Name: 15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale
Uploaded: 2021-04-19T15:00:00
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この作品は、NIGMS R35GM133488からの資金とロイJ.カーバー慈善信託からV.V.への資金によって支えられました。

1. NMRサンプルの調製
<ol><li>目的のタンパク質の2H、15 N-labledサンプルを精製して精製します。 注: 15個の N 標識タンパク質サンプルを使用して CPMG RD 実験を取得できますが、可能な場合は測定によって得られたデータの品質が大幅に向上します。透過性タンパク質の製造のためのプロトコルは、文献13で入手可能です。</li>
	<li>精製したタンパク質?...

<ol>
	<li>Anthis, N. J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy.">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).</li><li>Lisi, G. P., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+NMR+spectroscopy+for+the+study+of+enzyme+allostery.">Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery.</a> Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).</li><li>Mittermaier, A., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+provide+new+insights+in+NMR+studies+of+protein+dynamics.">New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics.</a> Science. 312 (5771), 224-228 (2006).</li><li>Venditti, V., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+selection+and+substrate+binding+regulate+the+monomer/dimer+equilibrium+of+the+C-terminal+domain+of+Escherichia+coli+enzyme+I.">Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).</li><li>Venditti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+interdomain+rearrangement+triggered+by+suppression+of+micro-+to+millisecond+dynamics+in+bacterial+Enzyme+I.">Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I.</a> Nature Communications. 6, 5960 (2015).</li><li>Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+cycle+scheme+that+significantly+suppresses+offset-dependent+artifacts+in+the+R2-CPMG+15N+relaxation+experiment.">A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment.</a> Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).</li><li>Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+slow+(micros-ms)+time+scale+dynamics+in+protein+side+chains+by+(15)N+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy:+application+to+Asn+and+Gln+residues+in+a+cavity+mutant+of+T4+lysozyme.">Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TROSY+CPMG+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+in+large+proteins.">A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).</li><li>Dotas, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+thermophilic/mesophilic+enzymes+reveal+a+role+for+conformational+disorder+in+regulation+of+bacterial+Enzyme+I.">Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).</li><li>Purslow, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+site+breathing+of+human+Alkbh5+revealed+by+solution+NMR+and+accelerated+molecular+dynamics.">Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics.</a> Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+relaxation-compensated+Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+by+NMR+Spectroscopy.">A relaxation-compensated Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).</li><li>Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+15N+relaxation+dispersion+experiment+for+the+measurement+of+millisecond+time-scale+dynamics+in+proteins.">An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins.</a> Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).</li><li>Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope+labeling+strategies+for+the+study+of+high-molecular-weight+proteins+by+solution+NMR+spectroscopy.">Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).</li><li>Niklasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+NMR+data+using+advanced+line+shape+fitting.">Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).</li><li>Palmer, A. G., Kroenke, C. D., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+methods+for+quantifying+microsecond-to-millisecond+motions+in+biological+macromolecules.">Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules.</a> Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).</li><li>Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+dynamics+in+folded+and+unfolded+states+of+an+SH3+domain.">Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).</li><li>Carver, J. P., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+two-site+solution+for+the+chemical+exchange+produced+dependence+of+T2+upon+the+Carr-Purcell+pulse+separation.">A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).</li><li>Egner, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Contrast'+NMR+Reveals+Non-innocent+Role+of+Support+in+Pd/CeO2+Catalyzed+Phenol+Hydrogenation.">Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation.</a> ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).</li><li>Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Insight+into+Nanoparticle+Surface+Adsorption+by+Solution+NMR+Spectroscopy+in+an+Aqueous+Gel.">Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).</li><li>Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+energetics+of+a+three-state+protein+folding+system+probed+by+high-pressure+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy.">The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).</li><li>Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+slow+dynamics+in+high+molecular+weight+proteins+by+methyl-TROSY+NMR+spectroscopy:+application+to+a+723-residue+enzyme.">Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).</li><li>Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+backbone+(13)CO+and+(15)N+relaxation+dispersion+at+high+resolution.">Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).</li><li>Pritchard, R. B., Hansen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+side+chains+in+large+proteins+by+protonless+(13)C-detected+NMR+spectroscopy.">Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy.</a> Nature Communications. 10, 1747 (2019).</li></ol>

本稿では、タンパク質に関する15N RDデータの取得および分析のために研究室で実施されるプロトコルについて説明します。特に、NMRサンプルの調製、NMRデータの測定、およびRDプロファイルの分析のための重要なステップがカバーされています。RD実験の取得と解析に関する重要な側面について以下に説明します。しかし、実験とデータ分析の詳細な説明のために、元の文献の慎重な?...

カーパーセルメイブーム-ギル(CPMG)の緩和分散体(RD)実験は、溶液NMR分光法1、2、3、4、5によってμs-msタイムスケールで発生する立体構造平衡を特徴付けるためにルーチンベースで使用される。コンフォメーションダイナミクスの他の方法と比較して、CPMG技術は、現代のNMR分光計で比較的容易に実装でき、特殊なサンプル調製ステップ(すなわち、結晶化、サンプル凍結または位置合わせ、および/または蛍光または常磁性タグを有する共有結合結合)を必要とせず、構造、運動、熱力学の構造、運動、熱力学の情報を返す共統構造の包括的な特性を提供する。CPMG実験が立体構造平衡を報告するためには、(i)観測されたNMRスピンが、立体構造交換を行っている状態(微小状態)と(ii)の間に50μsから~10msの範囲の時間スケールで起こらなければならないという2つの条件が適用されなければならない。これらの条件下では、観察された横方向緩和率 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq01v2.jpg"> ()は、組み込みR2(μs-msダイナミクスの無しで測定したR2) <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq02v3.jpg"> と、横弛緩(Rex)への交換寄与の和である。R2obsへのRex寄与は、パルス系列のCPMGブロックを構成する180°パルス間の間隔を減少させることによって徐々に消光することができ、そして得られたRD曲線は、ブロッホ・マッコネル理論を用いて、微小状態間の化学シフト差、各微小状態の小数体の母集団、およびマイクロステート間の交換率を得ることができる( 図1,2.
15N CPMG実験の文献では、いくつかの異なるパルスシーケンスおよび分析プロトコルが報告されている。本明細書において、実験室で実施されるプロトコルについて説明する。特に、NMRサンプルの調製、NMR実験の設定と取得、およびNMRデータの処理と分析のための重要なステップが導入される(図2)。プロトコルを他の研究所に転送しやすくするために、パルスプログラム、処理および解析スクリプト、およびデータセットの例が補足ファイルとして提供され、(https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html)からダウンロードできます。提供されたパルスシーケンスは、オフセット依存性アーチファクト6の抑制のためにCPMGブロックに4段階のフェーズサイクルを組み込み、いくつかのインターリーブ実験を取得するためにコード化される。これらのインターリーブ実験は、同じ緩和期間を有するが、異なるCPMGフィールド7を達成するために、再焦点パルスの異なる数を有する。また、説明されたパルスプログラムがNMR信号8のTROSY成分の15 NR2を測定することに注意することも重要である。全体として、このプロトコルは、中型および大型タンパク質4、5、9、10における立体構造交換の特性評価に対して正常に適用されている。より小さいシステム(<20 kDa)の場合、ヘテロ核単一量子コヒーレンス(HSQC)ベースのパルスシーケンス11、12の使用が推奨される。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryoprobe</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe</td>
			<td>Improve sensitivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium Oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>756822-1</td>
			<td>&#62;99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand driven centrifuge</td>
			<td>United Scientific supply</td>
			<td>CENTFG1</td>
			<td>Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Field NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800</td>
			<td>acquisition of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td>
			<td>Modeling of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pasteur Pipette</td>
			<td>Corning Incorporation</td>
			<td>7095D-NMR</td>
			<td>Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tube</td>
			<td>Willmad Precision</td>
			<td>535-PP-7</td>
			<td>5mm thin wall 7&#39;&#39; cylinderical glass tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRPipe</td>
			<td>Institute of Biosciences and Biotechnology research</td>
			<td>https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html</td>
			<td>NMR data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPARKY</td>
			<td>University of California, San Francisco</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/</td>
			<td>Analysis of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tospin 3.2 (or newer)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html</td>
			<td>acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale

タンパク質立体構造ダイナミクスは、重要な生物学的プロセスである酵素触媒、リガンド結合、アロステリー、およびシグナル伝達の調節において基本的な役割を果たします。構造とダイナミクスのバランスが生物学的機能をどのように支配するかを理解することは、現代の構造生物学における新たなフロンティアであり、いくつかの技術的および方法論的発展に火をつけた。これらの中で、CPMG緩和分散液NMR法は、μs-msタイムスケールで発生するタンパク質の構造、運動学、熱力学に関するユニークな原子分解能情報を提供します。ここでは、15Nの緩和分散実験の取得および分析のための詳細なプロトコルを提示する。例として、細菌のC末端領域におけるμs-msダイナミクスの分析のためのパイプラインを示す酵素I。

ここで説明するプロトコルは、1H-15N TROSYスペクトルの各ピークのRDプロファイルを取得する結果となる(図3A)。取得したRDプロファイルから、各バックボーンアミド群の15N横方向緩和への交換寄与を推定することができる(図3A、3B)。調査中のタンパク質の3D構造にRexをプロットすることにより、μs-ms時間?...

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15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

ここでは、NMR分光法による溶液NMRの緩和分散プロファイルを 取得および分析するための実験室で実施されるプロトコルの詳細な説明が提供される。

15μs-ms タイムスケールにおけるタンパク質コンフォメーションダイナミクスの研究のためのN CPMG緩和分散

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

このプロトコルは、さまざまな細胞プロセスを理解するために不可欠なタンパク質立体構造ダイナミクスの検出と特性評価に使用できます。他の方法と比較して、この方法は特殊なサンプル調製ステップを必要とせず、キネティックス、熱力学、および確認平衡の構造的側面の包括的な特性を提供する。CPMG緩和分散は、核酸および他の生体分子における確認ダイナミクスの特性化や、リガンドナノ粒子相互作用の特性化のために、より広く適用することができる。当社のプロトコルは、初めてのCPMGユーザーを対象としています。だから、それは良い出発点です。しかし、従来のNMR実験を実行するための基本的な手順をユーザーに知っ求めています。初めて NMR 実験をセットアップするには、まずこれらの補助ファイルをダウンロードして解凍します。ビットをコピーします。vvとtrosy_15N_CPMG。パルスプログラムフォルダ内のvvファイルをパルスプログラムディレクトリに移動します。取得ソフトウェアを開き、EDC コマンドを使用して、以前に実行した水素窒素 15 HSQC 実験を新しい実験にコピーします。パルスプログラムコマンドを使用してtrosy_15N_CPMGをロードします。vvパルスプログラムファイルを新しく作成した実験に。次に、パルス プログラム ファイルの末尾の指示を使用して CPMG 実験をセットアップします。日常的なNMR実験を設定するには、サンプルを磁石に導入し、基本的なNMR取得手順をすべて実行します。P1を水素硬度90度パルスの持続時間に設定し、P7を持続時間窒素15硬度90度パルスに設定する。取得ウィンドウで、水素と窒素15の寸法の中心とスペクトル幅を設定します。緩和遅延を0.7 T2に設定し、VC listコマンドを使用してNに対応する整数のリストを作成します。L8 を VC リストのエントリ数に設定し、L3 を間接寸法の実数に設定し、1TD を L3 倍 2 倍に設定します。水の抑制を最適化するには、受信機ゲインを1に設定し、EDCプルと入力してパルスプログラムファイルを開きます。91 行目で、goto 999 の前にあるセミコロンを削除し、ファイルを保存します。GS コマンドを使用して、FID 信号の強度を最小限に抑えるために SPDB0 パラメーターを調整します。信号強度が変更されたら、パルスプログラムファイルの91行目にセミコロンを再導入し、ファイルを保存します。SPDB11 を最適化するには、受信機ゲインを 1 に設定し、タイプ EDC プルを設定してパルス・プログラム・ファイルを開きます。168 行目で、goto 999 の前にあるセミコロンを削除し、ファイルを保存します。GS コマンドを使用して、FID 信号の強度を最小限に抑えるために SPDB11 パラメータを調整します。信号強度が変更されたら、168行目にセミコロンを再導入し、ファイルを保存します。SPDB2 を最適化するには、受信機ゲインを 1 に設定し、EDC プルと入力してパルス・プログラム・ファイルを開きます。179 行目で、goto 999 の前にあるセミコロンを削除し、ファイルを保存します。GS コマンドを使用して、FID 信号の強度を最小限に抑えるために SPDB2 パラメーターを調整します。信号強度が変更されたら、パルスプログラムファイルの行179でセミコロンを再導入し、ファイルを保存します。PLDB2を最適化するには、受信機ゲインを1に設定し、EDCプルを入力してパルス・プログラム・ファイルを開きます。184 行目で、goto 999 の前にあるセミコロンを削除し、ファイルを保存します。GS コマンドを使用して、PLDB2 パラメーターを調整して、FID 信号の強度を最小化します。信号強度が変更されたら、パルスプログラムファイルの行184でセミコロンを再導入し、ファイルを保存します。RGA コマンドを実行して、レシーバゲインを最適化します。次に、ZG コマンドを実行して実験を開始します。この図では、水素窒素15トロシースペクトルにおけるピーク毎に取得した緩和分散プロファイルの結果が観察できる。取得した緩和分散プロファイルから、各骨格AMI基の窒素15横方向緩和への交換寄与を推定することができる。調査中のタンパク質の3D構造に横方向の緩和をプロットすることにより、マイクロ秒ミリ秒のタイムスケールで確認交換を行っている構造領域を同定することが可能です。カーバー・リチャーズ方程式を使用した緩和分散曲線のモデリングは、平衡状態の州の小数母集団やこれらの状態間の交換速度など、交換プロセスにおける熱力学的および運動的パラメータを返します。これらの熱力学および運動パラメータの温度依存性は、van't Hoff方程式とIリング方程式をそれぞれ使用してモデル化し、確認交換のエネルギーに関する詳細な情報を得ることができます。すべての取得パラメータ、特にP7を慎重に最適化することが重要です。また、スプリアス分散を避けるために、非常に純粋で均質なサンプルを生成することも重要です。このプロトコルを使用して得られた運動、熱力学、および化学チップパラメータは、確認交換を受けている種に関するエネルギー的かつ構造的な情報を導出するために使用することができる。CPMG法によって得られるタンパク質確認ダイナミクスの特性評価は、シグナル伝達および酵素活性の理解に向けた重要な情報と、薬物設計のための新しい視点を提供する。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Hsp33 の酸化還元規制シャペロン活性を定義および水素重水素交換質量分析法による Hsp33 の構造変化をマッピング

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

散逸の Microgravimetry 結合タンパク質アネキシン A2 への水晶振動子を用いた固相担脂質膜リン脂質の結合動態を研究するには

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

ミリ秒時間スケールでのタンパク質複合体のダイナミクスを調べるため体外蛍光共鳴エネルギー移動の使用

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

格子光シート顕微鏡による表面T細胞受容体ダイナミクスの可視化4次元的な研究

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

酸化ストレス中のフィブロネクチン上皮細胞の細胞接着と広がりのダイナミクスを調べる

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

RNAの1H R1ρ緩和分散実験のサンプル調製とセットアップの実態

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...