Name: 15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale
Uploaded: 2021-04-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ã‚Âµs-ms Timescale at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי כספים מ NIGMS R35GM133488 ומ קרן הצדקה רוי ג'יי קרבר לV.V.

1. הכנת מדגם NMR
<ol><li>לבטא ולטהר 2H,15N-labled מדגם של החלבון של עניין. הערה: בעוד שמדגם חלבון בעל תווית N 15יכול לשמש לרכישת ניסוי CPMG RD, התייבשות (במידת האפשר) מגדילה באופן דרמטי את איכות הנתונים המתקבלים. פרוטוקולים לייצור חלבונים מיובשים זמינים בספרות13.</li>
	<li>חוצץ ל...

<ol>
	<li>Anthis, N. J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy.">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).</li><li>Lisi, G. P., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+NMR+spectroscopy+for+the+study+of+enzyme+allostery.">Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery.</a> Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).</li><li>Mittermaier, A., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+provide+new+insights+in+NMR+studies+of+protein+dynamics.">New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics.</a> Science. 312 (5771), 224-228 (2006).</li><li>Venditti, V., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+selection+and+substrate+binding+regulate+the+monomer/dimer+equilibrium+of+the+C-terminal+domain+of+Escherichia+coli+enzyme+I.">Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).</li><li>Venditti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+interdomain+rearrangement+triggered+by+suppression+of+micro-+to+millisecond+dynamics+in+bacterial+Enzyme+I.">Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I.</a> Nature Communications. 6, 5960 (2015).</li><li>Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+cycle+scheme+that+significantly+suppresses+offset-dependent+artifacts+in+the+R2-CPMG+15N+relaxation+experiment.">A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment.</a> Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).</li><li>Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+slow+(micros-ms)+time+scale+dynamics+in+protein+side+chains+by+(15)N+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy:+application+to+Asn+and+Gln+residues+in+a+cavity+mutant+of+T4+lysozyme.">Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TROSY+CPMG+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+in+large+proteins.">A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).</li><li>Dotas, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+thermophilic/mesophilic+enzymes+reveal+a+role+for+conformational+disorder+in+regulation+of+bacterial+Enzyme+I.">Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).</li><li>Purslow, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+site+breathing+of+human+Alkbh5+revealed+by+solution+NMR+and+accelerated+molecular+dynamics.">Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics.</a> Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+relaxation-compensated+Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+by+NMR+Spectroscopy.">A relaxation-compensated Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).</li><li>Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+15N+relaxation+dispersion+experiment+for+the+measurement+of+millisecond+time-scale+dynamics+in+proteins.">An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins.</a> Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).</li><li>Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope+labeling+strategies+for+the+study+of+high-molecular-weight+proteins+by+solution+NMR+spectroscopy.">Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).</li><li>Niklasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+NMR+data+using+advanced+line+shape+fitting.">Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).</li><li>Palmer, A. G., Kroenke, C. D., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+methods+for+quantifying+microsecond-to-millisecond+motions+in+biological+macromolecules.">Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules.</a> Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).</li><li>Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+dynamics+in+folded+and+unfolded+states+of+an+SH3+domain.">Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).</li><li>Carver, J. P., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+two-site+solution+for+the+chemical+exchange+produced+dependence+of+T2+upon+the+Carr-Purcell+pulse+separation.">A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).</li><li>Egner, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Contrast'+NMR+Reveals+Non-innocent+Role+of+Support+in+Pd/CeO2+Catalyzed+Phenol+Hydrogenation.">Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation.</a> ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).</li><li>Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Insight+into+Nanoparticle+Surface+Adsorption+by+Solution+NMR+Spectroscopy+in+an+Aqueous+Gel.">Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).</li><li>Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+energetics+of+a+three-state+protein+folding+system+probed+by+high-pressure+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy.">The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).</li><li>Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+slow+dynamics+in+high+molecular+weight+proteins+by+methyl-TROSY+NMR+spectroscopy:+application+to+a+723-residue+enzyme.">Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).</li><li>Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+backbone+(13)CO+and+(15)N+relaxation+dispersion+at+high+resolution.">Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).</li><li>Pritchard, R. B., Hansen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+side+chains+in+large+proteins+by+protonless+(13)C-detected+NMR+spectroscopy.">Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy.</a> Nature Communications. 10, 1747 (2019).</li></ol>

כתב יד זה מתאר את הפרוטוקול המיושם במעבדה לרכישה וניתוח של 15נתוני N RD על חלבונים. בפרט, השלבים הקריטיים להכנת מדגם NMR, מדידת נתוני NMR וניתוח פרופילי המו"פ מכוסים. להלן כמה היבטים חשובים לגבי רכישה וניתוח של ניסויי מו"פ נדונים. עם זאת, לתיאור מעמיק יותר של הניסוי וניתוח הנתונים, מומלץ מאו?...

Carr-פרסל Meiboom-Gill (CPMG) הרפיה פיזור (RD) ניסויים משמשים על בסיס שגרתי לאפיון שיווי משקל קונפורמי המתרחשים על ציר הזמן μs-ms על ידי פתרון ספקטרוסקופיה NMR1,2,3,4,5. בהשוואה לשיטות אחרות לחקירת דינמיקה קונפורמטיבית, טכניקות CPMG קלות יחסית ליישום בספקטרומטרים מודרניים של NMR, אינן דורשות שלבי הכנה מיוחדים לדוגמה (כלומר, התגבשות, הקפאה או יישור מדגם, ו/או הטיה קוולנטית עם תג פלואורסצנטי או פרמגנטי), ומספקות אפיון מקיף של שיווי משקל קונפורמי המחזיר מידע מבני, קינטי ותרמודינמי על תהליכי החלפה. על מנת שניסוי CPMG ידווח על שיווי משקל קונפורמי, יש להחיל שני תנאים: (i) ספינים NMR שנצפו חייבים להחזיק משמרות כימיות שונות במדינות העוברות חילופי קונפורמציה (microstates) ו- (ii) ההחלפה צריכה להתרחש בסולם זמן הנע בין ~ 50 מיקרוס ל ~ 10 אלפיות השנייה. בתנאים אלה, שיעור ההרפיה הרוחבי שנצפה ( <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq01v2.jpg"> ) הוא סכום R2 המהותי (R2 נמדד בהעדר דינמיקה μs-ms), <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq02v3.jpg"> ואת תרומת ההחלפה הרפיה רוחבית (Rex). ניתן להרוותבהדרגה את תרומת Rex לאובס R2על-ידי הפחתת הריווח בין פולסים של 180° המהווים את בלוק ה- CPMG של רצף הדופק, ואת עקומות המו"פ הנובעות מכך ניתן לעצב באמצעות תיאוריית בלוך-מקונל כדי להשיג את ההבדל הכימי בין מיקרוסטאטים, את אוכלוסיית השברים של כל מיקרוסטאט ואת שיעורי ההחלפה בין מיקרוסטטים (איור1).
מספר רצפי דופק שונים ופרוטוקולי ניתוח דווחו בספרות עבור 15ניסויי N CPMG. להלן מתואר הפרוטוקול המיושם במעבדה. בפרט, יוכנסו השלבים המכריעים להכנת מדגם NMR, הקמה ורכישה של ניסויי NMR, ועיבוד וניתוח של נתוני NMR (איור 2). כדי להקל על העברת הפרוטוקול למעבדות אחרות, תוכנית הדופק, סקריפטים עיבוד וניתוח, ו ערכת נתונים אחת לדוגמה מסופקים כקבצים משלימים זמינים להורדה ב (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). רצף הדופק שסופק משלב מחזור פאזה בן ארבעה שלבים בבלוק CPMG לדיכוי חפצים תלויי אופסט6 והוא מקודד לרכישת מספר ניסויים שזורים. ניסויים אלה interleaved יש תקופת הרפיה זהה אבל מספר שונה של פולסים מיקוד מחדש על מנת להשיג שדות CPMG שונים7. חשוב גם לשים לב כי תוכנית הדופק המתוארת מודדת את 15N R2 של רכיב TROSY של אות NMR8. בסך הכל, הפרוטוקול הוחל בהצלחה על אפיון חילופי קונפורמציה בחלבונים בינוניים וגדולים4,5,9,10. עבור מערכות קטנות יותר (<20 kDa), מומלץ להשתמש בקוהרנטיות קוונטית אחת הטרונוקלארית (HSQC) המבוססת עלפולסים 11,12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryoprobe</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe</td>
			<td>Improve sensitivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium Oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>756822-1</td>
			<td>&#62;99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand driven centrifuge</td>
			<td>United Scientific supply</td>
			<td>CENTFG1</td>
			<td>Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Field NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800</td>
			<td>acquisition of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td>
			<td>Modeling of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pasteur Pipette</td>
			<td>Corning Incorporation</td>
			<td>7095D-NMR</td>
			<td>Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tube</td>
			<td>Willmad Precision</td>
			<td>535-PP-7</td>
			<td>5mm thin wall 7&#39;&#39; cylinderical glass tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRPipe</td>
			<td>Institute of Biosciences and Biotechnology research</td>
			<td>https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html</td>
			<td>NMR data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPARKY</td>
			<td>University of California, San Francisco</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/</td>
			<td>Analysis of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tospin 3.2 (or newer)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html</td>
			<td>acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale

דינמיקה קונפורמציה של חלבונים ממלאת תפקידי יסוד בוויסות קטליזה אנזימטית, כריכת ליגנד, אלוסטריה ואיתות, שהם תהליכים ביולוגיים חשובים. הבנת האופן שבו האיזון בין מבנה לדינמיקה שולט בתפקוד הביולוגי היא גבול חדש בביולוגיה המבנית המודרנית והציתה מספר התפתחויות טכניות ומתודולוגיות. בין אלה, פתרון פיזור הרפיה CPMG שיטות NMR לספק ייחודי, מידע ברזולוציה אטומית על המבנה, קינטיקה, תרמודינמיקה של שיווי משקל קונפורמי חלבון המתרחשים על ציר הזמן μs-ms. כאן, המחקר מציג פרוטוקולים מפורטים לרכישה וניתוח של ניסוי פיזור הרפיה 15N. כדוגמה, הצינור לניתוח הדינמיקה μs-ms בתחום C-מסוף של אנזים חיידקים אני מוצג.

הפרוטוקול המתואר כאן מביא לרכישת פרופילי RD עבור כל שיא בספקטרום 1H-15N TROSY (איור 3A). מפרופילי המו"פ הנרכשים ניתן להעריך את תרומת ההחלפה לרגיעה רוחבית של 15N של כל קבוצת אמידה(איור 3A, 3B). על ידי התוויית Rex על המבנה 3D של החלבון תחת חקי?...

Watch this Scientific Journal Video about 15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ã‚Âµs-ms Timescale at JoVE.com

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

כאן, תיאור מפורט של הפרוטוקול מיושם במעבדה לרכישה וניתוח של 15N פרופילי פיזור הרפיה על ידי פתרון ספקטרוסקופיה NMR מסופק.

15 (15) N פיזור הרפיה CPMG לחקירת דינמיקה קונפורמטיבית חלבון על ציר הזמן μs-ms

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

פרוטוקול זה יכול לשמש לגילוי ואפיון של דינמיקה קונפורמית של חלבונים, החיוניים להבנת מגוון רחב של תהליכים תאיים. בהשוואה לשיטות אחרות, שיטה זו אינה דורשת שלבי הכנה מדגם מיוחדים ומספקת אפיון מקיף של הקינטיקה, התרמודינמיקה וההיבטים המבניים של שיווי המשקל האישורי. פיזור הרפיה CPMG יכול להיות מיושם באופן נרחב יותר עבור אפיון של דינמיקה אישור חומצות גרעין וביומולקולות אחרות, כמו גם עבור אפיון של אינטראקציות חלקיקי ligand.הפרוטוקול שלנו מיועד למשתמשי CPMG בפעם הראשונה. אז זו נקודת התחלה טובה. עם זאת, אנו מצפים מהמשתמשים לדעת את השלבים הבסיסיים להפעלת ניסויי NMR קונבנציונליים.כדי להגדיר ניסוי NMR בפעם הראשונה, הורד תחילה ובטל את ההסתעפות של קבצים משלימים אלה. העתק את הסיביות. vv trosy_15N_CPMG.vv קבצים בתיקיית תוכנית הדופק לספריית תוכנית הדופק. פתח את תוכנת הרכישה והשתמש בפקודה EDC כדי להעתיק ניסוי חנקן מימן 15 HSQC שנערך בעבר לניסוי חדש. השתמש בפקודה pulse program כדי לטעון את trosy_15N_CPMG.vv pulse קובץ תוכנית לתוך הניסוי החדש שנוצר. לאחר מכן השתמש בהוראות מסוף קובץ תוכנית הדופק כדי להגדיר את ניסוי CPMG. כדי להגדיר ניסוי NMR שגרתי, הצג את הדגימה למגנט ובצע את כל שלבי הרכישה הבסיסיים של NMR.הגדר P1 למשך של מימן קשה 90 מעלות פולסים P7 למשך חנקן 15 קשה 90 מעלות פולסים. בחלון הרכישה, להגדיר את המרכז ואת רוחב ספקטרלי עבור מימן וחנקן 15 ממדים. הגדר את השהיית ההרפיה ל- 0.7 T2 והשתמש בפקודה רשימת VC כדי ליצור רשימה של מספרים שלמים התואמים ל- N.After המאשרים כי כל ערך ברשימה תואם לשדה CPMG שונה בהתאם ל- CPMG שהוגש שווה לפי 4N חלקי D30, ודא שהמספר הראשון ברשימה הוא אפס.הגדר את L8 למספר הערכים ברשימת ה- VC, L3 למספר הנקודות הממשיות עבור הממד העקיף ו- 1TD ל- L8 פעמים L3 כפול שתיים. כדי למטב את דיכוי המים, הגדר את הרווח מקלט אחד וסוג EDC למשוך כדי לפתוח את קובץ תוכנית הדופק. בשורה 91, הסר את הנקודה-פסיק שלפני goto 999 ושמור את הקובץ.באמצעות הפקודה GS, התאם את הפרמטרים SPDB0 כדי למזער את עוצמת אות ה- FID. כאשר עוצמת האות שונתה, הצג מחדש נקודה-פסיק בשורה 91 של קובץ תוכנית הדופק ושמור את הקובץ. כדי למטב את SPDB11, הגדר את הרווח של המקלט לאחד ואת סוג המשיכה של EDC כדי לפתוח את קובץ תוכנית הדופק.בשורה 168, הסר את נקודתיים הנקודה-פסיק שלפני goto 999 ושמור את הקובץ. באמצעות הפקודה GS, התאם את הפרמטרים SPDB11 כדי למזער את עוצמת אות ה- FID. לאחר שינוי עוצמת האות, הצג מחדש את נקודתיים-פסיק בקו 168 ושמור את הקובץ.כדי למטב את SPDB2, הגדר את רווח המקלט לאחד והזן משיכה EDC כדי לפתוח את קובץ תוכנית הדופק. בשורה 179, הסר את נקודתיים הנקודה-פסיק שלפני goto 999 ושמור את הקובץ. באמצעות הפקודה GS, התאם את הפרמטרים SPDB2 כדי למזער את עוצמת אות ה- FID.לאחר שינוי עוצמת האות, הצג מחדש את נקודתיים הנקודה-פסיק בשורה 179 של קובץ תוכנית הדופק ושמור את הקובץ. כדי למטב את PLDB2, הגדר את רווח המקלט לאחד והזן משיכה EDC כדי לפתוח את קובץ תוכנית הדופק. בשורה 184, הסר את נקודתיים הנקודה-פסיק שלפני goto 999 ושמור את הקובץ.באמצעות הפקודה GS, התאם את הפרמטרים PLDB2 כדי למזער את עוצמת אות ה- FID. כאשר עוצמת האות שונתה, הצג מחדש את נקודתיים הנקודה-פסיק בשורה 184 של קובץ תוכנית הדופק ושמור את הקובץ. הפעל את הפקודה RGA כדי למטב את רווח המקלט.לאחר מכן הפעל את הפקודה ZG כדי להתחיל את הניסוי. באיור זה, ניתן לראות את התוצאות של פרופילי פיזור הרפיה שנרכשו עבור כל שיא בספקטרום מימן חנקן 15 טרוסי. מפרופילי פיזור הרגיעה הנרכשים, ניתן להעריך את תרומת ההחלפה לחנקן 15 הרפיה רוחבית של כל קבוצת AMI עמוד שדרה.על ידי התוויית הרפיה רוחבית על המבנה 3D של החלבון תחת חקירה אפשר לזהות את האזורים המבניים שעברו חילופי אישור על ציר הזמן אלפית השנייה מיקרו שניות. מידול עקומות פיזור ההרפיה באמצעות משוואות קארבר-ריצ'רדס מחזיר את הפרמטרים התרמודינמיים והקינטיים בתהליך ההחלפה, כגון אוכלוסיות השבר של המדינות בשיווי משקל ושער החליפין בין מדינות אלה. התלות בטמפרטורה של פרמטרים תרמודינמיים וקינטיים אלה יכולה להיות מעוצבת באמצעות משוואות van't Hoff ו- I-ring, בהתאמה, כדי לקבל מידע מפורט על האנרגיות של חילופי האישור.זה חיוני כדי לייעל בזהירות את כל הפרמטרים הרכישה, במיוחד P7. חשוב גם לייצר דגימות טהורות והומוגניות מאוד, כדי למנוע פיזור מזויף. הפרמטרים הקינטיים, התרמודינמיים והכימיים שהושגו באמצעות פרוטוקול זה יכולים לשמש להפקת מידע אנרגטי ומבניות על המינים העוברים את חילופי האישורים. אפיון הדינמיקה אישור החלבון המתקבל על ידי שיטות CPMG מספק מידע חיוני להבנת איתות ופעילות אנזימטית, כמו גם פרספקטיבות חדשות לעיצוב תרופות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

הגדרת פעילות מוסדר חמצון-חיזור המלווה של Hsp33 ומיפוי השינויים הסתגלותי על Hsp33 באמצעות ספקטרומטר מסה של המרת מימן-דאוטריום

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

שימוש בהעברת אנרגיה פלורסצנטיות תהודה חוץ גופית ללמוד את הדינמיקה של חלבון מתחמי בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

בחינת הדינמיקה של הדבקה תאית והפצת תאים אפיתל על Fibronectin במהלך לחץ חמצוני

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

היבטים מעשיים של הכנת מדגם והגדרת 1H R1ρ הרפיה ניסויים של RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...