Name: 15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale
Uploaded: 2021-04-19T15:00:00
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Este trabajo fue apoyado por fondos de NIGMS R35GM133488 y del Roy J. Carver Charitable Trust a V.V.

1. Preparación de la muestra de RMN
<ol><li>Expresar y purificar una muestra de 2H,15N-labled de la proteína de interés. NOTA: Mientras que una muestra de proteína 15con etiqueta N se puede utilizar para la adquisición del experimento CPMG RD, la perdeuteración (cuando sea posible) aumenta dramáticamente la calidad de los datos obtenidos. Los protocolos para la producción de proteínas perdeuteradas están disponibles en la literatura13.</li>
	<li>Inte...

<ol>
	<li>Anthis, N. J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy.">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).</li><li>Lisi, G. P., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+NMR+spectroscopy+for+the+study+of+enzyme+allostery.">Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery.</a> Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).</li><li>Mittermaier, A., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+provide+new+insights+in+NMR+studies+of+protein+dynamics.">New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics.</a> Science. 312 (5771), 224-228 (2006).</li><li>Venditti, V., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+selection+and+substrate+binding+regulate+the+monomer/dimer+equilibrium+of+the+C-terminal+domain+of+Escherichia+coli+enzyme+I.">Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).</li><li>Venditti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+interdomain+rearrangement+triggered+by+suppression+of+micro-+to+millisecond+dynamics+in+bacterial+Enzyme+I.">Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I.</a> Nature Communications. 6, 5960 (2015).</li><li>Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+cycle+scheme+that+significantly+suppresses+offset-dependent+artifacts+in+the+R2-CPMG+15N+relaxation+experiment.">A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment.</a> Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).</li><li>Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+slow+(micros-ms)+time+scale+dynamics+in+protein+side+chains+by+(15)N+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy:+application+to+Asn+and+Gln+residues+in+a+cavity+mutant+of+T4+lysozyme.">Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TROSY+CPMG+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+in+large+proteins.">A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).</li><li>Dotas, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+thermophilic/mesophilic+enzymes+reveal+a+role+for+conformational+disorder+in+regulation+of+bacterial+Enzyme+I.">Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).</li><li>Purslow, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+site+breathing+of+human+Alkbh5+revealed+by+solution+NMR+and+accelerated+molecular+dynamics.">Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics.</a> Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+relaxation-compensated+Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+by+NMR+Spectroscopy.">A relaxation-compensated Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).</li><li>Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+15N+relaxation+dispersion+experiment+for+the+measurement+of+millisecond+time-scale+dynamics+in+proteins.">An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins.</a> Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).</li><li>Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope+labeling+strategies+for+the+study+of+high-molecular-weight+proteins+by+solution+NMR+spectroscopy.">Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).</li><li>Niklasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+NMR+data+using+advanced+line+shape+fitting.">Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).</li><li>Palmer, A. G., Kroenke, C. D., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+methods+for+quantifying+microsecond-to-millisecond+motions+in+biological+macromolecules.">Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules.</a> Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).</li><li>Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+dynamics+in+folded+and+unfolded+states+of+an+SH3+domain.">Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).</li><li>Carver, J. P., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+two-site+solution+for+the+chemical+exchange+produced+dependence+of+T2+upon+the+Carr-Purcell+pulse+separation.">A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).</li><li>Egner, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Contrast'+NMR+Reveals+Non-innocent+Role+of+Support+in+Pd/CeO2+Catalyzed+Phenol+Hydrogenation.">Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation.</a> ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).</li><li>Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Insight+into+Nanoparticle+Surface+Adsorption+by+Solution+NMR+Spectroscopy+in+an+Aqueous+Gel.">Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).</li><li>Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+energetics+of+a+three-state+protein+folding+system+probed+by+high-pressure+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy.">The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).</li><li>Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+slow+dynamics+in+high+molecular+weight+proteins+by+methyl-TROSY+NMR+spectroscopy:+application+to+a+723-residue+enzyme.">Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).</li><li>Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+backbone+(13)CO+and+(15)N+relaxation+dispersion+at+high+resolution.">Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).</li><li>Pritchard, R. B., Hansen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+side+chains+in+large+proteins+by+protonless+(13)C-detected+NMR+spectroscopy.">Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy.</a> Nature Communications. 10, 1747 (2019).</li></ol>

Este manuscrito describe el protocolo implementado en el laboratorio para la adquisición y análisis de 15N RD de datos sobre proteínas. En particular, se cubren los pasos cruciales para la preparación de la muestra de RMN, la medición de los datos de RMN y el análisis de los perfiles de DR. A continuación se discuten algunos aspectos importantes con respecto a la adquisición y el análisis de experimentos de RD. Sin embargo, para una descripción más profunda del experimento y el análisis de los dato...

Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) experimentos de dispersión de relajación (RD) se utilizan sobre una base de rutina para caracterizar los equilibrios conformacionales que ocurren en la escala de tiempo de μs-ms por solución espectroscopia de RMN1,2,3,4,5. En comparación con otros métodos para la investigación de la dinámica conformacional, las técnicas de CPMG son relativamente fáciles de implementar en los espectrómetros de RMN modernos, no requieren pasos especializados de preparación de muestras (es decir, cristalización, congelación o alineación de muestras, y / o conjugación covalente con una etiqueta fluorescente o paramagnética), y proporcionan una caracterización completa de los equilibrios conformacionales que devuelven información estructural, cinética y termodinámica sobre los procesos de intercambio. Para que un experimento de CPMG informe sobre un equilibrio conformacional, se deben aplicar dos condiciones: (i) los espines de RMN observados deben poseer diferentes cambios químicos en los estados sometidos a intercambio conformacional (microestados) y (ii) el intercambio tiene que ocurrir en una escala de tiempo que va de ~50 μs a ~10 ms. En estas condiciones, la tasa de relajación transversal observada ( <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq01v2.jpg"> ) es la suma delR2 intrínseco (elR2 medido en ausencia de dinámica de μs-ms, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq02v3.jpg"> ) y la contribución de intercambio a la relajación transversal (Rex). La contribución de Rex aR2obs se puede apagar progresivamente reduciendo el espaciamiento entre los pulsos de 180° que constituyen el bloque CPMG de la secuencia de pulsos, y las curvas de RD resultantes se pueden modelar utilizando la teoría de Bloch-McConnell para obtener la diferencia de desplazamiento químico entre microestados, la población fraccionaria de cada microestado y las tasas de intercambio entre microestados(Figura 1),1,2,3.
Varias diversas secuencias del pulso y protocolos del análisis se han divulgado en la literatura para 15experimentos de N CPMG. Adjunto, el protocolo puesto en ejecución en el laboratorio se describe. En particular, se introducirán los pasos cruciales para la preparación de la muestra de RMN, la configuración y adquisición de los experimentos de RMN, y el procesamiento y análisis de los datos de RMN (Figura 2). Para facilitar la transferencia del protocolo a otros laboratorios, el programa de pulsos, los scripts de procesamiento y análisis y un conjunto de datos de ejemplo se proporcionan como archivos suplementarios y están disponibles para su descarga en (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). La secuencia de pulsos proporcionada incorpora un ciclo de fase de cuatro pasos en el bloque CPMG para la supresión de artefactos dependientes de desplazamiento6 y está codificada para la adquisición de varios experimentos intercalados. Estos experimentos intercalados tienen un período de relajación idéntico pero diferentes números de pulsos de reenfoque para lograr diferentes camposcpmg 7. También es importante notar que el programa de impulsos descrito mide los 15N R2 de la componente TROSY de la señal de RMN8. En general, el protocolo se ha aplicado con éxito para la caracterización del intercambio conformacional en proteínas de tamaño mediano y grande4,5,9,10. Para sistemas más pequeños (<20 kDa), se recomienda el uso de una secuencia de pulsosheteronuclearbasada en coherencia cuántica única (HSQC)11, 12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryoprobe</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe</td>
			<td>Improve sensitivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium Oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>756822-1</td>
			<td>&#62;99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand driven centrifuge</td>
			<td>United Scientific supply</td>
			<td>CENTFG1</td>
			<td>Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Field NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800</td>
			<td>acquisition of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td>
			<td>Modeling of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pasteur Pipette</td>
			<td>Corning Incorporation</td>
			<td>7095D-NMR</td>
			<td>Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tube</td>
			<td>Willmad Precision</td>
			<td>535-PP-7</td>
			<td>5mm thin wall 7&#39;&#39; cylinderical glass tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRPipe</td>
			<td>Institute of Biosciences and Biotechnology research</td>
			<td>https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html</td>
			<td>NMR data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPARKY</td>
			<td>University of California, San Francisco</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/</td>
			<td>Analysis of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tospin 3.2 (or newer)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html</td>
			<td>acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale

La dinámica conformacional de proteínas juega un papel fundamental en la regulación de la catálisis enzimática, la unión de ligandos, el alosterismo y la señalización, que son procesos biológicos importantes. Comprender cómo el equilibrio entre la estructura y la dinámica gobierna la función biológica es una nueva frontera en la biología estructural moderna y ha encendido varios desarrollos técnicos y metodológicos. Entre estos, los métodos de RMN de la solución de dispersión de relajación de CPMG proporcionan información única de resolución atómica sobre la estructura, cinética y termodinámica de los equilibrios conformacionales de proteínas que ocurren en la escala de tiempo de μs-ms. Aquí, el estudio presenta protocolos detallados para la adquisición y el análisis de un experimento de dispersión de relajación de 15N. Como ejemplo, se muestra la tubería para el análisis de la dinámica μs-ms en el dominio C-terminal de la enzima I.

El protocolo aquí descrito da como resultado la adquisición de perfiles de DR para cada pico en elespectro TROSY de 1H-15N (Figura 3A). A partir de los perfiles de DR adquiridos, es posible estimar la contribución de intercambio a la relajación transversal de 15N de cada grupo amida de la columna vertebral (Figura 3A,3B). Trazando el Rex sobre la estructura 3D de la proteína bajo investigación, e...

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15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

Aquí, se proporciona una descripción detallada del protocolo implementado en el laboratorio para la adquisición y análisis de perfiles de dispersión de relajación de 15N por solución de espectroscopia de RMN.

15. N CPMG Dispersión De Relajación Para La Investigación De La Dinámica Conformacional De Proteínas En La Escala De Tiempo μs-ms

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Este protocolo se puede utilizar para la detección y caracterización de la dinámica conformacional de proteínas, que son esenciales para la comprensión de una gran variedad de procesos celulares. En comparación con otros métodos, este método no requiere pasos especializados en la preparación de muestras y proporciona una caracterización exhaustiva de la cinética, la termodinámica y los aspectos estructurales del equilibrio de confirmación. La dispersión de relajación cpmg se puede aplicar más ampliamente para la caracterización de la dinámica de confirmación en ácidos nucleicos y otras biomoléculas, así como para la caracterización de las interacciones de nanopartículas de ligandos.Nuestro protocolo está dirigido a usuarios de CPMG por primera vez. Por lo tanto, es un buen punto de partida. Sin embargo, esperamos que los usuarios sepan los pasos básicos para ejecutar experimentos convencionales del RMN.Para configurar un experimento de RMN por primera vez, primero descargue y descomprima estos archivos suplementarios. Copie los bits. vv y trosy_15N_CPMG.vv en la carpeta del programa pulse al directorio del programa pulse. Abra el software de adquisición y utilice el comando EDC para copiar un experimento HSQC de nitrógeno de hidrógeno 15 ejecutado anteriormente en un nuevo experimento. Utilice el comando pulse program para cargar el trosy_15N_CPMG.vv pulse en el experimento recién creado. A continuación, utilice las instrucciones del final del archivo de programa de pulsos para configurar el experimento CPMG. Para configurar un experimento rutinario de RMN, introduzca la muestra en el imán y realice todos los pasos básicos de adquisición de RMN.Fije P1 a la duración de los pulsos duros del hidrógeno de 90 grados y P7 a la duración del nitrógeno 15 pulsos duros de 90 grados. En la ventana de adquisición, establezca el centro y el ancho espectral para las dimensiones de hidrógeno y nitrógeno 15. Establezca el retardo de relajación en 0,7 T2 y utilice el comando VC list para crear una lista de números enteros correspondientes a N.Después de confirmar que cada entrada de la lista corresponde a un campo CPMG diferente según CPMG archivado es igual a veces 4N dividido por D30, compruebe que el primer número de la lista es cero.Fije L8 al número de entradas en la lista del VC, L3 al número de puntos verdaderos para la dimensión indirecta, y 1TD a L8 por L3 por dos. Para optimizar la supresión de agua, establezca la ganancia del receptor en uno y escriba EDC pull para abrir el archivo de programa de impulsos. En la línea 91, quite el punto y coma anterior a goto 999 y guarde el archivo.Mediante el comando GS, ajuste los parámetros SPDB0 para minimizar la intensidad de la señal FID. Cuando se haya modificado la intensidad de la señal, vuelva a introducir un punto y coma en la línea 91 del archivo de programa de impulsos y guarde el archivo. Para optimizar SPDB11, establezca la ganancia del receptor en uno y el tipo EDC pull para abrir el archivo de programa de impulsos.En la línea 168, quite el punto y coma anterior a goto 999 y guarde el archivo. Con el comando GS, ajuste los parámetros spdb11 para minimizar la intensidad de la señal FID. Cuando se haya modificado la intensidad de la señal, vuelva a introducir el punto y coma en la línea 168 y guarde el archivo.Para optimizar SPDB2, establezca la ganancia del receptor en uno e introduzca EDC pull para abrir el archivo de programa de impulsos. En la línea 179, quite el punto y coma anterior a goto 999 y guarde el archivo. Mediante el comando GS, ajuste los parámetros spdb2 para minimizar la intensidad de la señal FID.Cuando se haya modificado la intensidad de la señal, vuelva a introducir el punto y coma en la línea 179 del archivo de programa de impulsos y guarde el archivo. Para optimizar PLDB2, establezca la ganancia del receptor en uno e introduzca EDC pull para abrir el archivo de programa de impulsos. En la línea 184, quite el punto y coma anterior a goto 999 y guarde el archivo.Usando el comando GS, ajuste los parámetros PLDB2 para minimizar la intensidad de la señal FID. Cuando se haya modificado la intensidad de la señal, vuelva a introducir el punto y coma en la línea 184 del archivo de programa de impulsos y guarde el archivo. Ejecute el comando RGA para optimizar la ganancia del receptor.A continuación, ejecute el comando ZG para iniciar el experimento. En esta figura se pueden observar los resultados de los perfiles de dispersión de relajación adquiridos para cada pico en el espectro de hidrógeno nitrógeno 15 Trosy. A partir de los perfiles de dispersión de relajación adquiridos, es posible estimar la contribución de intercambio a la relajación transversal de nitrógeno 15 de cada grupo AMI de la columna vertebral.Al trazar la relajación transversal en la estructura 3D de la proteína bajo investigación, es posible identificar las regiones estructurales sometidas a intercambio confirmacional en la escala de tiempo de milisegundos de microsegundos. El modelado de las curvas de dispersión de relajación utilizando las ecuaciones de Carver-Richards devuelve los parámetros termodinámicos y cinéticos en el proceso de intercambio, como las poblaciones fraccionarias de los estados en equilibrio y la tasa de cambio entre estos estados. La dependencia de la temperatura de estos parámetros termodinámicos y cinéticos se puede modelar utilizando las ecuaciones de van't Hoff y I-ring, respectivamente, para obtener información detallada sobre la energética del intercambio de confirmación.Es crucial optimizar cuidadosamente todos los parámetros de adquisición, en particular P7. También es importante producir muestras altamente puras y homogéneas para evitar dispersiones espurias. Los parámetros cinéticos, termodinámicos y químicos obtenidos mediante este protocolo se pueden utilizar para obtener información energética y estructural sobre las especies sometidas al intercambio de confirmación. La caracterización de la dinámica de confirmación de proteínas obtenida por los métodos de CPMG proporciona información crucial para la comprensión de la señalización y la actividad enzimática, así como nuevas perspectivas para el diseño de fármacos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Investigación

Bioquímica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Un método Simple para la detección química de alto rendimiento en Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Definición acompañante Regulación Redox actividad de Hsp33 y mapeo de cambios conformacionales en la Hsp33 mediante espectrometría de masas de intercambio hidrógeno-deuterio

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry disipativo para estudiar la dinámica de unión de la fosfolípido vinculante proteínas anexina A2 a bicapas de lípidos respaldados por el sólido utilizando un resonador de cuarzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Uso en transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia de Vitro para el estudio de la dinámica de los complejos de la proteína en una escala de tiempo de milisegundos

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

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Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualización de la dinámica del receptor de células T de superficie de cuatro dimensiones mediante la microscopía de hoja de luz de celosía

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Examen de la dinámica de la adhesión celular y la propagación de células epiteliales en la fibronectina durante el estrés oxidativo

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Aspectos prácticos de la preparación de muestras y la configuración de 1H R1ρ Experimentos de dispersión de relajación de ARN

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...