Name: 15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale
Uploaded: 2021-04-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ã‚Âµs-ms Timescale at JoVE.com

Detta arbete stöddes av medel från NIGMS R35GM133488 och från Roy J. Carver Charitable Trust till V.V.

1. Beredning av NMR-provet
<ol><li>Uttryck och rena ett 2H,15N-lablat prov av proteinet av intresse. OBS: Även om ett 15N-märkt proteinprov kan användas för förvärv av CPMG RD-experimentet, ökar perdeuterationen (om möjligt) dramatiskt kvaliteten på de erhållna uppgifterna. Protokoll för produktion av perdeuterated proteiner finns i litteraturen13.</li>
	<li>Buffertväxlar det renade proteinprovet till en avgasad NMR-buffert.</li>
	<li>Överför NMR...

<ol>
	<li>Anthis, N. J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy.">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).</li><li>Lisi, G. P., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+NMR+spectroscopy+for+the+study+of+enzyme+allostery.">Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery.</a> Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).</li><li>Mittermaier, A., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+provide+new+insights+in+NMR+studies+of+protein+dynamics.">New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics.</a> Science. 312 (5771), 224-228 (2006).</li><li>Venditti, V., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+selection+and+substrate+binding+regulate+the+monomer/dimer+equilibrium+of+the+C-terminal+domain+of+Escherichia+coli+enzyme+I.">Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).</li><li>Venditti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+interdomain+rearrangement+triggered+by+suppression+of+micro-+to+millisecond+dynamics+in+bacterial+Enzyme+I.">Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I.</a> Nature Communications. 6, 5960 (2015).</li><li>Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+cycle+scheme+that+significantly+suppresses+offset-dependent+artifacts+in+the+R2-CPMG+15N+relaxation+experiment.">A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment.</a> Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).</li><li>Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+slow+(micros-ms)+time+scale+dynamics+in+protein+side+chains+by+(15)N+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy:+application+to+Asn+and+Gln+residues+in+a+cavity+mutant+of+T4+lysozyme.">Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TROSY+CPMG+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+in+large+proteins.">A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).</li><li>Dotas, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+thermophilic/mesophilic+enzymes+reveal+a+role+for+conformational+disorder+in+regulation+of+bacterial+Enzyme+I.">Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).</li><li>Purslow, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+site+breathing+of+human+Alkbh5+revealed+by+solution+NMR+and+accelerated+molecular+dynamics.">Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics.</a> Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+relaxation-compensated+Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+by+NMR+Spectroscopy.">A relaxation-compensated Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).</li><li>Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+15N+relaxation+dispersion+experiment+for+the+measurement+of+millisecond+time-scale+dynamics+in+proteins.">An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins.</a> Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).</li><li>Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope+labeling+strategies+for+the+study+of+high-molecular-weight+proteins+by+solution+NMR+spectroscopy.">Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).</li><li>Niklasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+NMR+data+using+advanced+line+shape+fitting.">Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).</li><li>Palmer, A. G., Kroenke, C. D., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+methods+for+quantifying+microsecond-to-millisecond+motions+in+biological+macromolecules.">Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules.</a> Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).</li><li>Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+dynamics+in+folded+and+unfolded+states+of+an+SH3+domain.">Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).</li><li>Carver, J. P., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+two-site+solution+for+the+chemical+exchange+produced+dependence+of+T2+upon+the+Carr-Purcell+pulse+separation.">A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).</li><li>Egner, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Contrast'+NMR+Reveals+Non-innocent+Role+of+Support+in+Pd/CeO2+Catalyzed+Phenol+Hydrogenation.">Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation.</a> ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).</li><li>Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Insight+into+Nanoparticle+Surface+Adsorption+by+Solution+NMR+Spectroscopy+in+an+Aqueous+Gel.">Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).</li><li>Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+energetics+of+a+three-state+protein+folding+system+probed+by+high-pressure+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy.">The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).</li><li>Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+slow+dynamics+in+high+molecular+weight+proteins+by+methyl-TROSY+NMR+spectroscopy:+application+to+a+723-residue+enzyme.">Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).</li><li>Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+backbone+(13)CO+and+(15)N+relaxation+dispersion+at+high+resolution.">Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).</li><li>Pritchard, R. B., Hansen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+side+chains+in+large+proteins+by+protonless+(13)C-detected+NMR+spectroscopy.">Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy.</a> Nature Communications. 10, 1747 (2019).</li></ol>

Detta manuskript beskriver det protokoll som implementerats i laboratoriet för förvärv och analys av 15N RD-data om proteiner. I synnerhet omfattas de avgörande stegen för beredning av NMR-provet, mätning av NMR-data och analys av fjärrskrivbordsprofilerna. Nedan diskuteras några viktiga aspekter kring förvärv och analys av RD-experiment. Men för en mer djupgående beskrivning av experimentet och dataanalysen rekommenderas noggrant studier av den ursprungliga litteraturenstarkt 3,<...

Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) avslappning dispersion (RD) experiment används på en rutinmässig bas för att karakterisera conformational equilibria förekommer på μs-ms tidsskalan genom lösning NMR spektroskopi1,2,3,4,5. Jämfört med andra metoder för undersökning av konformationsdynamik är CPMG-tekniker relativt lätta att genomföra på moderna NMR-spektrometrar, kräver inte specialiserade provberedningssteg (dvs. kristallisering, provfrysning eller justering och/eller kovalent konjugation med fluorescerande eller paramagnetisk tagg) och ger en omfattande karakterisering av konform balansomvandling som returnerar strukturell, kinetisk och termodynamisk information om utbytesprocesser. För att ett CPMG-experiment ska kunna rapportera om en konformationsjämvikt måste två villkor gälla: i) de observerade NMR-spinn måste ha olika kemiska förskjutningar i de stater som genomgår konformationsutbyte (mikrostater) och ii) utbytet måste ske i en tidsskala som sträcker sig från ~50 μs till ~10 ms. Under dessa förhållanden är den observerade tvärgående avslappningshastigheten ( <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq01v2.jpg"> ) summan av den inneboende R2 (R2 mätt i avsaknad av μs-ms-dynamik) <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq02v3.jpg"> och utbytesbidraget till den tvärgående avslappningen (Rex). Rex-bidraget till R2obs kan gradvis släckas genom att minska avståndet mellan de 180° pulserna som utgör CPMG-blocket i pulssekvensen, och de resulterande RD-kurvorna kan modelleras med hjälp av Bloch-McConnell-teorin för att erhålla den kemiska skiftskillnaden mellan mikrostater, den fraktionerade populationen av varje mikrostat och växelkurserna mellan mikrostater (Figur 1)1,2,3.
Flera olika pulssekvenser och analysprotokoll har rapporterats i litteraturen för 15N CPMG experiment. Häri beskrivs det protokoll som implementeras i laboratoriet. I synnerhet kommer de avgörande stegen för beredning av NMR-provet, som inrättats och insamlar NMR-experimenten, och bearbetning och analys av NMR-data att införas (figur 2). För att underlätta överföringen av protokollet till andra laboratorier tillhandahålls pulsprogrammet, bearbetnings- och analysskripten och ett exempel på datauppsättning som kompletterande filer och finns tillgängliga för nedladdning på (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). Den medföljande pulssekvensen innehåller en fyrastegsfascykel i CPMG-blocket för undertryckande av offsetberoendeartefakter 6 och den är kodad för förvärv av flera interfolierade experiment. Dessa interfolierade experiment har en identisk avslappningsperiod men olika antal omfokuseringspulser för att uppnå olika CPMG-fält7. Det är också viktigt att märka att det beskrivna pulsprogrammet mäter 15N R2 av TROSY-komponenten i NMR-signalen8. Sammantaget har protokollet framgångsrikt tillämpats för karakterisering av konformationsutbyte i medelstora och stora proteiner4,5,9,10. För mindre system (<20 kDa) är det lämpligt att använda en Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC)-baseradpulssekvens 11,12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryoprobe</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe</td>
			<td>Improve sensitivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium Oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>756822-1</td>
			<td>&#62;99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand driven centrifuge</td>
			<td>United Scientific supply</td>
			<td>CENTFG1</td>
			<td>Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Field NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800</td>
			<td>acquisition of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td>
			<td>Modeling of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pasteur Pipette</td>
			<td>Corning Incorporation</td>
			<td>7095D-NMR</td>
			<td>Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tube</td>
			<td>Willmad Precision</td>
			<td>535-PP-7</td>
			<td>5mm thin wall 7&#39;&#39; cylinderical glass tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRPipe</td>
			<td>Institute of Biosciences and Biotechnology research</td>
			<td>https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html</td>
			<td>NMR data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPARKY</td>
			<td>University of California, San Francisco</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/</td>
			<td>Analysis of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tospin 3.2 (or newer)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html</td>
			<td>acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale

Proteinkonformationsdynamik spelar grundläggande roller vid reglering av enzymatisk katalys, ligandbindning, allostery och signalering, som är viktiga biologiska processer. Att förstå hur balansen mellan struktur och dynamik styr den biologiska funktionen är en ny gräns inom modern strukturbiologi och har antänt flera tekniska och metodologiska utvecklingar. Bland dessa ger CPMG-avslappningsdispersionslösning nmr-metoder unik atomupplösningsinformation om struktur, kinetik och termodynamik av proteinkonform ekvilibrier som förekommer på μs-ms-tidsskalan. Här presenterar studien detaljerade protokoll för förvärv och analys av ett 15 N avslappningsspridningsexperiment. Som ett exempel visas pipelinen för analys av μs-ms-dynamiken i C-terminaldomänen för bakterie enzym I.

Det protokoll som beskrivs här resulterar i förvärv av RD-profiler för varje topp i 1H-15N TROSY-spektrumet (Figur 3A). Av de förvärvade rd-profilerna är det möjligt att uppskatta utbytesbidraget till den tvärgående avslappningen på 15N av varje ryggrad mitt i gruppen(figur 3A,3B). Genom att rita Rex på 3D-strukturen hos det protein som under utredning är det möjligt att identifiera de st...

Watch this Scientific Journal Video about 15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ã‚Âµs-ms Timescale at JoVE.com

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

Här ges en detaljerad beskrivning av protokollet som implementerats i laboratoriet för förvärv och analys av 15N avslappningsspridningsprofiler genom lösning NMR-spektroskopi.

15 (på 5) N CPMG Avslappningsdispersion för undersökning av proteinkonformationsdynamik på tidsskalan μs-ms

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Detta protokoll kan användas för detektion och karakterisering av proteinkonformationsdynamik, som är avgörande för att förstå en stor mängd cellulära processer. Jämfört med andra metoder kräver denna metod inte specialiserade provberedningssteg och ger omfattande karakterisering av kinetik, termodynamik och strukturella aspekter av konfirmativ jämvikt. CPMG avslappning dispersion kan tillämpas mer allmänt för karakterisering av konfirmationsdynamik i nukleinsyror och andra biomolekyler, liksom för karakterisering av ligand nanopartiklar interaktioner.Vårt protokoll riktar sig till första gången CPMG-användare. Så det är en bra utgångspunkt. Vi förväntar oss dock att användarna ska känna till de grundläggande stegen för att köra konventionella NMR-experiment.För att ställa in ett NMR-experiment för första gången, ladda först ner och packa upp dessa kompletterande filer. Kopiera bitarna. vv och trosy_15N_CPMG.vv-filer i pulsprogrammappen till pulsprogramkatalogen. Öppna förvärvsprogramvaran och använd kommandot EDC för att kopiera ett tidigare kört vätekväve 15 HSQC-experiment till ett nytt experiment. Använd kommandot pulseprogram för att läsa trosy_15N_CPMG.vv pulse program fil i det nyskapade experimentet. Använd sedan anvisningarna från slutet av pulsprogramfilen för att ställa in CPMG-experimentet. För att ställa in ett rutinmässigt NMR-experiment, introducera provet till magneten och utför alla grundläggande NMR-förvärvssteg.Ställ in P1 på väte hårda 90 graders pulser och P7 till varaktigheten kväve 15 hårda 90 graders pulser. I förvärvsfönstret ställer du in centrum och spektralbredden för väte- och kvävedimensionerna 15 dimensioner. Ställ in avslappningsfördröjningen på 0,7 T2 och använd kommandot VC-lista för att skapa en lista med heltalsnummer som motsvarar N.Efter att ha bekräftat att varje post i listan motsvarar ett annat CPMG-fält enligt CPMG arkiverat lika med gånger 4N dividerat med D30, kontrollera att det första numret i listan är noll.Ange L8 till antalet poster i VC-listan, L3 till antalet verkliga punkter för den indirekta dimensionen och 1TD till L8 gånger L3 gånger två. För att optimera vattendämpningen ställer du in mottagarens förstärkning på en och skriver EDC-drag för att öppna pulsprogramfilen. På rad 91, ta bort semikolonet före goto 999 och spara filen.Använd GS-kommandot och justera SPDB0-parametrarna för att minimera intensiteten hos FID-signalen. När signalintensiteten har ändrats, återinför ett semikolon på rad 91 i pulsprogramfilen och spara filen. Om du vill optimera SPDB11 ställer du in mottagarens förstärkning på en och typen EDC drar för att öppna pulsprogramfilen.På rad 168, ta bort semikolonet före goto 999 och spara filen. Använd GS-kommandot och justera SPDB11-parametrarna för att minimera intensiteten hos FID-signalen. När signalintensiteten har ändrats, återinför semikolonet på rad 168 och spara filen.Om du vill optimera SPDB2 ställer du in mottagarens förstärkning på en och anger EDC pull för att öppna pulsprogramfilen. På rad 179, ta bort semikolonet före goto 999 och spara filen. Använd GS-kommandot och justera SPDB2-parametrarna för att minimera intensiteten hos FID-signalen.När signalintensiteten har ändrats, sätt tillbaka semikolonet på rad 179 i pulsprogramfilen och spara filen. För att optimera PLDB2 ställer du in mottagarens förstärkning på en och anger EDC-pull för att öppna pulsprogramfilen. På rad 184, ta bort semikolonet före goto 999 och spara filen.Använd GS-kommandot och justera PLDB2-parametrarna för att minimera intensiteten hos FID-signalen. När signalintensiteten har ändrats, återinför semikolonet på rad 184 i pulsprogramfilen och spara filen. Kör RGA-kommandot för att optimera mottagarens förstärkning.Kör sedan ZG-kommandot för att starta experimentet. I denna siffra kan resultaten av de avslappningsdispersionsprofiler som förvärvats för varje topp i vätekväve 15 Trosy-spektrumet observeras. Från de förvärvade avslappningsspridningsprofilerna är det möjligt att uppskatta utbytesbidraget till kväve 15 tvärgående avslappning av varje ryggradS-AMI-grupp.Genom att plotta den tvärgående avslappningen på 3D-strukturen hos det protein som under utredning är det möjligt att identifiera de strukturella regioner som genomgår konfirmationsutbyte på mikrosekunds millisekundens tidsskala. Modellering av avslappningsspridningskurvorna med carver-Richards-ekvationerna returnerar de termodynamiska och kinetiska parametrarna på utbytesprocessen, såsom de fraktionerade populationerna i tillstånden i jämvikt och växelkursen mellan dessa stater. Temperaturberoendet av dessa termodynamiska och kinetiska parametrar kan sedan modelleras med hjälp av ekvationerna van't Hoff respektive I-ring för att få detaljerad information om energierna i konfirmationsutbytet.Det är viktigt att noggrant optimera alla förvärvsparametrar, särskilt P7. Det är också viktigt att producera mycket rena och homogena prover för att undvika falska dispersioner. De kinetiska, termodynamiska och kemiska chipparametrarna som erhålls med hjälp av detta protokoll kan användas för att härleda energisk och strukturell information om de arter som genomgår konfirmationsutbytet. Karakterisering av proteinbekräftelsedynamiken som erhålls med CPMG-metoder ger viktig information för att förstå signalering och enzymatisk aktivitet, liksom nya perspektiv för läkemedelsdesign.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metod för hög genomströmning kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Definiera Hsp33's Redox-reglerade förkläde aktivitet och mappning konfirmerande ändringar på Hsp33 med hjälp av väte-deuterium Exchange masspektrometri

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Använda i Vitro fluorescens resonans energiöverföring att studera dynamiken i proteinkomplex på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantifiering av märkning homogenitet på nivån enda molekyl

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisera Surface T-cellsreceptordynamik fyrdimensionellt använda lattice ljusark mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Undersöka dynamiken i cellulära vidhäftning och spridning av epitelceller på fibronectin under oxidativ stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Praktiska aspekter av provberedning och installation av 1H R 1ρ avslappningsdispersionsexperiment av RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...