Name: 15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale
Uploaded: 2021-04-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ã‚Âµs-ms Timescale at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av midler fra NIGMS R35GM133488 og fra Roy J. Carver Charitable Trust til V.V.

1. Klargjøring av NMR-prøven
<ol><li>Uttrykk og rens en 2H,15N-labled prøve av proteinet av interesse. MERK: Mens en 15N-merket proteinprøve kan brukes til anskaffelse av CPMG RD-eksperimentet, øker perdeuteration (der det er mulig) dramatisk kvaliteten på de oppnådde dataene. Protokoller for produksjon av perdeutererte proteiner er tilgjengelige i litteraturen13.</li>
	<li>Bufferen utveksler den rensede proteinprøven til en avgasset NMR-buffer.</li>
	...

<ol>
	<li>Anthis, N. J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy.">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).</li><li>Lisi, G. P., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+NMR+spectroscopy+for+the+study+of+enzyme+allostery.">Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery.</a> Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).</li><li>Mittermaier, A., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+provide+new+insights+in+NMR+studies+of+protein+dynamics.">New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics.</a> Science. 312 (5771), 224-228 (2006).</li><li>Venditti, V., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+selection+and+substrate+binding+regulate+the+monomer/dimer+equilibrium+of+the+C-terminal+domain+of+Escherichia+coli+enzyme+I.">Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).</li><li>Venditti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+interdomain+rearrangement+triggered+by+suppression+of+micro-+to+millisecond+dynamics+in+bacterial+Enzyme+I.">Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I.</a> Nature Communications. 6, 5960 (2015).</li><li>Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+cycle+scheme+that+significantly+suppresses+offset-dependent+artifacts+in+the+R2-CPMG+15N+relaxation+experiment.">A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment.</a> Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).</li><li>Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+slow+(micros-ms)+time+scale+dynamics+in+protein+side+chains+by+(15)N+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy:+application+to+Asn+and+Gln+residues+in+a+cavity+mutant+of+T4+lysozyme.">Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TROSY+CPMG+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+in+large+proteins.">A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).</li><li>Dotas, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+thermophilic/mesophilic+enzymes+reveal+a+role+for+conformational+disorder+in+regulation+of+bacterial+Enzyme+I.">Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).</li><li>Purslow, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+site+breathing+of+human+Alkbh5+revealed+by+solution+NMR+and+accelerated+molecular+dynamics.">Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics.</a> Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+relaxation-compensated+Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+by+NMR+Spectroscopy.">A relaxation-compensated Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).</li><li>Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+15N+relaxation+dispersion+experiment+for+the+measurement+of+millisecond+time-scale+dynamics+in+proteins.">An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins.</a> Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).</li><li>Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope+labeling+strategies+for+the+study+of+high-molecular-weight+proteins+by+solution+NMR+spectroscopy.">Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).</li><li>Niklasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+NMR+data+using+advanced+line+shape+fitting.">Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).</li><li>Palmer, A. G., Kroenke, C. D., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+methods+for+quantifying+microsecond-to-millisecond+motions+in+biological+macromolecules.">Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules.</a> Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).</li><li>Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+dynamics+in+folded+and+unfolded+states+of+an+SH3+domain.">Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).</li><li>Carver, J. P., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+two-site+solution+for+the+chemical+exchange+produced+dependence+of+T2+upon+the+Carr-Purcell+pulse+separation.">A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).</li><li>Egner, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Contrast'+NMR+Reveals+Non-innocent+Role+of+Support+in+Pd/CeO2+Catalyzed+Phenol+Hydrogenation.">Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation.</a> ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).</li><li>Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Insight+into+Nanoparticle+Surface+Adsorption+by+Solution+NMR+Spectroscopy+in+an+Aqueous+Gel.">Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).</li><li>Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+energetics+of+a+three-state+protein+folding+system+probed+by+high-pressure+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy.">The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).</li><li>Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+slow+dynamics+in+high+molecular+weight+proteins+by+methyl-TROSY+NMR+spectroscopy:+application+to+a+723-residue+enzyme.">Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).</li><li>Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+backbone+(13)CO+and+(15)N+relaxation+dispersion+at+high+resolution.">Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).</li><li>Pritchard, R. B., Hansen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+side+chains+in+large+proteins+by+protonless+(13)C-detected+NMR+spectroscopy.">Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy.</a> Nature Communications. 10, 1747 (2019).</li></ol>

Dette manuskriptet beskriver protokollen implementert i laboratoriet for innsamling og analyse av 15N RD-data om proteiner. Spesielt dekkes de avgjørende trinnene for utarbeidelse av NMR-prøven, måling av NMR-dataene og analyse av RD-profilene. Nedenfor diskuteres noen viktige aspekter ved anskaffelse og analyse av RD-eksperimenter. For en mer detaljert beskrivelse av eksperimentet og dataanalysen anbefales imidlertid nøye studier av den opprinnelige litteraturen sterkt3,...

Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) avslapningsspredning (RD) eksperimenter brukes på en rutinemessig base for å karakterisere konformasjonslikevekter som forekommer på μs-ms-tidsskalaen ved løsning NMR spektroskopi1,2,3,4,5. Sammenlignet med andre metoder for undersøkelse av konformasjonsdynamikk, er CPMG-teknikker relativt enkle å implementere på moderne NMR-spektrometre, krever ikke spesialiserte prøveprepareringstrinn (dvs. krystallisering, prøvefrysing eller justering, og / eller kovalent konjugering med fluorescerende eller paramagnetisk tag), og gir en omfattende karakterisering av konformasjonslikevekt som returnerer strukturell, kinetisk og termodynamisk informasjon om utvekslingsprosesser. For at et CPMG-eksperiment skal kunne rapportere om en konformasjonslikevekt, må to betingelser gjelde: (i) de observerte NMR-spinnene må ha forskjellige kjemiske skift i tilstandene som gjennomgår konformasjonsutveksling (mikrostater) og (ii) utvekslingen må skje på en tidsskala fra ~ 50 μs til ~ 10 ms. Under disse forholdene er den observerte tverrgående avslapningsraten ( <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq01v2.jpg"> ) summen av den indre R2 (R2 målt i fravær av μs-ms dynamikk, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq02v3.jpg"> ) og utvekslingsbidraget til den tverrgående avslapningen (Rex). Rex-bidraget til R2obs kan gradvis slukkes ved å redusere avstanden mellom 180 ° pulser som utgjør CPMG-blokken i pulssekvensen, og de resulterende RD-kurvene kan modelleres ved hjelp av Bloch-McConnell-teorien for å oppnå den kjemiske skiftforskjellen mellom mikrostater, brøkdelspopulasjonen til hver mikrostat og valutakursene blant mikrotilstander (figur 1)1,2,3.
Flere ulike pulssekvenser og analyseprotokoller er rapportert i litteraturen for 15N CPMG-eksperimenter. Her er protokollen implementert i laboratoriet beskrevet. Spesielt vil de avgjørende trinnene for utarbeidelse av NMR-prøven, oppsett og anskaffelse av NMR-eksperimentene, og prosessering og analyse av NMR-dataene bli introdusert (figur 2). For å lette overføringen av protokollen til andre laboratorier, er pulsprogrammet, prosesserings- og analyseskriptene og ett eksempeldatasett gitt som tilleggsfiler og er tilgjengelige for nedlasting på (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). Den medfølgende pulssekvensen inneholder en firetrinns fasesyklus i CPMG-blokken for undertrykkelse av offsetavhengige artefakter6, og den er kodet for anskaffelse av flere sammenflettede eksperimenter. Disse sammenflettede eksperimentene har en identisk avslapningsperiode, men forskjellige antall refokuserende pulser for å oppnå forskjellige CPMG-felt7. Det er også viktig å legge merke til at det beskrevne pulsprogrammet måler 15N R2 av TROSY-komponenten i NMR-signalet8. Totalt sett er protokollen brukt for karakterisering av konformasjonsutveksling i mellomstore og store proteiner4,5,9,10. For mindre systemer (<20 kDa) anbefales det å bruke en Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC)-basert pulssekvens11,12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryoprobe</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe</td>
			<td>Improve sensitivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium Oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>756822-1</td>
			<td>&#62;99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand driven centrifuge</td>
			<td>United Scientific supply</td>
			<td>CENTFG1</td>
			<td>Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Field NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800</td>
			<td>acquisition of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td>
			<td>Modeling of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pasteur Pipette</td>
			<td>Corning Incorporation</td>
			<td>7095D-NMR</td>
			<td>Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tube</td>
			<td>Willmad Precision</td>
			<td>535-PP-7</td>
			<td>5mm thin wall 7&#39;&#39; cylinderical glass tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRPipe</td>
			<td>Institute of Biosciences and Biotechnology research</td>
			<td>https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html</td>
			<td>NMR data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPARKY</td>
			<td>University of California, San Francisco</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/</td>
			<td>Analysis of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tospin 3.2 (or newer)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html</td>
			<td>acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale

Proteinkonformasjonsdynamikk spiller grunnleggende roller i regulering av enzymatisk katalyse, ligandbinding, allosteri og signalering, som er viktige biologiske prosesser. Å forstå hvordan balansen mellom struktur og dynamikk styrer biologisk funksjon er en ny grense i moderne strukturbiologi og har antent flere tekniske og metodologiske utviklinger. Blant disse gir CPMG avslapningsdispersjonsløsning NMR-metoder unik, atomoppløselig informasjon om strukturen, kinetikken og termodynamikken til proteinkonformasjonslikevekter som forekommer på μs-ms-tidsskalaen. Her presenterer studien detaljerte protokoller for oppkjøp og analyse av et 15N avslapningsspredningseksperiment. Som et eksempel vises rørledningen for analyse av μs-ms-dynamikken i C-terminaldomenet til bakterier Enzyme I.

Protokollen som er beskrevet her resulterer i oppkjøp av RD-profiler for hver topp i 1H-15N TROSY-spekteret (Figur 3A). Fra de oppkjøpte RD-profilene er det mulig å estimere utvekslingsbidraget til 15N tverrgående avslapning av hver ryggrad midt i gruppen (Figur 3A,3B). Ved å plotte Rex på 3D-strukturen til proteinet som undersøkes, er det mulig å identifisere strukturområdene som gjennomgår ...

Watch this Scientific Journal Video about 15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ã‚Âµs-ms Timescale at JoVE.com

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

Her gis en detaljert beskrivelse av protokollen implementert i laboratoriet for anskaffelse og analyse av 15N avslapningsdispersjonsprofiler etter løsning NMR spektroskopi.

15 N CPMG avslapning dispersjon for undersøkelse av protein konformasjonsdynamikk på μs-ms tidsskala

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Denne protokollen kan brukes til deteksjon og karakterisering av proteinkonformasjonsdynamikk, som er avgjørende for å forstå et stort utvalg av cellulære prosesser. Sammenlignet med andre metoder krever denne metoden ikke spesialiserte prøveprepareringstrinn og gir omfattende karakterisering av kinetikk, termodynamikk og strukturelle aspekter ved konfirmasjonslikevekt. CPMG avslapningsdispersjon kan brukes i større grad for karakterisering av konfirmasjonsdynamikk i nukleinsyrer og andre biomolekyler, samt for karakterisering av ligand nanopartikkelinteraksjoner.Vår protokoll er rettet mot førstegangs CPMG-brukere. Så det er et godt utgangspunkt. Vi forventer imidlertid at brukerne vet de grunnleggende trinnene for å kjøre konvensjonelle NMR-eksperimenter.For å sette opp et NMR-eksperiment for første gang, last først ned og pakk ut disse tilleggsfilene. Kopier bitene. vv og trosy_15N_CPMG.vv-filer i pulsprogrammappen til pulsprogramkatalogen. Åpne oppkjøpsprogramvaren og bruk EDC-kommandoen til å kopiere et tidligere kjørt hydrogen nitrogen 15 HSQC-eksperiment til et nytt eksperiment. Bruk kommandoen pulse program til å laste inn trosy_15N_CPMG.vv puls programfilen inn i det nyopprettede eksperimentet. Bruk deretter instruksjonene fra slutten av pulsprogramfilen for å sette opp CPMG-eksperimentet. For å sette opp et rutinemessig NMR-eksperiment, introduser prøven til magneten og utfør alle de grunnleggende NMR-anskaffelsestrinnene.Sett P1 til varigheten av hydrogenet harde 90 graders pulser og P7 til varigheten nitrogen 15 harde 90 grader pulser. I oppkjøpsvinduet angir du senter- og spektralbredden for hydrogen og nitrogen 15 dimensjoner. Sett avslapningsforsinkelsen til 0,7 T2 og bruk VC-listekommandoen til å opprette en liste over heltall som tilsvarer N.Etter å ha bekreftet at hver oppføring i listen tilsvarer et annet CPMG-felt i henhold til CPMG arkivert er lik ganger 4N delt på D30, kontroller at det første tallet i listen er null.Sett L8 til antall oppføringer i VC-listen, L3 til antall reelle poeng for den indirekte dimensjonen, og 1TD til L8 ganger L3 ganger to. For å optimalisere vannundertrykkingen, sett mottakerforsterkningen til en og skriv EDC-trekk for å åpne pulsprogramfilen. På linje 91 fjerner du semikolonet foran goto 999, og lagrer filen.Bruk GS-kommandoen til å justere SPDB0-parameterne for å minimere intensiteten til FID-signalet. Når signalintensiteten er endret, kan du gjeninnføre et semikolon på linje 91 i pulsprogramfilen og lagre filen. For å optimalisere SPDB11, sett mottakerforsterkningen til en og typen EDC-trekk for å åpne pulsprogramfilen.På linje 168 fjerner du semikolonet foran goto 999, og lagrer filen. Bruk GS-kommandoen til å justere SPDB11-parameterne for å minimere intensiteten til FID-signalet. Når signalintensiteten er endret, gjeninnfører du semikolonet på linje 168 og lagrer filen.For å optimalisere SPDB2, sett mottakerforsterkningen til en og skriv inn EDC-trekk for å åpne pulsprogramfilen. På linje 179 fjerner du semikolonet foran goto 999, og lagrer filen. Bruk GS-kommandoen til å justere SPDB2-parameterne for å minimere intensiteten til FID-signalet.Når signalintensiteten er endret, introduserer du semikolonet på linje 179 i pulsprogramfilen på nytt og lagrer filen. For å optimalisere PLDB2, sett mottakerforsterkningen til en og skriv inn EDC-trekk for å åpne pulsprogramfilen. På linje 184 fjerner du semikolonet foran goto 999, og lagrer filen.Bruk GS-kommandoen til å justere PLDB2-parametrene for å minimere intensiteten til FID-signalet. Når signalintensiteten er endret, gjeninnfører du semikolonet på linje 184 i pulsprogramfilen og lagrer filen. Kjør RGA-kommandoen for å optimalisere mottakerforsterkningen.Kjør deretter ZG-kommandoen for å starte eksperimentet. I denne figuren kan resultatene av avslapningsdispersjonsprofilene som er oppnådd for hver topp i hydrogen nitrogen 15 Trosy-spekteret observeres. Fra de oppkjøpte avslapningsdispersjonsprofilene er det mulig å estimere utvekslingsbidraget til nitrogen 15 tverrgående avslapning av hver ryggrad AMI-gruppe.Ved å plotte den tverrgående avslapningen på 3D-strukturen til proteinet som undersøkes, er det mulig å identifisere strukturområdene som gjennomgår konfirmasjonsutveksling på mikrosekund millisekunders tidsskala. Modellering av avslapningsdispersjonskurvene ved hjelp av Carver-Richards-ligningene returnerer de termodynamiske og kinetiske parametrene på utvekslingsprosessen, for eksempel fraksjonspopulasjonene til statene i likevekt og valutakursen blant disse statene. Temperaturavhengigheten til disse termodynamiske og kinetiske parametrene kan deretter modelleres ved hjelp av henholdsvis van't Hoff- og I-ringligningene for å få detaljert informasjon om energiske konfirmasjonsutvekslingen.Det er avgjørende å optimalisere alle anskaffelsesparametrene nøye, spesielt P7. Det er også viktig å produsere svært rene og homogene prøver for å unngå falske dispersjoner. De kinetiske, termodynamiske og kjemiske sponparametrene oppnådd ved hjelp av denne protokollen kan brukes til å utlede energisk og strukturell informasjon om arten som gjennomgår konfirmasjonsutvekslingen. Karakterisering av proteinbekreftelsesdynamikken oppnådd ved CPMG-metoder gir avgjørende informasjon for å forstå signalering og enzymatisk aktivitet, samt nye perspektiver for legemiddeldesign.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metode for høy gjennomstrømning kjemiske Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Definere Hsp33's Redox regulert Anstandsdame aktivitet og kartlegging Conformational endringer på Hsp33 med Hydrogen-deuterium Exchange massespektrometri

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry å studere Binding dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til Solid-støttet Lipid Bilayers bruker et Quartz-Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruke i Vitro fluorescens resonans energioverføring å studere dynamikken i Protein komplekser på et millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom hele kvantifisering av merking homogenitet på ett molekyl nivå

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisere Surface T-cell reseptor Dynamics firedimensjonalt ved hjelp av gitter lysark mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Undersøke dynamikken i Cellular vedheft og spredning av epitelceller på Fibronektin under oksidativt stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Praktiske aspekter ved prøvepreparering og oppsett av 1H R1ρ avslapningsspredningsforsøk av RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...