Name: 15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale
Uploaded: 2021-04-19T15:00:00
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이 작품은 NIGMS R35GM133488의 자금과 로이 J. 카버 자선 신탁에서 V.V.V.에 이르기까지 자금으로 지원되었습니다.

1. NMR 샘플 의 준비
<ol><li>관심 있는 단백질의 2H,15N-labled 샘플을 표현하고 정화합니다. 참고: 15개의N 라벨 단백질 샘플이 CPMG RD 실험의 획득에 사용될 수 있지만, 감단(가능한 경우)은 얻어진 데이터의 품질을 극적으로 증가시킵니다. 정해성 단백질의 생산을 위한 프로토콜은문헌(13)에서유효하다.</li>
	<li>완충제는 정제된 단백질 샘플을 탈가스 NMR 버퍼...

<ol>
	<li>Anthis, N. J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy.">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).</li><li>Lisi, G. P., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+NMR+spectroscopy+for+the+study+of+enzyme+allostery.">Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery.</a> Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).</li><li>Mittermaier, A., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+provide+new+insights+in+NMR+studies+of+protein+dynamics.">New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics.</a> Science. 312 (5771), 224-228 (2006).</li><li>Venditti, V., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+selection+and+substrate+binding+regulate+the+monomer/dimer+equilibrium+of+the+C-terminal+domain+of+Escherichia+coli+enzyme+I.">Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).</li><li>Venditti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+interdomain+rearrangement+triggered+by+suppression+of+micro-+to+millisecond+dynamics+in+bacterial+Enzyme+I.">Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I.</a> Nature Communications. 6, 5960 (2015).</li><li>Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+cycle+scheme+that+significantly+suppresses+offset-dependent+artifacts+in+the+R2-CPMG+15N+relaxation+experiment.">A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment.</a> Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).</li><li>Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+slow+(micros-ms)+time+scale+dynamics+in+protein+side+chains+by+(15)N+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy:+application+to+Asn+and+Gln+residues+in+a+cavity+mutant+of+T4+lysozyme.">Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TROSY+CPMG+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+in+large+proteins.">A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).</li><li>Dotas, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+thermophilic/mesophilic+enzymes+reveal+a+role+for+conformational+disorder+in+regulation+of+bacterial+Enzyme+I.">Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).</li><li>Purslow, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+site+breathing+of+human+Alkbh5+revealed+by+solution+NMR+and+accelerated+molecular+dynamics.">Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics.</a> Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+relaxation-compensated+Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+by+NMR+Spectroscopy.">A relaxation-compensated Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).</li><li>Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+15N+relaxation+dispersion+experiment+for+the+measurement+of+millisecond+time-scale+dynamics+in+proteins.">An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins.</a> Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).</li><li>Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope+labeling+strategies+for+the+study+of+high-molecular-weight+proteins+by+solution+NMR+spectroscopy.">Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).</li><li>Niklasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+NMR+data+using+advanced+line+shape+fitting.">Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).</li><li>Palmer, A. G., Kroenke, C. D., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+methods+for+quantifying+microsecond-to-millisecond+motions+in+biological+macromolecules.">Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules.</a> Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).</li><li>Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+dynamics+in+folded+and+unfolded+states+of+an+SH3+domain.">Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).</li><li>Carver, J. P., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+two-site+solution+for+the+chemical+exchange+produced+dependence+of+T2+upon+the+Carr-Purcell+pulse+separation.">A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).</li><li>Egner, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Contrast'+NMR+Reveals+Non-innocent+Role+of+Support+in+Pd/CeO2+Catalyzed+Phenol+Hydrogenation.">Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation.</a> ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).</li><li>Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Insight+into+Nanoparticle+Surface+Adsorption+by+Solution+NMR+Spectroscopy+in+an+Aqueous+Gel.">Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).</li><li>Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+energetics+of+a+three-state+protein+folding+system+probed+by+high-pressure+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy.">The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).</li><li>Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+slow+dynamics+in+high+molecular+weight+proteins+by+methyl-TROSY+NMR+spectroscopy:+application+to+a+723-residue+enzyme.">Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).</li><li>Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+backbone+(13)CO+and+(15)N+relaxation+dispersion+at+high+resolution.">Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).</li><li>Pritchard, R. B., Hansen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+side+chains+in+large+proteins+by+protonless+(13)C-detected+NMR+spectroscopy.">Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy.</a> Nature Communications. 10, 1747 (2019).</li></ol>

이 원고는 단백질에 대한 15NRD 데이터를 수집 및 분석을 위해 실험실에서 구현된 프로토콜을 설명합니다. 특히 NMR 샘플 의 준비, NMR 데이터 측정 및 RD 프로파일 분석을 위한 중요한 단계가 다룹니다. Rd 실험의 인수 및 분석에 관한 몇 가지 중요한 측면에 대해 논의됩니다. 그러나, 실험 및 데이터 분석에 대한 보다 심층적인 설명을 위해, 본문문헌을 주의 깊게 공부하는 것이</s...

Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) 이완 분산 (RD) 실험은 용액 NMR분광법 1,2,3,4,5에의해 μs-ms 시간 척도에서 발생하는 형태 평형을 특성화하기 위해 일상적인 베이스에 사용된다. 균역학을 조사하는 다른 방법에 비해 CPMG 기술은 현대 NMR 분광계에서 비교적 구현하기 쉽고, 특수 시료 준비 단계(즉, 결정화, 샘플 동결 또는 정렬 및/또는 형광 또는 파라마그네틱 태그와 함께 동월 결합)을 필요로 하지 않으며, 구조적, 역학적 재형성, 역학적 재형성, 역학적 재해석, 동역학적 재보행의 포괄적인 특성화를 제공한다. CPMG 실험이 형태 평형에 대해 보고하기 위해서는, 두 가지 조건이 적용되어야 한다: (i) 관찰된 NMR 스핀은 형태 교환(microstates)을 겪고 있는 상태에서 다른 화학적 변화를 가져야 하며 (ii) 교환은 ~50 μs에서 ~10ms에 이르는 시간 척도로 이루어져야 한다. 이러한 조건하에서, 관찰된 횡방향 이완속도()는 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq01v2.jpg"> 본질R2(μs-ms 역학의 부재하에서 측정된R2)의 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq02v3.jpg"> 합이며, 횡방향 이완(Rex)에대한 교환 기여도이다. R2obs에 대한 R전 기여도는 펄스 서열의 CPMG 블록을 구성하는 180° 펄스 사이의 간격을 감소시킴으로써 점진적으로 담금질될 수 있으며, 그 결과 RD 곡선은 블로흐-맥코넬 이론을 이용하여 마이크로스테이트 간의 화학적 변화 차이, 각 마이크로스테이트의 분수 인구, 및 소행성 간 교환속도(도1)중 의 화학적 변화 차이를 얻을 수있다.
15NCPMG 실험에 대한 문헌에서 여러 가지 상이한 펄스 서열 및 분석 프로토콜이 보고되었다. 본원에서, 실험실에서 구현된 프로토콜은 기술된다. 특히 NMR 샘플의 제조, NMR 실험의 설정 및 획득, NMR 데이터의 처리 및 분석을 위한 중요한 단계가 도입될것이다(그림 2). 프로토콜을 다른 실험실로 쉽게 전송하기 위해 펄스 프로그램, 처리 및 분석 스크립트 및 하나의 예제 데이터 집합은 보충 파일로 제공되며(https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html)에서 다운로드할 수 있습니다. 제공된 펄스 서열은 오프셋 종속 아티팩트6의 억제를 위해 CPMG 블록에 4단계 위상 주기를 통합하고 여러 인터리브 된 실험을 수집하기 위해 코딩됩니다. 이러한 인터리브 된 실험은 동일한 휴식 기간을 가지고 있지만 다른 CPMG 필드7을달성하기 위해 펄스를 다시 초점을 맞추는 다른 수. 또한 기술된 펄스 프로그램이 NMR 신호8의TROSY 성분의 15N R2를 측정한다는 것을 통지하는 것도 중요하다. 전반적으로, 프로토콜은 중형 및 대형단백질4,5,9,10에서형성 교류의 특성화를 성공적으로 적용하였다. 소형 시스템(<20 kDa)의 경우, 이종핵 단일 양자 일관성(HSQC)-기반 펄스 서열11,12의 사용은 바람직하다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryoprobe</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe</td>
			<td>Improve sensitivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium Oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>756822-1</td>
			<td>&#62;99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand driven centrifuge</td>
			<td>United Scientific supply</td>
			<td>CENTFG1</td>
			<td>Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Field NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800</td>
			<td>acquisition of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td>
			<td>Modeling of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pasteur Pipette</td>
			<td>Corning Incorporation</td>
			<td>7095D-NMR</td>
			<td>Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tube</td>
			<td>Willmad Precision</td>
			<td>535-PP-7</td>
			<td>5mm thin wall 7&#39;&#39; cylinderical glass tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRPipe</td>
			<td>Institute of Biosciences and Biotechnology research</td>
			<td>https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html</td>
			<td>NMR data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPARKY</td>
			<td>University of California, San Francisco</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/</td>
			<td>Analysis of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tospin 3.2 (or newer)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html</td>
			<td>acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale

단백질 형성 역학은 중요한 생물학적 과정인 효소 촉매, 리간드 결합, 알로스터리 및 시그널링의 조절에 근본적인 역할을 합니다. 구조와 역학 사이의 균형이 생물학적 기능을 어떻게 지배하는지 이해하는 것은 현대 구조 생물학의 새로운 개척지이며 몇 가지 기술적 및 방법론적 발전에 불을 붙였습니다. 이들 중, CPMG 이완 분산 용NMR 방법은 μs-ms 타임스케일에서 발생하는 단백질 형태 평형의 구조, 운동학 및 열역학에 대한 고유하고 원자분해능적인 정보를 제공한다. 여기서, 연구 결과는 15N 이완 분산 실험의 취득 그리고 분석을 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 예를 들어, 박테리아 효소의 C-말단 도메인에서 μs-ms 역학의 분석을 위한 파이프라인이 나타난다.

여기서 설명된 프로토콜은 1H-15N TROSY스펙트럼(그림 3A)에서각 피크에 대한 RD 프로파일을 획득하는 결과를 낳는다. 인수된 RD 프로파일로부터, 각 백본 아마이드 그룹의 15N횡방향 이완에 대한 교환 기여도를 추정할 수있다(도 3A,3B). 조사 중인 단백질의 3D 구조에 Rex를 플로팅함으로써, μs-ms 시간<strong class="xfig...

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15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

여기서, 솔루션 NMR 분광법에 의한 15N이완 분산 프로파일의 수집 및 분석을 위해 실험실에서 구현된 프로토콜에 대한 자세한 설명이 제공된다.

15 Μs-ms 타임스케일에 단백질 형성 역학의 조사를 위한 N CPMG 이완 분산

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

이 프로토콜은 다양한 세포 과정을 이해하는 데 필수적인 단백질 형성 역학의 검출 및 특성화에 사용할 수 있습니다. 다른 방법에 비해, 이 방법은 특수 한 샘플 준비 단계를 필요로 하지 않으며 운동, 열역학 및 확인 평형의 구조적 측면의 포괄적인 특성화를 제공합니다. CPMG 이완 분산은 핵산 및 기타 생체 분자의 확인 역학의 특성화뿐만 아니라 리간드 나노 입자 상호 작용의 특성화를 위해 더 널리 적용될 수 있다.우리의 프로토콜은 처음 CPMG 사용자를 대상으로합니다. 그래서 좋은 출발점입니다. 그러나 사용자는 기존의 NMR 실험을 실행하기 위한 기본 단계를 알고 있기를 기대합니다.NMR 실험을 처음으로 설정하려면 먼저 이러한 보충 파일을 다운로드하고 압축 해제합니다. 비트를 복사합니다. vv 와 trosy_15N_CPMG.펄스 프로그램 폴더의 vv 파일이 펄스 프로그램 디렉토리에 연결됩니다. 획득 소프트웨어를 열고 EDC 명령을 사용하여 이전에 실행된 수소 질소 15 HSQC 실험을 새로운 실험으로 복사합니다. 펄스 프로그램 명령을 사용하여 trosy_15N_CPMG 로드합니다.vv 펄스 프로그램 파일을 새로 만든 실험에 넣습니다. 그런 다음 펄스 프로그램 파일의 끝에서 지침을 사용하여 CPMG 실험을 설정합니다. 일상적인 NMR 실험을 설정하려면 샘플을 자석에 소개하고 모든 기본 NMR 획득 단계를 수행합니다.지속 기간 질소 15 하드 90도 펄스에 수소 하드 90도 펄스 및 P7의 지속 시간으로 P1을 설정합니다. 획득 창에서 수소 및 질소 15 치수에 대한 중심 및 스펙트럼 폭을 설정합니다. 이완 지연을 0.7 T2로 설정하고 VC 목록 명령을 사용하여 N.에 해당하는 정수 번호 목록을 만든 후 목록의 각 항목이 D30으로 나눈 CPMG에 따라 다른 CPMG 필드에 해당하는지 확인한 후 목록의 첫 번째 번호가 0이 아닌지 확인합니다.L8을 VC 목록의 항목 수로 설정하고, L3을 간접 차원의 실제 포인트 수로, 1TD에서 L8배 L3배 2회로 설정합니다. 물 억제를 최적화하려면 수신기 게인을 하나로 설정하고 EDC 끌어오기를 입력하여 펄스 프로그램 파일을 엽니다. 91번 줄에서 goto 999 앞에 있는 세미 콜론을 제거하고 파일을 저장합니다.GS 명령을 사용하여 SPDB0 매개변수를 조정하여 FID 신호의 강도를 최소화합니다. 신호 강도가 수정되면 펄스 프로그램 파일의 91줄에서 세미 콜론을 다시 도입하고 파일을 저장합니다. SPDB11을 최적화하려면 수신기 게인을 하나로 설정하고 EDC 유형은 펄스 프로그램 파일을 엽니다.168호선에서는 goto 999 앞에 있는 반결을 제거하고 파일을 저장합니다. GS 명령을 사용하여 SPDB11 매개 변수를 조정하여 FID 신호의 강도를 최소화합니다. 신호 강도가 수정되면 168줄에서 반결을 다시 도입하고 파일을 저장합니다.SPDB2를 최적화하려면 수신기 게인을 하나로 설정하고 EDC 끌어오기를 입력하여 펄스 프로그램 파일을 엽니다. 179호선에서는 goto 999 앞에 있는 반결을 제거하고 파일을 저장합니다. GS 명령을 사용하여 SPDB2 매개변수를 조정하여 FID 신호의 강도를 최소화합니다.신호 강도가 수정되면 펄스 프로그램 파일의 179줄에서 세미 콜론을 다시 소개하고 파일을 저장합니다. PLDB2를 최적화하려면 수신기 게인을 하나로 설정하고 EDC 끌어서 펄스 프로그램 파일을 엽니다. 184호선에서는 goto 999 앞에 있는 반결을 제거하고 파일을 저장합니다.GS 명령을 사용하여 PLDB2 매개 변수를 조정하여 FID 신호의 강도를 최소화합니다. 신호 강도가 수정되면 펄스 프로그램 파일의 184줄에서 세미 콜론을 다시 도입하고 파일을 저장합니다. RGA 명령을 실행하여 수신기 게인을 최적화합니다.그런 다음 ZG 명령을 실행하여 실험을 시작합니다. 이 그림에서, 수소 질소(15 Trosy 스펙트럼)에서 각 피크에 대해 획득된 이완 분산 프로파일의 결과를 관찰할 수 있다. 획득된 이완 분산 프로파일에서 각 중추 AMI 그룹의 질소 15 횡방향 이완에 대한 교환 기여도를 추정할 수 있다.조사 중인 단백질의 3D 구조에 대한 횡방향 이완을 플로팅함으로써 마이크로초 밀리초 시간 척도에서 확인 교환을 받는 구조 영역을 식별할 수 있다. 카버-리차드 방정식을 사용하여 이완 분산 곡선을 모델링하면 평형에서 국가의 분수 인구 및 이들 주 간의 교환 속도와 같은 교환 프로세스의 열역학 및 운동 파라미터를 반환합니다. 이러한 열역학 및 운동 파라미터의 온도 의존성은 각각 van't Hoff 및 I-링 방정식을 사용하여 모델링하여 확인 교환의 에너지에 대한 자세한 정보를 얻을 수 있습니다.모든 인수 파라미터, 특히 P7을 신중하게 최적화하는 것이 중요합니다. 또한 스퓨리어스 분산을 피하기 위해 매우 순수하고 균일한 샘플을 생산하는 것도 중요합니다. 이 프로토콜을 사용하여 얻은 운동, 열역학 및 화학 칩 파라미터는 확인 교환을 겪고 있는 종에 대한 에너지 및 구조적 정보를 도출하는 데 사용될 수 있다. CPMG 방법에 의해 얻어진 단백질 확인 역학의 특성화는 시그널링 및 효소 활성을 이해하는 데 중요한 정보뿐만 아니라 약물 설계에 대한 새로운 관점을 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

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A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

꼬마 선 충 에서 높은 처리량 화학 심사 하는 간단한 방법

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Hsp33의 Redox 규제 보호자 활동을 정의 하 고 수소 중수소 교환 질량 분석을 사용 하 여 Hsp33에 구조적 변화를 매핑

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

체 외 형광 공명 에너지 전달에 밀리초 시간 규모에서 단백질 복합물의 역학을 공부 하는 사용 하 여

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

격자 광 시트 현미경을 사용하여 표면 T 세포 수용체 역학 4 차원 시각화

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

세포 부착의 역학 을 검사 하 고 산화 스트레스 동안 Fibronectin에 상피 세포의 확산

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

RNA의 1 H R 1θ 이완 분산 실험의 샘플 준비 및 설치의 실제적인 양상

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...