Name: rapid antimicrobial susceptibility testing by stimulated raman scattering imaging of deuterium incorporation in a single bacterium
Uploaded: 2022-02-14T12:30:00
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这项工作得到了NIH R01AI141439至J.-X.C和M.S.以及R35GM136223至J.-X.C的支持。

人类血液标本的使用符合波士顿大学IRB和美国国立卫生研究院（NIH）的指导方针。具体来说，标本来自银行，并且完全去识别化。波士顿大学机构审查委员会（IRB）办公室不认为这些标本是人类受试者。
1.细菌和抗生素储备溶液的制备
<ol><li>制备浓度为 1 mg/mL 的抗生素（硫酸庆大霉素或阿莫西林）储备溶液，溶解在 1.5 mL 微管中的无菌 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 或二甲基亚?...

快速AST可以通过在样品到SC-MIC结果的2.5小时内使用单细胞SRS代谢成像评估细菌代谢活动对抗生素治疗的反应来获得。通过使用C-D键的SRS成像监测用于生物分子合成的D2O的代谢掺入，可以检测细菌代谢活性和抗菌敏感性的反应。由于水在活细胞中无处不在，SRS代谢成像为快速AST提供了一种通用方法。快速AST方法适用于检测复杂生物环境中的细菌，例如尿液或全血在单个细菌水平上。SC-MIC可?...

抗微生物药物耐药性（AMR）是有效治疗传染病的一个日益严重的全球威胁1。据预测，如果不采取行动对抗抗生素耐药细菌，到2050年，抗微生物药物耐药性每年将造成1000万人死亡，全球GDP损失100万亿美元1，2。这强调了对感染性细菌抗生素敏感性检测（AST）的快速和创新诊断方法的迫切需要，以减缓抗生素耐药细菌的出现并降低相关死亡率3。为了确保最佳的临床结果，在24小时内引入有效的治疗至关重要。然而，目前的金标准方法，如盘式扩散法或肉汤稀释法，通常需要至少24小时用于临床样品的预孵育程序，另外需要16-24小时才能获得最小抑制浓度（MIC）结果。总体而言，这些方法过于耗时，无法指导临床上传染病治疗的立即决策，从而导致抗菌素耐药性的出现和传播4。
基因型AST方法，例如基于聚合酶链反应（PCR）的技术5，已被开发用于快速检测。这些技术测量特定的抗性基因序列，以提供快速的AST结果。它们不依赖于耗时的细胞培养;然而，只测试具有耐药性的特定已知基因序列。因此，其应用仅限于各种细菌种类或不同的抗性机制。此外，他们无法为治疗决策提供MIC结果6，7。此外，正在开发用于快速AST的新型表型方法以克服这些限制8，包括微流控器件9，10，11，12，13，光学器件14，15，16，量化核酸拷贝数的表型AST17，18和拉曼光谱方法19，20，21，22，23，24.这些方法减少了指导AST结果的时间，然而，它们中的大多数仅适用于细菌分离株，不直接适用于临床标本，并且仍然需要长时间的预孵育。
在这项工作中，我们提出了一种通过SRS成像监测细胞代谢活性来快速确定尿液和全血中细菌敏感性的方法。水（H2O）参与了活细胞中绝大多数基本的生物分子合成过程。作为水的同位素，通过NADPH中的氧化还原活性氢原子和D2O中的D原子之间的酶催化H / D交换反应，氘可以掺入电池内的生物质中25，26。氘代脂肪酸合成反应由氘标记的NADPH介导。D2O掺入氨基酸（AA）的反应中导致氘代蛋白产生26（图1）。通过这种方式，在单个微生物细胞中新合成的含C-D键的生物分子可以作为一般的代谢活性标志物进行检测。为了读出从头合成的C-D键，拉曼光谱是一种多功能分析工具，可提供生物分子的特异性和定量化学信息，广泛用于确定抗菌药敏性，并将测试时间显着缩短至几个小时27，28，29，30.然而，由于拉曼散射过程固有的低效率，自发拉曼光谱的检测灵敏度较低。因此，使用自发拉曼光谱获得实时图像结果具有挑战性。相干拉曼散射（CRS），包括相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和受激拉曼散射（SRS），由于相干光场产生的光场比自发拉曼光谱大几个数量级，因此达到了很高的检测灵敏度，从而在单细胞水平上呈现高速、特异性和定量的化学成像31，32，33，34，35，36，37，38，39.
在这里，基于我们最近的工作40，我们提出了一种协议，用于通过飞秒SRS C-D成像快速确定代谢活性和抗菌敏感性，在单细胞水平上正常培养基，尿液和全血环境中的细菌掺入D2O。飞秒SRS成像有助于在2.5小时内监测单细胞代谢失活浓度（SC-MIC）在单个细菌水平上对抗抗生素。SC-MIC结果通过肉汤微量稀释的标准MIC测试进行验证。我们的方法适用于确定细菌尿路感染（UTI）和血流感染（BSI）病原体的抗菌敏感性，与传统方法相比，测定时间大大缩短，这为临床上单细胞水平的快速表型AST提供了机会。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acousto-optic modulation</td>
			<td>Gooch&#38;Housego</td>
			<td>R15180-1.06-LTD</td>
			<td>Modulating stokes laser beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amoxicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8523-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ825/150m</td>
			<td>Block the stokes laser beam before the photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td>Cation adjustment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B12322</td>
			<td>Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tube with snap cap</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>149569B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daptomycin</td>
			<td>Acros</td>
			<td>A0386346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td></td>
			<td>151882</td>
			<td>Organic solvent to dissolve antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide-d6</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>156914</td>
			<td>Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BW 25113</td>
			<td>The Coli Genetic Stock Center</td>
			<td>7636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G4918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>SLSV025NB</td>
			<td>pore size 5 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version: 2.0.0-rc-69/1.52t</td>
			<td>Image processing and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubating orbital shaker set at 37 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97009-890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR452201-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSight DeepSee femtosecond pulsed laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Model: insight X3</td>
			<td>Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>Zurich Instrument</td>
			<td>HF2LI</td>
			<td>Demodulate the SRS signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil condenser</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-AAC</td>
			<td>NA 1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 47085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>S3994-01</td>
			<td>Detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene conical tube 15 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene filters</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>726-2520</td>
			<td>pore size 0.2 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-202-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 mL</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>14955459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Model: DU 530</td>
			<td>Measuring optical density at wavelength of 600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLANAPO/IR</td>
			<td>60&#215;, NA 1.2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid antimicrobial susceptibility testing by stimulated raman scattering imaging of deuterium incorporation in a single bacterium

为了减缓和防止抗微生物药物耐药性感染的传播，迫切需要快速抗菌药敏试验（AST）来定量确定对病原体的抗菌作用。通过基于长期培养的常规方法完成 AST 通常需要数天时间，并且它们不直接适用于临床样本。在这里，我们报告了一种通过氧化氘（D2O）代谢掺入的受激拉曼散射（SRS）成像实现的快速AST方法。通过SRS成像监测D2O在生物质中的代谢掺入和暴露于单个细菌水平的抗生素时的代谢活性抑制。暴露于抗生素时细菌的单细胞代谢失活浓度（SC-MIC）可以在总共2.5小时的样品制备和检测后获得。此外，这种快速AST方法直接适用于复杂生物环境中的细菌样品，例如尿液或全血。氘掺入的SRS代谢成像对于临床中的快速单细胞表型AST具有变革性意义。

孵育时间对氘掺入的影响是通过C-D（2070至2250 cm-1）和C-H（2，800至3，100 cm-1）区域的自发拉曼显微光谱法测量的（图4a）。在含有70%D 2 O的培养基中培养的铜绿假单胞菌的延时单细胞拉曼光谱显示CD/CH强度在孵育时间从0分钟增加到180分钟（图4b）单个微生物细胞中C-D丰度的增加表明D2O被掺入细胞内的氘代生物分子中...

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Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium

该协议通过D 2 O代谢的单细胞刺激拉曼散射成像在2.5小时内提供快速抗菌药敏试验（AST）测定。该方法适用于尿液或全血环境中的细菌，对于临床上的快速单细胞表型AST具有变革性。

通过受激拉曼散射成像对氘掺入单个细菌进行快速抗菌药敏试验

To slow and prevent the spread of antimicrobial resistant infections, rapid antimicrobial susceptibility testing (AST) is in urgent need to ...

可以在2.5小时内在尿液和血液中进行快速抗菌药敏试验，与传统的肉汤微量稀释方法相比，这被认为大大缩短了分析时间。它可以在复杂环境中监测细菌代谢活动，例如全血。首先，通过使用600纳米波长的光度计测量光密度来检查样品中的细菌浓度。为了达到每毫升第五个菌落形成单位（CFU）的8倍10的最终细胞浓度，请使用不含氘的正常MHB培养基稀释细菌溶液。通过涡旋混合细菌细胞后，在一个1.5毫升微管中除去300微升等分试样的细菌溶液，在一个1.5毫升微管中取出600微升等分试样的细菌溶液。然后将4.8微升抗生素储备溶液加入含有600微升细菌溶液的微管中，以达到每毫升8微克的最终抗生素浓度。将300微升含抗生素的细菌溶液加入不含抗生素的300微升等分试样中，以获得两倍稀释溶液，最终抗生素浓度为每毫升4微克。重复测试抗生素的两倍连续稀释，直到达到每毫升0.25微克的最低浓度。从最后一个微管中丢弃300微升溶液。将一根不含抗生素的试管分配给使用氘处理的阳性对照，将无氘的阴性对照分配。将细菌等分试样与含有MHB的抗生素培养基孵育一小时。同时，用100%含氘的MHB培养基制备抗生素的系列稀释液，浓度梯度与前面描述的相同。孵育一小时后，将700微升用100%含氘MHB培养基连续稀释的抗生素加入相同抗生素浓度的300微升抗生素预处理细菌中。通过上下移液几次使混合物均质化。将 700 微升不含抗生素的 100% 含 MHB 培养基加入 300 微升无抗生素细菌作为阳性对照。将 700 微升不含抗生素的 0% 氘含有 MHB 培养基加入 300 微升无抗生素细菌作为阴性对照。将所有微管在 37 摄氏度下孵育，每分钟 200 转 30 分钟。孵育后，将一毫升抗生素和氘处理过的细菌样品在6， 200倍g下在4摄氏度下离心5分钟。然后用纯净水清洗沉淀两次。将样品固定在10%体积的福尔马林溶液中，并将其储存在4摄氏度。通过使用600纳米波长的光度计测量光密度，检查新鲜制备的细菌样品中的大肠杆菌浓度。为了模拟临床尿路感染样本，将大肠杆菌样本加标到 10 毫升去识别的尿液样本中，以达到每毫升 10 至 6 CFU 的最终浓度。使用五微米过滤器过滤大肠杆菌加标尿液，并将过滤后的细菌溶液以300微升等分试样分成七个1.5毫升微管，将600微升等分试样分成一个1.5毫升微管。如前所述，在抗生素存在下进行氘掺入处理。为了模拟临床血流感染样本，在一毫升去识别化的人类血液中加入铜绿假单胞菌，以达到每毫升 10 至 6 CFU 的最终浓度。要裂解血液，请加入九毫升无菌纯净水。使用五微米过滤器过滤铜绿假单胞菌加标的血液。然后，通过在4摄氏度下以6， 200倍g离心5分钟，从过滤后的样品中收获细菌至1毫升体积。离心后，将300微升等分试样中的铜绿假单胞菌加标血液溶液分成七个1.5毫升微管和1个1.5毫升微管中的600微升等分试样细菌溶液，并在抗生素存在下进行氘掺入处理如前所述。样品制备时，用纯净水洗涤1毫升固定细菌溶液，并将洗涤后的细菌溶液以6， 200倍g离心5分钟，温度为4摄氏度。除去上清液，用灭菌水将细菌溶液富集至约20微升。将细菌溶液沉积在聚-L-赖氨酸涂层盖玻片上，与另一个盖玻片夹心，并密封样品。在SRS显微镜中，具有80兆赫兹重复率的可调飞秒激光器提供泵浦和斯托克斯激发激光器。斯托克斯光束由2.4兆赫兹的声光调制器调制。两束光束通过二向色镜组合在一起。然后将泵浦和斯托克斯光束引导到实验室制造的激光扫描显微镜中，该显微镜带有2D振镜进行激光扫描。60倍水镜将激光聚焦到样品上，油冷凝器从样品中收集信号。两个滤光片用于滤除斯托克斯光束，而泵浦光束由光电二极管检测，然后由锁相放大器提取受激拉曼信号。使用控制软件，输入泵浦波长并将其调谐为 852 纳米。将C到D振动频率调整为2，168波数，以使用SRS显微镜对细菌进行成像。使用功率计测量激光功率。通过调整激光输出前面的半波板，将样品处的泵浦激光器功率设置为 8 毫瓦，将斯托克斯激光在样品处的功率设置为 50 毫瓦。将标准样品DMSO d6放在样品台上，并使用60倍水浸物镜将泵浦和斯托克斯激光器聚焦在样品上。通过调整反射镜的螺钉，在空间上对齐泵浦和斯托克斯光束，并将两个光束引导到配备2D Galvo反射镜系统的正置显微镜中进行激光扫描。在软件控制面板中，将每个 SRS 图像设置为包含 200 x 200 像素，并将像素停留时间设置为 30 微秒。一幅图像的总采集时间约为1.2秒。将步长设置为 150 纳米，因此图像大小约为 30 x 30 平方微米。优化系统后，取出标准样品，将细菌样品放在60倍水浸物镜下的样品台上。开始细菌样本的SRS成像。为每个样本至少成像三个视野。孵育时间对氘掺入的影响通过CD和CH区域的自发拉曼显微光谱法测量。单个细菌的氘孵育时间的 CD 与 CH 强度比图显示，在孵育时间内，CD 与 CH 强度的关系从 0 增加到 180 分钟。铜绿假单胞菌的SRS成像在与庆大霉素和70%氘孵育时进行。进一步的定量统计分析表明，与没有庆大霉素治疗相比，细菌的CD信号在每毫升2微克或庆大霉素浓度时显着降低。临界强度阈值为0.60，得出的结论是，铜绿假单胞菌在每毫升2微克和更高浓度的庆大霉素下受到代谢抑制。在正常MHB培养基中，铜绿假单胞菌对庆大霉素的SC-MIC被确定为每毫升2微克，这在通过肉汤微量稀释法测定的MIC为每毫升4微克的一倍差异范围内。通过SRS成像对大肠杆菌加标尿液样本进行快速抗菌药敏试验（AST）。测定大肠杆菌加标尿液样品阿莫西林的SC-MIC为每毫升4微克，其敏感性读数与常规肉汤稀释法测定正常MHB培养基中纯大肠杆菌的MIC为每毫升8微克相同。通过SRS成像研究了加标人血铜绿假单胞菌快速AST的适用性。SRS图像的CD强度为每厘米2，168，主要由来自活细菌代谢氘掺入的细菌信号主导。血液中铜绿假单胞菌的SC-MIC为每毫升2微克，与正常生长培养基中铜绿假单胞菌的常规标准MIC结果吻合较好。根据临床和实验室标准协会的建议，用于抗菌药敏试验的细菌细胞数保持在每毫升10至第五个菌落形成单位的五倍左右。较高的细菌浓度会导致最小抑菌浓度的增加。将原位病原体鉴定和快速抗微生物药物敏感性检测诊断相结合，可以转化为临床，以便及时识别适当的抗菌剂以进行精确治疗。

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