Name: 15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale
Uploaded: 2021-04-19T15:00:00
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इस काम को एनआईजीएमएस R35GM133488 से और रॉय जे कार्वर चैरिटेबल ट्रस्ट से वीवी तक के फंडों ने समर्थन दिया ।

1. एनएमआर नमूने की तैयारी
<ol><li>एक्सप्रेस और एक 2एच,15एन-ब्याज के प्रोटीन का नमूना शुद्ध । नोट: जबकि एक 15एन लेबल प्रोटीन नमूना CPMG RD प्रयोग के अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, perdeuteration (जहां सं?...

<ol>
	<li>Anthis, N. J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy.">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).</li><li>Lisi, G. P., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+NMR+spectroscopy+for+the+study+of+enzyme+allostery.">Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery.</a> Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).</li><li>Mittermaier, A., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+provide+new+insights+in+NMR+studies+of+protein+dynamics.">New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics.</a> Science. 312 (5771), 224-228 (2006).</li><li>Venditti, V., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+selection+and+substrate+binding+regulate+the+monomer/dimer+equilibrium+of+the+C-terminal+domain+of+Escherichia+coli+enzyme+I.">Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).</li><li>Venditti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+interdomain+rearrangement+triggered+by+suppression+of+micro-+to+millisecond+dynamics+in+bacterial+Enzyme+I.">Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I.</a> Nature Communications. 6, 5960 (2015).</li><li>Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+cycle+scheme+that+significantly+suppresses+offset-dependent+artifacts+in+the+R2-CPMG+15N+relaxation+experiment.">A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment.</a> Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).</li><li>Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+slow+(micros-ms)+time+scale+dynamics+in+protein+side+chains+by+(15)N+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy:+application+to+Asn+and+Gln+residues+in+a+cavity+mutant+of+T4+lysozyme.">Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TROSY+CPMG+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+in+large+proteins.">A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).</li><li>Dotas, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+thermophilic/mesophilic+enzymes+reveal+a+role+for+conformational+disorder+in+regulation+of+bacterial+Enzyme+I.">Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).</li><li>Purslow, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+site+breathing+of+human+Alkbh5+revealed+by+solution+NMR+and+accelerated+molecular+dynamics.">Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics.</a> Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+relaxation-compensated+Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+by+NMR+Spectroscopy.">A relaxation-compensated Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).</li><li>Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+15N+relaxation+dispersion+experiment+for+the+measurement+of+millisecond+time-scale+dynamics+in+proteins.">An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins.</a> Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).</li><li>Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope+labeling+strategies+for+the+study+of+high-molecular-weight+proteins+by+solution+NMR+spectroscopy.">Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).</li><li>Niklasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+NMR+data+using+advanced+line+shape+fitting.">Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).</li><li>Palmer, A. G., Kroenke, C. D., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+methods+for+quantifying+microsecond-to-millisecond+motions+in+biological+macromolecules.">Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules.</a> Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).</li><li>Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+dynamics+in+folded+and+unfolded+states+of+an+SH3+domain.">Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).</li><li>Carver, J. P., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+two-site+solution+for+the+chemical+exchange+produced+dependence+of+T2+upon+the+Carr-Purcell+pulse+separation.">A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).</li><li>Egner, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Contrast'+NMR+Reveals+Non-innocent+Role+of+Support+in+Pd/CeO2+Catalyzed+Phenol+Hydrogenation.">Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation.</a> ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).</li><li>Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Insight+into+Nanoparticle+Surface+Adsorption+by+Solution+NMR+Spectroscopy+in+an+Aqueous+Gel.">Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).</li><li>Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+energetics+of+a+three-state+protein+folding+system+probed+by+high-pressure+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy.">The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).</li><li>Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+slow+dynamics+in+high+molecular+weight+proteins+by+methyl-TROSY+NMR+spectroscopy:+application+to+a+723-residue+enzyme.">Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).</li><li>Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+backbone+(13)CO+and+(15)N+relaxation+dispersion+at+high+resolution.">Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).</li><li>Pritchard, R. B., Hansen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+side+chains+in+large+proteins+by+protonless+(13)C-detected+NMR+spectroscopy.">Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy.</a> Nature Communications. 10, 1747 (2019).</li></ol>

यह पांडुलिपि प्रोटीन पर 15एन आरडी डेटा के अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए प्रयोगशाला में लागू प्रोटोकॉल का वर्णन करती है। विशेष रूप से, एनएमआर नमूना तैयार करने, एनएमआर डेटा की माप और आरडी प्रोफाइल के वि?...

कैर-पुरसेल मेबूम-गिल (सीपीएमजी) विश्राम प्रसार (आरडी) प्रयोगों का उपयोग नियमित आधार पर किया जाता है ताकि समाधान एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी1,2,3,4,5द्वारा माइक्रोन-एमएस टाइमस्केल पर होने वाली अनुरूप संतुलन की विशेषता हो। अनुरूप गतिशीलता की जांच के लिए अन्य तरीकों की तुलना में, CPMG तकनीकों को आधुनिक एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर पर लागू करना अपेक्षाकृत आसान है, विशेष नमूना तैयारी चरणों (यानी, क्रिस्टलीकरण, नमूना ठंड या संरेखण, और/या एक फ्लोरोसेंट या पैरामैग्नेटिक टैग के साथ सहसंयोजक संयुग्मण की आवश्यकता नहीं है), और विनिमय प्रक्रियाओं पर अनुरूप संतुलन संतुलन लौटने की एक व्यापक लक्षण प्रदान करते हैं। एक सामंती संतुलन पर रिपोर्ट करने के लिए एक CPMG प्रयोग के लिए, दो शर्तों को लागू करना होगा: (i) मनाया एनएमआर स्पिन अनुरूप विनिमय (माइक्रोस्टेट्स) के दौर से गुजर राज्यों में विभिन्न रासायनिक बदलाव के अधिकारी होना चाहिए और (ii) विनिमय ~50 μs से ~ 10 एमएस तक के समय पैमाने पर होना चाहिए । इन शर्तों के तहत, मनाया गया ट्रांसवर्स छूट दर <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq01v2.jpg"> () आंतरिक आर2 (आर2 μs-ms गतिशीलता के अभाव में मापा जाता <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq02v3.jpg"> है) और ट्रांसवर्स विश्राम (आरपूर्व)में विनिमय योगदान का योग है। आर2ऑब्स में आरपूर्व योगदान को पल्स सीक्वेंस के सीपीएमजी ब्लॉक का गठन करने वाली 180 डिग्री दालों के बीच की दूरी को कम करके उत्तरोत्तर शमन किया जा सकता है, और परिणामस्वरूप आरडी घटता को ब्लोच-मैककॉनेल सिद्धांत का उपयोग करके मॉडलिंग की जा सकती है ताकि माइक्रोस्टेट्स के बीच रासायनिक बदलाव अंतर प्राप्त किया जा सके, प्रत्येक माइक्रोस्टेट की आंशिक आबादी, और माइक्रोस्टेट्स(चित्रा 1)1,2,3के बीच विनिमय की दरें।
15 एन सीपीएमजी प्रयोगों के लिए साहित्य में कई अलग-अलग पल्ससीक्वेंस और एनालिसिस प्रोटोकॉल की सूचना मिली है। इसके साथ ही प्रयोगशाला में लागू प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। विशेष रूप से, एनएमआर नमूने को तैयार करने, एनएमआर प्रयोगों की स्थापना और अधिग्रहण और एनएमआर डेटा के प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण कदम(चित्र 2)पेश किए जाएंगे। प्रोटोकॉल को अन्य प्रयोगशालाओं में स्थानांतरित करने की सुविधा के लिए, पल्स प्रोग्राम, प्रसंस्करण और विश्लेषण स्क्रिप्ट, और एक उदाहरण डेटासेट पूरक फ़ाइलों के रूप में प्रदान किए जाते हैं और (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html) पर डाउनलोड के लिए उपलब्ध हैं। प्रदान की गई पल्स अनुक्रम में ऑफसेट-निर्भर कलाकृतियों6 के दमन के लिए सीपीएमजी ब्लॉक में चार चरण चरण चक्र शामिल है और यह कई इंटरलीव्ड प्रयोगों के अधिग्रहण के लिए कोडित है। इन अंतरप्रावेदित प्रयोगों में एक समान विश्राम अवधि होती है , लेकिन विभिन्न सीपीएमजी क्षेत्रों को प्राप्त करने के लिए दालों को फिर से केंद्रित करने की विभिन्नसंख्याएं 7. यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि वर्णित पल्स प्रोग्राम एनएमआर सिग्नल 8 के ट्रोसी घटक के 15एन आर2 कोमापताहै। कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल को मध्यम और बड़े आकार केप्रोटीन4,5,9,10में अनुरूप विनिमय के लक्षण वर्णन के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है। छोटी प्रणालियों (<20 केडीए) के लिए, हेट्रोन्यूक्लियर सिंगल क्वांटम जुटना (एचएसक्यूसी) आधारित पल्स सीक्वेंस11,12 का उपयोग उचित है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryoprobe</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe</td>
			<td>Improve sensitivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium Oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>756822-1</td>
			<td>&#62;99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand driven centrifuge</td>
			<td>United Scientific supply</td>
			<td>CENTFG1</td>
			<td>Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Field NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800</td>
			<td>acquisition of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td>
			<td>Modeling of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pasteur Pipette</td>
			<td>Corning Incorporation</td>
			<td>7095D-NMR</td>
			<td>Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tube</td>
			<td>Willmad Precision</td>
			<td>535-PP-7</td>
			<td>5mm thin wall 7&#39;&#39; cylinderical glass tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRPipe</td>
			<td>Institute of Biosciences and Biotechnology research</td>
			<td>https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html</td>
			<td>NMR data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPARKY</td>
			<td>University of California, San Francisco</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/</td>
			<td>Analysis of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tospin 3.2 (or newer)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html</td>
			<td>acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale

प्रोटीन अनुरूप गतिशीलता एंजाइमैतिक उत्प्रेरक, लिगांड बाइंडिंग, एलोस्टरी और सिग्नलिंग के नियमन में मौलिक भूमिकाएं निभाती हैं, जो महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाएं हैं। संरचना और गतिशीलता के बीच संतुलन जैविक कार्य को नियंत्रित करने के तरीके को समझना आधुनिक संरचनात्मक जीव विज्ञान में एक नई सीमा है और इसने कई तकनीकी और पद्धतिगत विकास को प्रज्वलित किया है। इनमें से, सीपीएमजी विश्राम फैलाव समाधान एनएमआर विधियां संरचना, काइनेटिक्स और थर्मोडायनामिक्स की संरचना पर अद्वितीय, परमाणु-संकल्प जानकारी प्रदान करती हैं, जो माइक्रोन-एमएस टाइमस्केल पर होने वाली प्रोटीन अनुरूप संतुलन संतुलन की है। यहां, अध्ययन 15एन विश्राम प्रसार प्रयोग के अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। एक उदाहरण के रूप में, बैक्टीरिया एंजाइम I के सी-टर्मिनल डोमेन में μs-ms गतिशीलता के विश्लेषण के लिए पाइपलाइन दिखाया गया है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप 1 एच-15एन ट्रोसी स्पेक्ट्रम(चित्रा 3 ए)में प्रत्येक चोटी के लिए आरडी प्रोफाइल का अधिग्रहण होता है। अधिग्रहीत आरडी प्रोफाइल से, प्रत्येक रीढ़ की ...

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15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

यहां, समाधान एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा 15एन विश्राम प्रसार प्रोफाइल के अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए प्रयोगशाला में लागू प्रोटोकॉल का विस्तृत विवरण प्रदान किया गया है।

15 एन CPMG μs-एमएस Timescale पर प्रोटीन अनुरूप गतिशीलता की जांच के लिए छूट फैलाव

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्रोटीन अनुरूप गतिशीलता का पता लगाने और लक्षण वर्णन के लिए किया जा सकता है, जो सेलुलर प्रक्रियाओं की एक बड़ी विविधता को समझने के लिए आवश्यक हैं। अन्य तरीकों की तुलना में, इस विधि को विशेष नमूना तैयारी चरणों की आवश्यकता नहीं होती है और काइनेटिक्स, थर्मोडायनामिक्स और पुष्टित्मक संतुलन के संरचनात्मक पहलुओं के व्यापक लक्षण वर्णन में प्रदान करता है। सीपीएमजी विश्राम फैलाव को न्यूक्लिक एसिड और अन्य जैव अणुओं में पुष्टित्मक गतिशीलता के लक्षण वर्णन के साथ-साथ लिगांड नैनोपार्टिकल इंटरैक्शन के लक्षण वर्णन के लिए अधिक व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है।हमारा प्रोटोकॉल पहली बार CPMG उपयोगकर्ताओं के उद्देश्य से है। तो यह एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है। हालांकि, हम उपयोगकर्ताओं से पारंपरिक एनएमआर प्रयोगों को चलाने के लिए बुनियादी कदमों को जानने की उम्मीद करते हैं।पहली बार एनएमआर प्रयोग स्थापित करने के लिए, पहली बार इन पूरक फ़ाइलों को डाउनलोड और अनजिप करें। बिट्स को कॉपी करें। वीवी और trosy_15N_CPMG।पल्स प्रोग्राम फोल्डर में वीवी फ़ाइलें पल्स प्रोग्राम निर्देशिका के लिए फ़ोल्डर। अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें और ईडीसी कमांड का उपयोग पहले से चलने वाले हाइड्रोजन नाइट्रोजन 15 एचएसक्यूसी प्रयोग को एक नए प्रयोग में कॉपी करने के लिए करें। trosy_15N_CPMG लोड करने के लिए पल्स प्रोग्राम कमांड का उपयोग करें।वीवी पल्स प्रोग्राम नए बनाए गए प्रयोग में फ़ाइल। फिर CPMG प्रयोग स्थापित करने के लिए पल्स प्रोग्राम फ़ाइल के अंत से निर्देशों का उपयोग करें। एक नियमित एनएमआर प्रयोग स्थापित करने के लिए, चुंबक के लिए नमूना शुरू करने और बुनियादी एनएमआर अधिग्रहण कदम के सभी प्रदर्शन करते हैं ।हाइड्रोजन हार्ड 90 डिग्री दालों और P7 की अवधि नाइट्रोजन 15 हार्ड 90 डिग्री दालों की अवधि के लिए P1 सेट करें। अधिग्रहण खिड़की में, हाइड्रोजन और नाइट्रोजन 15 आयामों के लिए केंद्र और स्पेक्ट्रल चौड़ाई सेट करें। 0.7 T2 के लिए छूट देरी सेट करें और कुलपति सूची कमान का उपयोग करने के लिए N. के अनुरूप पूर्णांक संख्या की एक सूची बनाने के लिए पुष्टि के बाद कि सूची में प्रत्येक प्रविष्टि एक अलग CPMG क्षेत्र से मेल खाती है CPMG के अनुसार दायर की संख्या 4N D30 द्वारा विभाजित, जांच करें कि सूची में पहला नंबर शूंय है ।कुलपति सूची में प्रविष्टियों की संख्या के लिए L8 सेट, अप्रत्यक्ष आयाम के लिए वास्तविक अंक की संख्या के लिए L3, और L8 बार L3 बार दो करने के लिए 1TD । पानी के दमन को अनुकूलित करने के लिए, पल्स प्रोग्राम फ़ाइल खोलने के लिए रिसीवर लाभ को एक और टाइप ईडीसी पुल पर सेट करें। लाइन 91 पर, सेमी-कोलन पूर्ववर्ती गोटो 999 को हटा दें, और फ़ाइल को सहेजें।जीएस कमांड का उपयोग करके, एफिड सिग्नल की तीव्रता को कम करने के लिए एसपीडीबी0 मापदंडों को समायोजित करें। जब सिग्नल की तीव्रता को संशोधित किया गया है, तो पल्स प्रोग्राम फ़ाइल के लाइन 91 पर एक अर्ध-कोलन को फिर से पेश करें और फ़ाइल को सहेजें। SPDB11 को अनुकूलित करने के लिए, पल्स प्रोग्राम फ़ाइल को खोलने के लिए रिसीवर लाभ को एक और प्रकार ईडीसी पुल पर सेट करें।लाइन 168 पर, सेमी-कोलन पूर्ववर्ती गोटो 999 को हटा दें, और फ़ाइल को सहेजें। जीएस कमांड का उपयोग करके, एफिड सिग्नल की तीव्रता को कम करने के लिए एसपीडीबी11 मापदंडों को समायोजित करें। जब सिग्नल की तीव्रता में संशोधन किया गया हो, तो लाइन 168 पर अर्ध-कोलन को फिर से शुरू करें और फ़ाइल को सहेजें।SPDB2 को अनुकूलित करने के लिए, रिसीवर लाभ को एक में सेट करें और पल्स प्रोग्राम फ़ाइल खोलने के लिए ईडीसी पुल दर्ज करें। लाइन 179 पर, सेमी-कोलन पूर्ववर्ती गोटो 999 को हटा दें, और फ़ाइल को सहेजें। जीएस कमांड का उपयोग करके, एफिड सिग्नल की तीव्रता को कम करने के लिए एसपीडीबी 2 मापदंडों को समायोजित करें।जब सिग्नल की तीव्रता को संशोधित किया गया है, तो पल्स प्रोग्राम फ़ाइल के लाइन 179 पर अर्ध-कोलन को फिर से पेश करें और फ़ाइल को सहेजें। PLDB2 को अनुकूलित करने के लिए, रिसीवर लाभ को एक में सेट करें और पल्स प्रोग्राम फ़ाइल खोलने के लिए ईडीसी पुल दर्ज करें। लाइन 184 पर, सेमी-कोलन पूर्ववर्ती गोटो 999 को हटा दें, और फ़ाइल को सहेजें।जीएस कमांड का उपयोग करके, एफिड सिग्नल की तीव्रता को कम करने के लिए पीएलएडबी2 मापदंडों को समायोजित करें। जब सिग्नल की तीव्रता को संशोधित किया गया है, तो पल्स प्रोग्राम फ़ाइल के लाइन 184 पर अर्ध-कोलन को फिर से पेश करें और फ़ाइल को सहेजें। रिसीवर लाभ को अनुकूलित करने के लिए आरजीए कमांड चलाएं।इसके बाद प्रयोग शुरू करने के लिए जेडजी कमांड चलाएं। इस आंकड़े में, हाइड्रोजन नाइट्रोजन 15 ट्रॉसी स्पेक्ट्रम में प्रत्येक चोटी के लिए अधिग्रहीत छूट फैलाव प्रोफाइल के परिणाम देखे जा सकते हैं। अधिग्रहीत विश्राम फैलाव प्रोफाइल से, प्रत्येक रीढ़ अमी समूह के नाइट्रोजन 15 ट्रांसवर्स छूट में विनिमय योगदान का अनुमान लगाना संभव है।जांच के तहत प्रोटीन की 3 डी संरचना पर ट्रांसवर्स छूट की साजिश रचकर माइक्रोसेकंड मिलीसेकंड टाइमस्केल पर पुष्टित्मक विनिमय के दौर से गुजर रहे संरचनात्मक क्षेत्रों की पहचान करना संभव है। कार्वर-रिचर्ड्स समीकरणों का उपयोग करके छूट फैलाव घटता का मॉडलिंग विनिमय प्रक्रिया पर थर्मोडायनामिक और गतिज मापदंडों को देता है, जैसे संतुलन में राज्यों की आंशिक आबादी और इन राज्यों के बीच विनिमय की दर। इन थर्मोडायनामिक और गतिज मापदंडों की तापमान निर्भरता को क्रमशः वैन टी हॉफ और आई-रिंग समीकरणों का उपयोग करके मॉडलिंग किया जा सकता है, ताकि पुष्टित्मक विनिमय के एनर्जेटिक्स के बारे में विस्तृत जानकारी प्राप्त की जा सके।विशेष रूप से P7 में सभी अधिग्रहण मापदंडों को सावधानीपूर्वक अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है। नकली फैलाव से बचने के लिए अत्यधिक शुद्ध और समरूप नमूनों का उत्पादन करना भी महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त गतिज, थर्मोडायनामिक और रासायनिक चिप मापदंडों का उपयोग पुष्टित्मक विनिमय से गुजरने वाली प्रजातियों के बारे में ऊर्जावान और संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। सीपीएमजी विधियों द्वारा प्राप्त प्रोटीन पुष्टित्मक गतिशीलता का लक्षण वर्णन सिग्नलिंग और एंजाइमेटिक गतिविधि को समझने के साथ-साथ दवा डिजाइन के लिए नए दृष्टिकोण की दिशा में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

पाड़ Liposomes का उपयोग लिपिड-समीपस्थ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पुनर्गठित करने<em&gt; इन विट्रो</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

प्रोटीन संरचना और गतिशीलता के अध्ययन के लिए समय का समाधान electrospray ionization हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis एलिगेंस में उच्च प्रवाह रासायनिक स्क्रीनिंग के लिए एक सरल तरीका

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर Hsp33 पर Hsp33's Redox-विनियमित निगरानी गतिविधि और मानचित्रण गठन परिवर्तन परिभाषित करना

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

अपव्यय Microgravimetry फॉस्फोलिपिड बाइंडिंग प्रोटीन की बाइंडिंग गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए Annexin A2 करने के लिए ठोस-समर्थित लिपिड Bilayers एक क्वार्ट्ज प्रतिध्वनि का उपयोग

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

एक मिलीसेकंड समय स्केल पर प्रोटीन परिसरों की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए विट्रो प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण में उपयोग करना

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

प्रोसिटोम एकल अणु स्तर पर लेबलिंग एकरूपता का व्यापक परिमाणन

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

कल्पना सतह टी-सेल रिसेप्टर गतिशीलता चार आयामी जाली लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

ऑक्सीडेटिव तनाव के दौरान फाइब्रोनेक्टिन पर सेलुलर आडंशन की गतिशीलता और एपिथेलियल कोशिकाओं के प्रसार की जांच करना

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

नमूना तैयारी के व्यावहारिक पहलू और आरएनए के 1एच आर 1 ο विश्राम प्रसार प्रयोगों के सेटअप

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...