Name: 15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale
Uploaded: 2021-04-19T15:00:00
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Este trabalho foi apoiado por fundos da NIGMS R35GM133488 e do Roy J. Carver Charitable Trust para V.V.

1. Preparação da amostra de RMN
<ol><li>Expresse e purifique uma amostra de 2H,15N-labled da proteína de interesse. NOTA: Enquanto uma amostra de proteína de 15N pode ser usada para aquisição do experimento CPMG RD, a perdateração (quando possível) aumenta drasticamente a qualidade dos dados obtidos. Protocolos para a produção de proteínas perdidos estão disponíveis na literatura13.</li>
	<li>Tampão troque a amostra de proteína purificada em um...

<ol>
	<li>Anthis, N. J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy.">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).</li><li>Lisi, G. P., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+NMR+spectroscopy+for+the+study+of+enzyme+allostery.">Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery.</a> Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).</li><li>Mittermaier, A., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+provide+new+insights+in+NMR+studies+of+protein+dynamics.">New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics.</a> Science. 312 (5771), 224-228 (2006).</li><li>Venditti, V., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+selection+and+substrate+binding+regulate+the+monomer/dimer+equilibrium+of+the+C-terminal+domain+of+Escherichia+coli+enzyme+I.">Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).</li><li>Venditti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+interdomain+rearrangement+triggered+by+suppression+of+micro-+to+millisecond+dynamics+in+bacterial+Enzyme+I.">Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I.</a> Nature Communications. 6, 5960 (2015).</li><li>Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+cycle+scheme+that+significantly+suppresses+offset-dependent+artifacts+in+the+R2-CPMG+15N+relaxation+experiment.">A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment.</a> Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).</li><li>Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+slow+(micros-ms)+time+scale+dynamics+in+protein+side+chains+by+(15)N+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy:+application+to+Asn+and+Gln+residues+in+a+cavity+mutant+of+T4+lysozyme.">Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TROSY+CPMG+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+in+large+proteins.">A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).</li><li>Dotas, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+thermophilic/mesophilic+enzymes+reveal+a+role+for+conformational+disorder+in+regulation+of+bacterial+Enzyme+I.">Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).</li><li>Purslow, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+site+breathing+of+human+Alkbh5+revealed+by+solution+NMR+and+accelerated+molecular+dynamics.">Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics.</a> Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+relaxation-compensated+Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+by+NMR+Spectroscopy.">A relaxation-compensated Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).</li><li>Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+15N+relaxation+dispersion+experiment+for+the+measurement+of+millisecond+time-scale+dynamics+in+proteins.">An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins.</a> Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).</li><li>Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope+labeling+strategies+for+the+study+of+high-molecular-weight+proteins+by+solution+NMR+spectroscopy.">Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).</li><li>Niklasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+NMR+data+using+advanced+line+shape+fitting.">Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).</li><li>Palmer, A. G., Kroenke, C. D., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+methods+for+quantifying+microsecond-to-millisecond+motions+in+biological+macromolecules.">Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules.</a> Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).</li><li>Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+dynamics+in+folded+and+unfolded+states+of+an+SH3+domain.">Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).</li><li>Carver, J. P., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+two-site+solution+for+the+chemical+exchange+produced+dependence+of+T2+upon+the+Carr-Purcell+pulse+separation.">A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).</li><li>Egner, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Contrast'+NMR+Reveals+Non-innocent+Role+of+Support+in+Pd/CeO2+Catalyzed+Phenol+Hydrogenation.">Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation.</a> ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).</li><li>Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Insight+into+Nanoparticle+Surface+Adsorption+by+Solution+NMR+Spectroscopy+in+an+Aqueous+Gel.">Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).</li><li>Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+energetics+of+a+three-state+protein+folding+system+probed+by+high-pressure+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy.">The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).</li><li>Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+slow+dynamics+in+high+molecular+weight+proteins+by+methyl-TROSY+NMR+spectroscopy:+application+to+a+723-residue+enzyme.">Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).</li><li>Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+backbone+(13)CO+and+(15)N+relaxation+dispersion+at+high+resolution.">Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).</li><li>Pritchard, R. B., Hansen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+side+chains+in+large+proteins+by+protonless+(13)C-detected+NMR+spectroscopy.">Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy.</a> Nature Communications. 10, 1747 (2019).</li></ol>

Este manuscrito descreve o protocolo implementado em laboratório para aquisição e análise de dados de 15N RD sobre proteínas. Em particular, são abordadas as etapas cruciais para a preparação da amostra de RMN, medição dos dados de RMN e análise dos perfis rd. Abaixo alguns aspectos importantes sobre a aquisição e análise de experimentos de RD são discutidos. No entanto, para uma descrição mais aprofundada do experimento e análise de dados, o estudo cuidadoso da literatura original é altamen...

Os experimentos de dispersão de relaxamento (RD) Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) são usados em uma base de rotina para caracterizar o equilíbrio conformacional que ocorre na escala de tempo μs-ms por solução espectroscopia NMR1,2,3,4,5. Em comparação com outros métodos de investigação da dinâmica conformacional, as técnicas de CPMG são relativamente fáceis de implementar em espectrômetros de RN modernos, não exigem etapas especializadas de preparação de amostras (ou seja, cristalização, congelamento ou alinhamento de amostras e/ou conjugação codinâmica com uma etiqueta fluorescente ou paramagnética), e fornecem uma caracterização abrangente do equilíbrio conformacional retornando informações estruturais, cinéticas e termodinâmicas em processos de troca. Para que um experimento cpmg informe sobre um equilíbrio conformacional, duas condições devem ser aplicadas: (i) as rodadas de RMN observadas devem possuir diferentes mudanças químicas nos estados submetidos à troca conformacional (microestados) e (ii) a troca deve ocorrer em uma escala de tempo que varia de ~50 μs a ~10 ms. Nessas condições, a taxa de relaxamento transversal observada <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq01v2.jpg"> é a soma do R2 intrínseco (o R2 medido na ausência de dinâmica μs-ms) <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq02v3.jpg"> e a contribuição cambial para o relaxamento transversal (Rex). A contribuiçãoR ex para R2obs pode ser progressivamente saciada reduzindo o espaçamento entre os pulsos de 180° que constituem o bloco CPMG da sequência de pulso, e as curvas RD resultantes podem ser modeladas usando a teoria Bloch-McConnell para obter a diferença de mudança química entre os microestados, a população fracionária de cada microestado, e as taxas de troca entre microestados (Figura 1)1,2,3.
Várias sequências de pulso diferentes e protocolos de análise foram relatados na literatura para experimentos de 15N CPMG. Aqui, o protocolo implementado no laboratório é descrito. Em particular, serão introduzidas as etapas cruciais para a elaboração da amostra de RMN, a configuração e aquisição dos experimentos de RMN e o processamento e análise dos dados da RMN(Figura 2). Para facilitar a transferência do protocolo para outros laboratórios, o programa de pulso, scripts de processamento e análise e um exemplo de conjunto de dados são fornecidos como Arquivos Suplementares e estão disponíveis para download em (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). A sequência de pulso fornecida incorpora um ciclo de fase de quatro etapas no bloco CPMG para supressão de artefatos dependentes de deslocamento6 e é codificada para aquisição de vários experimentos intercalados. Esses experimentos intercalados têm um período de relaxamento idêntico, mas números diferentes de pulsos de refoco, a fim de alcançar diferentes campos CPMG7. Também é importante notar que o programa de pulso descrito mede o 15N R2 do componente TROSY do sinal NMR8. No geral, o protocolo foi aplicado com sucesso para a caracterização da troca conformacional em proteínas de médio e grande porte4,5,9,10. Para sistemas menores (<20 kDa), o uso de uma sequência de pulso baseada em Coerência Quântica Única Heteronuclear (HSQC)é aconselhável.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryoprobe</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe</td>
			<td>Improve sensitivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium Oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>756822-1</td>
			<td>&#62;99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand driven centrifuge</td>
			<td>United Scientific supply</td>
			<td>CENTFG1</td>
			<td>Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Field NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800</td>
			<td>acquisition of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td>
			<td>Modeling of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pasteur Pipette</td>
			<td>Corning Incorporation</td>
			<td>7095D-NMR</td>
			<td>Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tube</td>
			<td>Willmad Precision</td>
			<td>535-PP-7</td>
			<td>5mm thin wall 7&#39;&#39; cylinderical glass tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRPipe</td>
			<td>Institute of Biosciences and Biotechnology research</td>
			<td>https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html</td>
			<td>NMR data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPARKY</td>
			<td>University of California, San Francisco</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/</td>
			<td>Analysis of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tospin 3.2 (or newer)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html</td>
			<td>acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale

A dinâmica conformacional proteica desempenha papéis fundamentais na regulação da catálise enzimática, ligação de ligantes, aosteria e sinalização, que são importantes processos biológicos. Entender como o equilíbrio entre estrutura e dinâmica rege a função biológica é uma nova fronteira na biologia estrutural moderna e tem inflamado diversos desenvolvimentos técnicos e metodológicos. Entre estes, os métodos NMR da solução de relaxamento cpmg fornecem informações únicas de resolução atômica sobre a estrutura, cinética e termodinâmica do equilíbrio conformacional proteico que ocorre na escala de tempo μs-ms. Aqui, o estudo apresenta protocolos detalhados para aquisição e análise de um experimento de dispersão de relaxamento de 15N. Como exemplo, o pipeline para a análise da dinâmica μs-ms no domínio terminal C da bactéria Enzima I é mostrado.

O protocolo descrito aqui resulta na aquisição de perfis RD para cada pico no espectro 1H-15N TROSY(Figura 3A). A partir dos perfis de RD adquiridos, é possível estimar a contribuição cambial para o relaxamento transversal de 15N de cada grupo backbone amide(Figura 3A,3B). Ao traçar oR ex na estrutura 3D da proteína sob investigação, é possível identificar as regiões estruturais submetidas...

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15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

Aqui, é fornecida uma descrição detalhada do protocolo implementado no laboratório para aquisição e análise de perfis de dispersão de relaxamento de 15N por espectroscopia de solução NMR.

15 N CPMG Relaxation Dispersão para a Investigação da Dinâmica Conformacional de Proteínas na escala de tempo μs-ms

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Este protocolo pode ser usado para detecção e caracterização da dinâmica conformacional proteica, que são essenciais para a compreensão de uma grande variedade de processos celulares. Em comparação com outros métodos, este método não requer etapas especializadas de preparação da amostra e fornece em caracterização abrangente da cinética, termodinâmica e aspectos estruturais do equilíbrio confirmacional. A dispersão de relaxamento do CPMG pode ser aplicada mais amplamente para a caracterização da dinâmica confirmacional em ácidos nucleicos e outras biomoléculas, bem como para a caracterização de interações de ligantes e nanopartículas.Nosso protocolo é voltado para usuários cpmg iniciantes. Então é um bom ponto de partida. No entanto, esperamos que os usuários saibam os passos básicos para executar experimentos NMR convencionais.Para configurar um experimento NMR pela primeira vez, primeiro baixe e descompacte esses arquivos suplementares. Copie os Bits. VV e trosy_15N_CPMG.arquivos vv na pasta do programa de pulso para o diretório do programa de pulso. Abra o software de aquisição e use o comando EDC para copiar um experimento de nitrogênio de hidrogênio de 15 HSQC anteriormente executado em um novo experimento. Use o comando do programa de pulso para carregar o trosy_15N_CPMG.arquivo do programa vv pulse no experimento recém-criado. Em seguida, use as instruções do final do arquivo do programa de pulso para configurar o experimento CPMG. Para configurar um experimento de NMR de rotina, introduza a amostra ao ímã e realize todas as etapas básicas de aquisição de RMN.Coloque P1 à duração do hidrogênio com pulsos de 90 graus e P7 até a duração nitrogênio 15 pulsos duros de 90 graus. Na janela de aquisição, defina a largura central e espectral para as dimensões de hidrogênio e nitrogênio 15 dimensões. Defina o atraso de relaxamento para 0,7 T2 e use o comando da lista VC para criar uma lista de números inteiros correspondentes a N.Depois de confirmar que cada entrada na lista corresponde a um campo CPMG diferente de acordo com o CPMG arquivado igual a vezes 4N dividido por D30, verifique se o primeiro número da lista é zero.Defina L8 para o número de entradas na lista VC, L3 para o número de pontos reais para a dimensão indireta, e 1TD para L8 vezes L3 vezes dois. Para otimizar a supressão da água, defina o ganho do receptor para um e digite o EDC puxar para abrir o arquivo do programa de pulso. Na linha 91, remova o semi-cólon anterior ao goto 999 e salve o arquivo.Usando o comando GS, ajuste os parâmetros SPDB0 para minimizar a intensidade do sinal FID. Quando a intensidade do sinal for modificada, reintroduza um semi-cólon na linha 91 do arquivo do programa de pulso e salve o arquivo. Para otimizar o SPDB11, defina o ganho do receptor para um e o tipo EDC puxar para abrir o arquivo do programa de pulso.Na linha 168, remova o semi-cólon anterior ao goto 999 e salve o arquivo. Usando o comando GS, ajuste os parâmetros SPDB11 para minimizar a intensidade do sinal FID. Quando a intensidade do sinal for modificada, reintroduza o semi-cólon na linha 168 e salve o arquivo.Para otimizar o SPDB2, defina o ganho do receptor para um e digite o puxão EDC para abrir o arquivo do programa de pulso. Na linha 179, remova o semi-cólon anterior ao goto 999 e salve o arquivo. Usando o comando GS, ajuste os parâmetros SPDB2 para minimizar a intensidade do sinal FID.Quando a intensidade do sinal tiver sido modificada, reinsira o semi-cólon na linha 179 do arquivo do programa de pulso e salve o arquivo. Para otimizar o PLDB2, defina o ganho do receptor para um e digite o puxão EDC para abrir o arquivo do programa de pulso. Na linha 184, remova o semi-cólon anterior ao goto 999 e salve o arquivo.Usando o comando GS, ajuste os parâmetros PLDB2 para minimizar a intensidade do sinal FID. Quando a intensidade do sinal for modificada, reintroduza o semi-cólon na linha 184 do arquivo do programa de pulso e salve o arquivo. Execute o comando RGA para otimizar o ganho do receptor.Em seguida, execute o comando ZG para iniciar o experimento. Nesta figura, os resultados dos perfis de dispersão de relaxamento adquiridos para cada pico no espectro de nitrogênio hidrogênio 15 Trosy podem ser observados. A partir dos perfis de dispersão de relaxamento adquiridos, é possível estimar a contribuição cambial para o relaxamento transversal de nitrogênio 15 de cada grupo de AMI backbone.Ao traçar o relaxamento transverso na estrutura 3D da proteína sob investigação é possível identificar as regiões estruturais submetidas à troca de confirmação na escala de tempo de milissegundos microsegundos. A modelagem das curvas de dispersão de relaxamento utilizando as equações de Carver-Richards retorna os parâmetros termodinâmicos e cinéticos no processo de troca, como as populações fracionárias dos estados em equilíbrio e a taxa de câmbio entre esses estados. A dependência de temperatura desses parâmetros termodinâmicos e cinéticos pode então ser modelada usando as equações van't Hoff e I-ring, respectivamente, para obter informações detalhadas sobre a energia da troca de confirmação.É fundamental otimizar cuidadosamente todos os parâmetros de aquisição, em particular p7. Também é importante produzir amostras altamente puras e homogêneas para evitar dispersões espúrias. Os parâmetros cinéticos, termodinâmicos e químicos obtidos usando este protocolo podem ser usados para obter informações energéticas e estruturais sobre as espécies submetidas à troca de confirmação. A caracterização da dinâmica de confirmação de proteínas obtida pelos métodos cpmg fornece informações cruciais para a compreensão da sinalização e da atividade enzimática, bem como novas perspectivas para o design de medicamentos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Bioquímica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Definição da atividade de chaperona regulada por redox de Hsp33 e mapeamento de alterações conformacionais em Hsp33 usando espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo para estudar a dinâmica da vinculação do fosfolipídeo proteína anexina A2 para Bilayers do Lipid com suporte sólido usando um ressonador de quartzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Usando na transferência de energia de ressonância de fluorescência de Vitro para estudar a dinâmica dos complexos de proteínas em uma escala de tempo de milissegundo

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Quantificação de Proteome-largo de rotulagem homogeneidade a nível da molécula

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualizando dinâmica sadrindo de receptor estéta de células t usando microscopia de folha de luz de rede

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Examinando a dinâmica da adesão celular e disseminação de células epiteliais em fibronectina durante o estresse oxidativo

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