Name: 15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale
Uploaded: 2021-04-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ã‚Âµs-ms Timescale at JoVE.com

Bu çalışma NIGMS R35GM133488 ve Roy J. Carver Charitable Trust'tan V.V.'ye fonlarla desteklendi.

1. NMR örneğinin hazırlanması
<ol><li>İlgi proteininin 2H,15N-labled örneğini eksprese edin ve arındırın. NOT: CPMG RD deneyinin alınması için 15N etiketli protein örneği kullanılabilirken, perdeuterasyon (mümkünse) elde edilen verilerin kalitesini önemli ölçüde artırır. Perdeuterated proteinlerin üretimine ilişkin protokoller literatürde mevcuttur13.</li>
	<li>Tampon, saflaştırılmış protein örneğini gazsız bir NMR tamponuna ...

<ol>
	<li>Anthis, N. J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy.">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).</li><li>Lisi, G. P., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+NMR+spectroscopy+for+the+study+of+enzyme+allostery.">Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery.</a> Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).</li><li>Mittermaier, A., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+provide+new+insights+in+NMR+studies+of+protein+dynamics.">New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics.</a> Science. 312 (5771), 224-228 (2006).</li><li>Venditti, V., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+selection+and+substrate+binding+regulate+the+monomer/dimer+equilibrium+of+the+C-terminal+domain+of+Escherichia+coli+enzyme+I.">Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).</li><li>Venditti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+interdomain+rearrangement+triggered+by+suppression+of+micro-+to+millisecond+dynamics+in+bacterial+Enzyme+I.">Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I.</a> Nature Communications. 6, 5960 (2015).</li><li>Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+cycle+scheme+that+significantly+suppresses+offset-dependent+artifacts+in+the+R2-CPMG+15N+relaxation+experiment.">A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment.</a> Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).</li><li>Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+slow+(micros-ms)+time+scale+dynamics+in+protein+side+chains+by+(15)N+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy:+application+to+Asn+and+Gln+residues+in+a+cavity+mutant+of+T4+lysozyme.">Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TROSY+CPMG+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+in+large+proteins.">A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).</li><li>Dotas, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+thermophilic/mesophilic+enzymes+reveal+a+role+for+conformational+disorder+in+regulation+of+bacterial+Enzyme+I.">Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).</li><li>Purslow, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+site+breathing+of+human+Alkbh5+revealed+by+solution+NMR+and+accelerated+molecular+dynamics.">Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics.</a> Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+relaxation-compensated+Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+by+NMR+Spectroscopy.">A relaxation-compensated Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).</li><li>Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+15N+relaxation+dispersion+experiment+for+the+measurement+of+millisecond+time-scale+dynamics+in+proteins.">An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins.</a> Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).</li><li>Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope+labeling+strategies+for+the+study+of+high-molecular-weight+proteins+by+solution+NMR+spectroscopy.">Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).</li><li>Niklasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+NMR+data+using+advanced+line+shape+fitting.">Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).</li><li>Palmer, A. G., Kroenke, C. D., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+methods+for+quantifying+microsecond-to-millisecond+motions+in+biological+macromolecules.">Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules.</a> Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).</li><li>Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+dynamics+in+folded+and+unfolded+states+of+an+SH3+domain.">Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).</li><li>Carver, J. P., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+two-site+solution+for+the+chemical+exchange+produced+dependence+of+T2+upon+the+Carr-Purcell+pulse+separation.">A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).</li><li>Egner, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Contrast'+NMR+Reveals+Non-innocent+Role+of+Support+in+Pd/CeO2+Catalyzed+Phenol+Hydrogenation.">Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation.</a> ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).</li><li>Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Insight+into+Nanoparticle+Surface+Adsorption+by+Solution+NMR+Spectroscopy+in+an+Aqueous+Gel.">Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).</li><li>Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+energetics+of+a+three-state+protein+folding+system+probed+by+high-pressure+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy.">The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).</li><li>Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+slow+dynamics+in+high+molecular+weight+proteins+by+methyl-TROSY+NMR+spectroscopy:+application+to+a+723-residue+enzyme.">Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).</li><li>Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+backbone+(13)CO+and+(15)N+relaxation+dispersion+at+high+resolution.">Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).</li><li>Pritchard, R. B., Hansen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+side+chains+in+large+proteins+by+protonless+(13)C-detected+NMR+spectroscopy.">Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy.</a> Nature Communications. 10, 1747 (2019).</li></ol>

Bu makalede, proteinler üzerinde 15 NRD verinin eldei ve analizi için laboratuvarda uygulanan protokol açıklanmaktadır. Özellikle, NMR örneğinin hazırlanması, NMR verilerinin ölçümü ve RD profillerinin analizi için önemli adımlar ele alınmıştır. Aşağıda RD deneylerinin edinimi ve analizi ile ilgili bazı önemli hususlar tartışılmıştır. Bununla birlikte, deney ve veri analizinin daha derinlemesine tanımlanması için, orijinal literatürün dikkatli bir şekilde incelenmesi şidd...

Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) gevşeme dispersiyon (RD) deneyleri, μs-ms zaman ölçeğinde meydana gelen konformasyonel dengeyi NMR spektroskopisi1, 2,3,4,5çözeltisi ile karakterize etmek için rutin bir tabanda kullanılır. Konformasyonel dinamiklerin araştırılması için diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, CPMG tekniklerinin modern NMR spektrometrelerinde uygulanması nispeten kolaydır, özel numune hazırlama adımları (örneğin, kristalizasyon, numune dondurma veya hizalama ve/veya floresan veya paramanyetik etiketli kovalent konjugasyon) gerektirmez ve değişim süreçlerinde yapısal, kinetik ve termodinamik bilgileri döndüren konformasyonel dengenin kapsamlı bir şekilde nitelendirilmesini sağlar. Bir CPMG deneyinin konformasyonsal bir dengeyi rapor edebilmesi için iki koşul geçerli olmalıdır: (i) gözlemlenen NMR dönüşleri, konformasyonsal değişime uğrayan durumlarda farklı kimyasal kaymalara sahip olmalıdır (mikro durumlar) ve (ii) değişimin ~50 μs ile ~10 ms arasında değişen bir zaman ölçeğinde gerçekleşmesi gerekir. Bu koşullar altında, gözlemlenen enine gevşeme oranı ( <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq01v2.jpg"> ) iç R 2 'nin(μs-ms dinamiklerinin yokluğunda ölçülen R2) <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq02v3.jpg"> ve enine gevşemeye değişim katkısının (Rex)toplamıdır. R2obs'a Rex katkısı, darbe dizisinin CPMG bloğunu oluşturan 180 ° darbeler arasındaki aralığı azaltarak kademeli olarak söndürülebilir, ve ortaya çıkan RD eğrileri, mikro devletler arasındaki kimyasal kayma farkını, her mikro devletteki kesirli popülasyonu ve mikro devletler arasındaki değişim oranlarını elde etmek için Bloch-McConnell teorisi kullanılarak modellenebilir (Şekil 1)1,2,3.
Literatürde 15 NCPMG deneyi için birkaç farklı nabız dizisi ve analiz protokolü bildirilmiştir. Burada laboratuvarda uygulanan protokol açıklanmıştır. Özellikle, NMR örneğinin hazırlanması, NMR deneylerinin kurulması ve alınması ve NMR verilerinin işlenmesi ve analizi için önemli adımlar tanıtılacaktır (Şekil 2). Protokolün diğer laboratuvarlara aktarılmasını kolaylaştırmak için, darbe programı, işleme ve analiz komut dosyaları ve bir örnek veri kümesi Ek Dosyalar olarak sağlanır ve (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html. Sağlanan darbe dizisi, ofset bağımlı yapıtların6'nın bastırılması için CPMG bloğunda dört adımlı bir faz döngüsü içerir ve birkaç aralanmış deneyin alınması için kodlanmıştır. Bu aralanmış deneyler aynı gevşeme süresine sahiptir, ancak farklı CPMG alanları elde etmek için farklı sayıda yeniden odaklama darbeleri7. Açıklanan darbe programının NMR sinyali8'inTROSY bileşeninin 15N R 2'yi ölçtüklerine dikkat etmek de önemlidir. Genel olarak, orta ve büyük boyutlu proteinler 4 ,5,9,10'dakonformasyonsal değişimin karakterizasyonu için protokolbaşarıylauygulanmıştır. Daha küçük sistemler (<20 kDa) için Heteronuclear Tek Kuantum Tutarlılığı (HSQC) tabanlı darbe dizisi11,12 kullanılması önerilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryoprobe</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe</td>
			<td>Improve sensitivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium Oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>756822-1</td>
			<td>&#62;99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand driven centrifuge</td>
			<td>United Scientific supply</td>
			<td>CENTFG1</td>
			<td>Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Field NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800</td>
			<td>acquisition of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td>
			<td>Modeling of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pasteur Pipette</td>
			<td>Corning Incorporation</td>
			<td>7095D-NMR</td>
			<td>Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tube</td>
			<td>Willmad Precision</td>
			<td>535-PP-7</td>
			<td>5mm thin wall 7&#39;&#39; cylinderical glass tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRPipe</td>
			<td>Institute of Biosciences and Biotechnology research</td>
			<td>https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html</td>
			<td>NMR data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPARKY</td>
			<td>University of California, San Francisco</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/</td>
			<td>Analysis of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tospin 3.2 (or newer)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html</td>
			<td>acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale

Protein konformasyonsal dinamikleri, önemli biyolojik süreçler olan enzimatik kataliz, ligand bağlama, allosteri ve sinyalizasyonun düzenlenmesinde temel roller oynar. Yapı ve dinamikler arasındaki dengenin biyolojik işlevi nasıl yönettiğini anlamak, modern yapısal biyolojide yeni bir sınırdır ve çeşitli teknik ve metodolojik gelişmelerin fitilini ateşlemiştir. Bunlar arasında, CPMG gevşeme dispersiyon çözümü NMR yöntemleri, μs-ms zaman ölçeğinde meydana gelen protein konformasyonsal dengenin yapısı, kinetiği ve termodinamiği hakkında benzersiz, atomik çözünürlüklü bilgiler sağlar. Burada, çalışma 15 Ngevşeme dispersiyon deneyinin edinilmesi ve analizi için ayrıntılı protokoller sunmaktadır. Örnek olarak, bakteri Enzim I'in C-terminal etki alanındaki μs-ms dinamiklerinin analizi için boru hattı gösterilmiştir.

Burada açıklanan protokol, 1 H- 15 NTROSY spektrumundaki her tepe için RD profillerinin alınmasıyla sonuçlanır (Şekil 3A). Edinilen RD profillerinden, her omurga amid grubunun 15 Nenine gevşemesine değişim katkısını tahmin etmek mümkündür (Şekil 3A,3B). Rex'i incelenen proteinin 3D yapısı üzerine çizerek, μs-ms zaman ölçeğinde konformasyonsal değişime uğrayan yapısal bölg...

Watch this Scientific Journal Video about 15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ã‚Âµs-ms Timescale at JoVE.com

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

Burada 15 Ngevşeme dispersiyon profillerinin çözelti NMR spektroskopisi ile edinilmesi ve analizi için laboratuvarda uygulanan protokolün detaylı bir açıklaması sağlanmaktadır.

15 μs-ms Zaman Ölçeğinde Protein Konformasyonsal Dinamiklerinin Araştırılması için N CPMG Gevşeme Dağılımı

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Bu protokol, çok çeşitli hücresel süreçleri anlamak için gerekli olan protein konformasyonsal dinamiklerinin tespiti ve karakterizasyonu için kullanılabilir. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntem özel numune hazırlama adımları gerektirmez ve kinetiğin, termodinamiğin ve teyit dengesinin yapısal yönlerinin kapsamlı bir şekilde karakterize edilmesini sağlar. CPMG gevşeme dağılımı, nükleik asitlerde ve diğer biyomoleküllerde onay dinamiklerinin karakterizasyonu ve ligand nanopartikül etkileşimlerinin karakterizasyonu için daha yaygın olarak uygulanabilir.Protokolümüz ilk kez CPMG kullanıcılarına yöneliktir. Bu yüzden iyi bir başlangıç noktası. Ancak, kullanıcıların geleneksel NMR denemelerini çalıştırmak için temel adımları bilmelerini bekliyoruz.İlk kez bir NMR denemesi ayarlamak için, önce bu ek dosyaları indirin ve ferşimi çözün. Bitleri kopyalayın. vv ve trosy_15N_CPMG.vv dosyaları darbe programı klasöründe darbe programı dizinine. Edinme yazılımını açın ve daha önce çalıştırılan bir hidrojen nitrojen 15 HSQC deneyini yeni bir deneye kopyalamak için EDC komutunu kullanın. trosy_15N_CPMG yüklemek için pulse program komutunu kullanın.vv pulse program dosyasını yeni oluşturulan deneye alın. Ardından, CPMG denemesini ayarlamak için darbe programı dosyasının sonundaki yönergeleri kullanın. Rutin bir NMR denemesi ayarlamak için, örneği mıknatısla tanıtın ve tüm temel NMR edinme adımlarını gerçekleştirin.P1'i hidrojen sert 90 derece darbe süresine ve P7'yi azot 15 sert 90 derece darbe süresine ayarlayın. Edinme penceresinde, hidrojen ve azot 15 boyutları için merkez ve spektral genişliği ayarlayın. Gevşeme gecikmesini 0.7 T2 olarak ayarlayın ve VC listesi komutunu kullanarak N'ye karşılık gelen tamsayı numaralarının bir listesini oluşturun.Listedeki her girişin, dosyalanan CPMG'ye göre farklı bir BGBMG alanına karşılık geldiğini onayladıktan sonra, D30'a bölünen 4N'ye eşittir, listedeki ilk sayının sıfır olup olmadığını kontrol edin.L8'i VC listesindeki girdi sayısına, L3'ü dolaylı boyut için gerçek nokta sayısına ve 1TD'yi L8 çarpı L3 çarpı ikiye ayarlayın. Su bastırmayı optimize etmek için, alıcı kazancını bire ayarlayın ve darbe programı dosyasını açmak için EDC çekme yazın. 91. satırda, goto 999'dan önceki nokta üst üste işareti kaldırın ve dosyayı kaydedin.GS komutunu kullanarak, FID sinyalinin yoğunluğunu en aza indirmek için SPDB0 parametrelerini ayarlayın. Sinyal yoğunluğu değiştirildiğinde, darbe programı dosyasının 91. SPDB11'i en iyi duruma getirmek için, alıcı kazancını bire ve darbe programı dosyasını açmak için EDC çekme türünü ayarlayın.168. satırda, goto 999'dan önceki nokta üst üste işareti kaldırın ve dosyayı kaydedin. GS komutunu kullanarak, FID sinyalinin yoğunluğunu en aza indirmek için SPDB11 parametrelerini ayarlayın. Sinyal yoğunluğu değiştirildiğinde, yarı iki nokta üst üsteyi satır 168'e yeniden girin ve dosyayı kaydedin.SPDB2'yi en iyi duruma getirmek için alıcı kazancını bire ayarlayın ve darbe programı dosyasını açmak için EDC çekme girin. 179. satırda, goto 999'dan önceki nokta üst üste işareti kaldırın ve dosyayı kaydedin. GS komutunu kullanarak, FID sinyalinin yoğunluğunu en aza indirmek için SPDB2 parametrelerini ayarlayın.Sinyal yoğunluğu değiştirildiğinde, darbe programı dosyasının 179 numaralı satırında noktalı virgülü yeniden tanıtın ve dosyayı kaydedin. PLDB2'yi optimize etmek için alıcı kazancını bire ayarlayın ve darbe programı dosyasını açmak için EDC çekin girin. 184. satırda, goto 999'dan önceki nokta üst üsteyi kaldırın ve dosyayı kaydedin.GS komutunu kullanarak, FID sinyalinin yoğunluğunu en aza indirmek için PLDB2 parametrelerini ayarlayın. Sinyal yoğunluğu değiştirildiğinde, darbe programı dosyasının 184 numaralı satırında noktalı virgülü yeniden girin ve dosyayı kaydedin. Alıcı kazancını en iyi duruma getirmek için RGA komutunu çalıştırın.Ardından denemeyi başlatmak için ZG komutunu çalıştırın. Bu şekilde, hidrojen nitrojen 15 Trosy spektrumundaki her tepe için elde edilen gevşeme dispersiyon profillerinin sonuçları gözlemlenebilir. Elde edilen gevşeme dispersiyon profillerinden, her omurga AMI grubunun azot 15 enine gevşemesine değişim katkısını tahmin etmek mümkündür.Araştırılan proteinin 3B yapısındaki enine gevşemeyi çizerek, mikrosaniye milisaniyelik zaman ölçeğinde onay değişiminden geçen yapısal bölgeleri belirlemek mümkündür. Carver-Richards denklemleri kullanılarak gevşeme dağılım eğrilerinin modellanması, dengedeki devletlerin kesirli popülasyonları ve bu durumlar arasındaki değişim oranı gibi değişim sürecindeki termodinamik ve kinetik parametreleri döndürür. Bu termodinamik ve kinetik parametrelerin sıcaklık bağımlılığı, teyit değişiminin enerjileri hakkında ayrıntılı bilgi edinmek için sırasıyla van't Hoff ve I-ring denklemleri kullanılarak modellenebilir.Tüm alım parametrelerini, özellikle de P7'yi dikkatlice optimize etmek çok önemlidir. Sahte dağılımları önlemek için son derece saf ve homojen numuneler üretmek de önemlidir. Bu protokol kullanılarak elde edilen kinetik, termodinamik ve kimyasal çip parametreleri, onay değişiminden geçen türler hakkında enerjik ve yapısal bilgi elde etmek için kullanılabilir. CPMG yöntemleri ile elde edilen protein onay dinamiklerinin karakterizasyonu, sinyalizasyon ve enzimatik aktiviteyi anlamanın yanı sıra ilaç tasarımı için yeni bakış açıları konusunda çok önemli bilgiler sağlar.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Hsp33'ın redoks düzenlenir refakatçi etkinlik tanımlama ve Hsp33 konformasyon değişiklikleri hidrojen-döteryum Exchange kütle spektrometresi kullanarak eşleme

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

A2 bir kuvars rezonatör kullanarak katı destekli Lipid Bilayers için Annexin Protein bağlayıcı fosfolipid bağlama dinamikleri çalışmaya dissipative Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Protein kompleksleri milisaniyelik zaman ölçekte dinamikleri çalışmaya vitro Floresans rezonans enerji transferi içinde kullanma

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Yüzey T-Hücre Reseptör Dinamiklerini Dört Boyutlu Olarak Kafes Işık Sayfası Mikroskobu Kullanarak Görselleştirme

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Oksidatif Stres Sırasında Fibronektin Üzerine Hücresel Adezyon Dinamiğinin İncelenmesi ve Epitel Hücrelerinin Yayılması

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

RNA'nın 1 H R1φ Gevşeme Dispersiyon Deneylerinin Numune Hazırlama ve Kurulumunun Pratik Yönleri

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...