, die Strukturregionen, die sich ein...

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15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

Hier wird eine detaillierte Beschreibung des im Labor implementierten Protokolls zur Erfassung und Analyse von 15 NRelaxationsdispersionsprofilen mittels Lösungs-NMR-Spektroskopie bereitgestellt.

15 N CPMG Relaxation Dispersion zur Untersuchung der Proteinkonformationsdynamik auf der μs-ms Zeitskala

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Dieses Protokoll kann zum Nachweis und zur Charakterisierung von Proteinkonformationsdynamiken verwendet werden, die für das Verständnis einer Vielzahl von zellulären Prozessen unerlässlich sind. Im Vergleich zu anderen Methoden erfordert diese Methode keine speziellen Probenvorbereitungsschritte und bietet eine umfassende Charakterisierung der Kinetik, Thermodynamik und strukturellen Aspekte des bestätigungsweisen Gleichgewichts. CpMG-Relaxationsdispersion kann breiter zur Charakterisierung der Bestätigungsdynamik in Nukleinsäuren und anderen Biomolekülen sowie zur Charakterisierung von Liganden-Nanopartikel-Interaktionen eingesetzt werden.Unser Protokoll richtet sich an CPMG-Erstanwender. Es ist also ein guter Ausgangspunkt. Wir erwarten jedoch, dass die Benutzer die grundlegenden Schritte für die Durchführung herkömmlicher NMR-Experimente kennen.Um ein NMR-Experiment zum ersten Mal einzurichten, laden Sie zuerst diese zusätzlichen Dateien herunter und entpacken Sie sie. Kopieren Sie die Bits. vv und trosy_15N_CPMG.vv-Dateien im pulse-Programmordner in das pulse-Programmverzeichnis. Öffnen Sie die Erfassungssoftware und verwenden Sie den EDC-Befehl, um ein zuvor ausgeführtes Wasserstoffstickstoff-15-HSQC-Experiment in ein neues Experiment zu kopieren. Verwenden Sie den Befehl pulse program, um die trosy_15N_CPMG zu laden.vv Pulsprogrammdatei in das neu erstellte Experiment. Verwenden Sie dann die Anweisungen am Ende der Pulsprogrammdatei, um das CPMG-Experiment einzurichten. Um ein routinemäßiges NMR-Experiment einzurichten, führen Sie die Probe in den Magneten ein und führen Sie alle grundlegenden NMR-Erfassungsschritte durch.Stellen Sie P1 auf die Dauer der wasserstoffharten 90-Grad-Impulse und P7 auf die Dauer Stickstoff 15 harte 90-Grad-Impulse ein. Legen Sie im Erfassungsfenster die Mittlere und Spektralbreite für die Dimensionen Wasserstoff und Stickstoff 15 fest. Setzen Sie die Relaxationsverzögerung auf 0,7 T2 und verwenden Sie den Vc-Listenbefehl, um eine Liste ganzzahliger Zahlen zu erstellen, die N entsprechen.Nachdem Sie bestätigt haben, dass jeder Eintrag in der Liste einem anderen CPMG-Feld entspricht, gemäß CPMG-Datei gleich 4N geteilt durch D30, überprüfen Sie, ob die erste Zahl in der Liste Null ist.Legen Sie L8 auf die Anzahl der Einträge in der VC-Liste, L3 auf die Anzahl der reellen Punkte für die indirekte Dimension und 1TD auf L8 mal L3 mal zwei fest. Um die Wasserunterdrückung zu optimieren, stellen Sie die Empfängerverstärkung auf eins und geben Sie EDC pull ein, um die Impulsprogrammdatei zu öffnen. Entfernen Sie in Zeile 91 das Semikolon vor Goto 999, und speichern Sie die Datei.Passen Sie mit dem GS-Befehl die SPDB0-Parameter an, um die Intensität des FID-Signals zu minimieren. Wenn die Signalintensität geändert wurde, setzen Sie in Zeile 91 der Impulsprogrammdatei wieder ein Semikolon ein und speichern Sie die Datei. Um SPDB11 zu optimieren, stellen Sie die Empfängerverstärkung auf eins und den Typ EDC pull ein, um die Impulsprogrammdatei zu öffnen.Entfernen Sie in Zeile 168 das Semikolon vor Goto 999, und speichern Sie die Datei. Passen Sie mit dem GS-Befehl die SPDB11-Parameter an, um die Intensität des FID-Signals zu minimieren. Wenn die Signalintensität geändert wurde, setzen Sie das Semikolon in Zeile 168 wieder ein und speichern Sie die Datei.Um SPDB2 zu optimieren, stellen Sie die Empfängerverstärkung auf eins und geben Sie EDC-Pull ein, um die Impulsprogrammdatei zu öffnen. Entfernen Sie in Zeile 179 das Semikolon vor Goto 999, und speichern Sie die Datei. Passen Sie mit dem GS-Befehl die SPDB2-Parameter an, um die Intensität des FID-Signals zu minimieren.Wenn die Signalintensität geändert wurde, führen Sie das Semikolon in Zeile 179 der Impulsprogrammdatei wieder ein und speichern Sie die Datei. Um PLDB2 zu optimieren, stellen Sie die Empfängerverstärkung auf eins und geben Sie EDC-Pull ein, um die Impulsprogrammdatei zu öffnen. Entfernen Sie in Zeile 184 das Semikolon vor Goto 999, und speichern Sie die Datei.Passen Sie mit dem GS-Befehl die PLDB2-Parameter an, um die Intensität des FID-Signals zu minimieren. Wenn die Signalintensität geändert wurde, setzen Sie das Semikolon in Zeile 184 der Impulsprogrammdatei wieder ein und speichern Sie die Datei. Führen Sie den RGA-Befehl aus, um die Empfängerverstärkung zu optimieren.Führen Sie dann den Befehl ZG aus, um das Experiment zu starten. In dieser Abbildung können die Ergebnisse der Relaxationsdispersionsprofile beobachtet werden, die für jeden Peak im Wasserstoffstickstoff-15-Trosy-Spektrum erfasst wurden. Aus den erworbenen Relaxationsdispersionsprofilen ist es möglich, den Austauschbeitrag zur Stickstoff-15-Querrelaxation jeder Backbone-AMI-Gruppe abzuschätzen.Durch die Darstellung der Querrelaxation auf der 3D-Struktur des untersuchten Proteins ist es möglich, die strukturellen Regionen, die sich einem Bestätigungsaustausch auf der Mikrosekunden-Millisekunden-Zeitskala unterziehen, zu identifizieren. Die Modellierung der Relaxationsdispersionskurven mit den Carver-Richards-Gleichungen liefert die thermodynamischen und kinetischen Parameter des Austauschprozesses, wie die fraktionierten Populationen der Gleichgewichtszustände und die Wechselkursrate zwischen diesen Zuständen. Die Temperaturabhängigkeit dieser thermodynamischen und kinetischen Parameter kann dann mit den van't Hoff- bzw. I-Ring-Gleichungen modelliert werden, um detaillierte Informationen über die Energetik des Bestätigungsaustauschs zu erhalten.Es ist entscheidend, alle Erfassungsparameter, insbesondere P7, sorgfältig zu optimieren. Es ist auch wichtig, hochreine und homogene Proben herzustellen, um falsche Dispersionen zu vermeiden. Die kinetischen, thermodynamischen und chemischen Chipparameter, die mit diesem Protokoll erhalten werden, können verwendet werden, um energetische und strukturelle Informationen über die Spezies abzuleiten, die den Bestätigungsaustausch durchlaufen. Die Charakterisierung der mit CPMG-Methoden gewonnenen Proteinbestätigungsdynamik liefert entscheidende Informationen zum Verständnis von Signalen und enzymatischer Aktivität sowie neue Perspektiven für das Wirkstoffdesign.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Forschung

Biochemie

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Hsp33 des Redox-regulierten Chaperon Aktivität definieren und Mapping Konformationsänderungen auf Hsp33 mit Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry die Bindung Dynamik der Phospholipid-bindende Protein Annexin A2, solide unterstützt Lipid Bilayer mit einem Quarz-Resonator zu studieren

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

In-vitro-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer verwenden, um die Dynamik der Proteinkomplexe auf einer Millisekunde Zeitskala studieren

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisierung der Oberflächen-T-Zell-Rezeptordynamik vierdimensional mit Lattice Light-Sheet-Mikroskopie

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Untersuchung der Dynamik der zellulären Adhäsion und Ausbreitung von Epithelzellen auf Fibronectin während oxidativen Stresses

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Praktische Aspekte der Probenvorbereitung und des Aufbaus von 1H R1ρ Relaxationsdispersionsexperimenten von RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...