Name: rapid antimicrobial susceptibility testing by stimulated raman scattering imaging of deuterium incorporation in a single bacterium
Uploaded: 2022-02-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01AI141439 ל- J.-X.C ו- M.S, ו- R35GM136223 ל- J.-X.C.

השימוש בדגימות דם אנושיות הוא בהתאם להנחיות ה- IRB של אוניברסיטת בוסטון והמכונים הלאומיים לבריאות (NIH). באופן ספציפי, הדגימות הן מבנק והן מזוהות לחלוטין. דגימות אלה אינן נחשבות לנבדקים אנושיים על ידי משרד מועצת הביקורת המוסדית (IRB) באוניברסיטת בוסטון.
1. הכנת חיידקים ותמיסת מלאי ...

ניתן להשיג AST מהיר על ידי הערכת התגובה של פעילות מטבולית חיידקית לטיפול אנטיביוטי באמצעות הדמיה מטבולית של SRS חד-תאי תוך 2.5 שעות מהדגימה לתוצאות SC-MIC. ניתן לזהות את התגובה של פעילות מטבולית חיידקית ורגישות מיקרוביאלית על ידי ניטור השילוב המטבולי של D2O לסינתזה של ביו-מולקולות באמצעות ה?...

עמידות מיקרוביאלית (AMR) היא איום עולמי הולך וגובר על הטיפול היעיל במחלות זיהומיות1. התחזית היא ש-AMR יגרום ל-10 מיליון מקרי מוות נוספים בשנה ולאובדן תוצר עולמי של 100 טריליון דולר עד 2050 אם לא תינקט פעולה למאבק בחיידקים עמידים לאנטיביוטיקה 1,2. זה מדגיש את הצורך הדחוף בשיטות אבחון מהירות וחדשניות לבדיקת רגישות לאנטיביוטיקה (AST) של חיידקים זיהומיים כדי להאט את הופעתם של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה ולהפחית את שיעור התמותה הקשור3. כדי להבטיח את התוצאה הקלינית הטובה ביותר האפשרית, חיוני להציג טיפול יעיל תוך 24 שעות. עם זאת, השיטה הנוכחית של תקן הזהב, כמו דיפוזיה של דיסק או שיטת דילול מרק, דורשת בדרך כלל לפחות 24 שעות עבור הליך קדם-דגירה עבור דגימות קליניות ועוד 16-24 שעות כדי להשיג את תוצאות הריכוז המעכב המינימלי (MIC). בסך הכל, שיטות אלה גוזלות זמן רב מכדי להנחות החלטה מיידית לטיפול במחלות זיהומיות במרפאה, מה שמוביל להופעתה והתפשטותה של עמידות מיקרוביאלית4.
שיטות AST גנוטיפיות, כגון טכניקות מבוססות תגובת שרשרת פולימראז (PCR)5, פותחו לזיהוי מהיר. טכניקות כאלה מודדות את הרצפים הגנטיים הספציפיים של ההתנגדות על מנת לספק תוצאות AST מהירות. הם אינם מסתמכים על תרבית תאים גוזלת זמן; עם זאת, נבדקים רק רצפים גנטיים ידועים ספציפיים עם עמידות. לכן, היישום שלה מוגבל מינים חיידקים שונים או מנגנונים שונים של התנגדות. כמו כן, הם לא יכולים לספק תוצאות MIC עבור החלטות טיפול 6,7. חוץ מזה, שיטות פנוטיפיות חדשניות עבור AST מהיר נמצאות בפיתוח כדי להתגבר על מגבלות אלה8, כולל התקנים מיקרופלואידיים 9,10,11,12,13, התקנים אופטיים14,15,16, AST פנוטיפי לכימות חומצות גרעין עותק מספר17,18, ושיטות ספקטרוסקופיות של ראמאן 19, 20,21,22,23,24. שיטות אלה מקצרות את הזמן להנחיית תוצאות AST, אולם רובן ישימות רק לחיידקים מבודדים, לא ישירות לדגימות קליניות, ועדיין דורשות קדם-דגירה ארוכת זמן.
בעבודה זו אנו מציגים שיטה לקביעה מהירה של רגישות חיידקים בשתן ובדם שלם באמצעות ניטור הפעילות המטבולית התאית על ידי הדמיית SRS. מים (H2O) לוקחים חלק ברוב המכריע של תהליכי סינתזה ביומולקולריים חיוניים בתאים חיים. כאיזוטופולוג של מים, באמצעות תגובת חילופי H/D מזורזת אנזימים בין אטום המימן הפעיל חמצון-חיזור ב-NADPH לבין אטום D ב-D2O, ניתן לשלב דאוטריום בביומסה בתוך תא25,26. תגובת סינתזה של חומצות שומן מתווכת על ידי דאוטריום שכותרתו NADPH. השילוב של D2O בתגובות של חומצות אמינו (AAs) גורם לייצור חלבון מפורק26 (איור 1). בדרך זו, ניתן להשתמש בביומולקולות המכילות קשר C-D שזה עתה סונתז בתאים מיקרוביאליים בודדים כסמן פעילות מטבולית כללית שיש לזהות. כדי לקרוא קשרי C-D מסונתזים דה נובו, ספקטרוסקופיית ראמאן, כלי אנליטי רב-תכליתי המספק מידע כימי ספציפי וכמותי של ביומולקולות, נמצאת בשימוש נרחב כדי לקבוע רגישות מיקרוביאלית ולהפחית באופן משמעותי את זמן הבדיקה למספר שעות27,28,29,30 . עם זאת, בשל היעילות הנמוכה האינהרנטית של תהליך פיזור ראמאן, הספקטרוסקופיה הספונטנית של ראמאן היא בעלת רגישות גילוי נמוכה. לכן, מאתגר להשיג תוצאות תמונה בזמן אמת באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן ספונטנית. פיזור ראמאן קוהרנטי (CRS), כולל פיזור ראמן קוהרנטי נגד סטוקס (CARS) ופיזור ראמאן מגורה (SRS), הגיע לרגישות גילוי גבוהה בגלל שדה האור הקוהרנטי כדי ליצור סדרי גודל גדולים יותר מאלה של ספקטרוסקופיית ראמאן ספונטנית, ובכך להפוך הדמיה כימית מהירה, ספציפית וכמותית ברמת התא הבודד 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.
כאן, בהתבסס על העבודה האחרונה שלנו40, אנו מציגים פרוטוקול לקביעה מהירה של הפעילות המטבולית והרגישות האנטי-מיקרוביאלית על ידי הדמיית femtosecond SRS C-D של שילוב D2O של חיידקים במדיום הרגיל, בשתן ובסביבת הדם כולה ברמת התא הבודד. הדמיית Femtosecond SRS מאפשרת לנטר את ריכוז ההשבתה של חילוף החומרים של תא בודד (SC-MIC) נגד אנטיביוטיקה ברמת החיידק היחיד תוך 2.5 שעות. תוצאות SC-MIC מאומתות על-ידי בדיקת MIC סטנדרטית באמצעות מיקרו-דילול מרק. השיטה שלנו ישימה לקביעת רגישות אנטי מיקרוביאלית של חיידקי דלקת בדרכי השתן (UTI) ופתוגנים של זיהום בזרם הדם (BSI) עם זמן בדיקה קצר בהרבה בהשוואה לשיטה הקונבנציונלית, מה שפותח את ההזדמנות ל- AST פנוטיפי מהיר במרפאה ברמת התא הבודד.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acousto-optic modulation</td>
			<td>Gooch&#38;Housego</td>
			<td>R15180-1.06-LTD</td>
			<td>Modulating stokes laser beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amoxicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8523-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ825/150m</td>
			<td>Block the stokes laser beam before the photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td>Cation adjustment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B12322</td>
			<td>Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tube with snap cap</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>149569B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daptomycin</td>
			<td>Acros</td>
			<td>A0386346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td></td>
			<td>151882</td>
			<td>Organic solvent to dissolve antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide-d6</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>156914</td>
			<td>Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BW 25113</td>
			<td>The Coli Genetic Stock Center</td>
			<td>7636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G4918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>SLSV025NB</td>
			<td>pore size 5 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version: 2.0.0-rc-69/1.52t</td>
			<td>Image processing and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubating orbital shaker set at 37 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97009-890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR452201-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSight DeepSee femtosecond pulsed laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Model: insight X3</td>
			<td>Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>Zurich Instrument</td>
			<td>HF2LI</td>
			<td>Demodulate the SRS signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil condenser</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-AAC</td>
			<td>NA 1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 47085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>S3994-01</td>
			<td>Detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene conical tube 15 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene filters</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>726-2520</td>
			<td>pore size 0.2 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-202-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 mL</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>14955459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Model: DU 530</td>
			<td>Measuring optical density at wavelength of 600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLANAPO/IR</td>
			<td>60&#215;, NA 1.2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid antimicrobial susceptibility testing by stimulated raman scattering imaging of deuterium incorporation in a single bacterium

כדי להאט ולמנוע התפשטות של זיהומים עמידים מיקרוביאלית, בדיקת רגישות אנטי-מיקרוביאלית מהירה (AST) זקוקה בדחיפות לקבוע כמותית את ההשפעות האנטי-מיקרוביאליות על פתוגנים. בדרך כלל לוקח ימים להשלים את ה- AST בשיטות קונבנציונליות המבוססות על התרבית הוותיקה, והן אינן פועלות ישירות עבור דגימות קליניות. כאן אנו מדווחים על שיטת AST מהירה המתאפשרת על ידי הדמיה מגורה של פיזור ראמאן (SRS) של שילוב מטבולי של תחמוצת דאוטריום (D2O). שילוב מטבולי של D2O בביומסה ועיכוב הפעילות המטבולית בעת חשיפה לאנטיביוטיקה ברמת החיידק הבודד מנוטרים על ידי הדמיית SRS. ריכוז ההשתקה של חילוף החומרים החד-תאי (SC-MIC) של חיידקים בעת חשיפה לאנטיביוטיקה יכול להתקבל לאחר סך של 2.5 שעות של הכנת דגימה וזיהויה. יתר על כן, שיטת AST מהירה זו ישימה ישירות על דגימות חיידקים בסביבות ביולוגיות מורכבות, כגון שתן או דם שלם. הדמיה מטבולית SRS של שילוב דאוטריום היא טרנספורמטיבית עבור AST פנוטיפי מהיר של תא יחיד במרפאה.

ההשפעה של זמן הדגירה על התאגדות דאוטריום נמדדת על-ידי מיקרוספקטרוסקופיית ראמאן ספונטנית באזור C-D (2070 עד 2250 ס"מ-1) ו-C-H (2,800 עד 3,100 ס"מ-1) (איור 4a). ספקטרום הראמן החד-תאי בעל קיטועי הזמן של P. aeruginosa בתרבית ב-70% D2O המכיל מדיום מראה עלייה בעוצמת CD/CH לאורך זמן הדגיר?...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium at JoVE.com

Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium

פרוטוקול זה מציג בדיקת רגישות אנטי-מיקרוביאלית מהירה (AST) תוך 2.5 שעות על ידי הדמיית פיזור ראמן מגורה בתא יחיד של חילוף החומרים של D2O. שיטה זו חלה על חיידקים בשתן או בסביבת דם שלמה, שהיא טרנספורמטיבית עבור AST פנוטיפי מהיר של תא יחיד במרפאה.

בדיקת רגישות אנטי-מיקרוביאלית מהירה על ידי הדמיה מגורה של פיזור ראמאן של שילוב דאוטריום בחיידק יחיד

To slow and prevent the spread of antimicrobial resistant infections, rapid antimicrobial susceptibility testing (AST) is in urgent need to ...

בדיקות רגישות אנטי מיקרוביאליות מהירות ניתן להשיג בתוך 2.5 שעות בשתן ובדם, אשר נחשב הפחתה עצומה בזמן הניתוח בהשוואה לשיטת microdilution מרק קונבנציונאלי. זה יכול לפקח על פעילות מטבולית חיידקית בסביבה מורכבת, כגון דם שלם. כדי להתחיל, בדוק את ריכוז החיידקים מהדגימות על ידי מדידת הצפיפות האופטית באמצעות פוטומטר באורך גל של 600 ננומטר.כדי להגיע לריכוז תאים סופי של שמונה פעמים 10 ליחידות יוצרות המושבה החמישית, או CFU, למיליליטר, דילל את תמיסת החיידקים באמצעות מדיום MHB רגיל ללא דאוטריום. לאחר ערבוב תאי החיידקים על ידי מערבולת, הסר 300 מיקרוליטר אליקוטים של תמיסת החיידקים בשבעה מיקרו-צינוריות של 1.5 מיליליטר ואליקוט של 600 מיקרוליטר של תמיסת החיידקים במיקרו-צינורית אחת של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן הוסיפו 4.8 מיקרוליטרים של תמיסת מלאי האנטיביוטיקה לתוך המיקרו-צינורית המכילה 600 מיקרוליטרים של תמיסת החיידקים כדי להשיג את הריכוז האנטיביוטי הסופי של שמונה מיקרוגרם למיליליטר.הוסף 300 מיקרוליטרים של תמיסת החיידקים עם אנטיביוטיקה לאליקוט של 300 מיקרוליטר של תמיסת החיידקים ללא אנטיביוטיקה כדי להשיג תמיסה מדוללת כפולה עם ריכוז אנטיביוטיקה סופי של ארבעה מיקרוגרם למיליליטר. חזור על דילול סדרתי כפול של אנטיביוטיקה הבדיקה עד הריכוז הנמוך ביותר של 0.25 מיקרוגרם למיליליטר הוא הגיע. השליכו 300 מיקרוליטרים של התמיסה מהמיקרו-צינורית האחרונה.להקצות צינור אחד ללא אנטיביוטיקה לבקרה החיובית עם טיפול דאוטריום, ואת השליטה השלילית ללא דאוטריום. לדגום את האליקוט החיידקי עם האנטיביוטיקה המכילה מדיום MHB למשך שעה אחת. בינתיים, הכינו דילול סדרתי של אנטיביוטיקה עם 100% דאוטריום המכיל מדיום MHB עם אותם שיפועי ריכוז כפי שתואר קודם לכן.לאחר שעה אחת של דגירה, הוסף 700 מיקרוליטרים של אנטיביוטיקה מדוללת באופן סדרתי עם 100% דאוטריום המכיל מדיום MHB ל -300 מיקרוליטרים של חיידקים אנטיביוטיים שטופלו מראש באותו ריכוז אנטיביוטיקה. הומוגניזציה של התערובת על ידי צנרת למעלה ולמטה מספר פעמים. הוסיפו 700 מיקרוליטרים של 100% דאוטריום ללא אנטיביוטיקה המכילים מדיום MHB ל-300 מיקרוליטרים של חיידקים נטולי אנטיביוטיקה כבקרה חיובית.הוסיפו 700 מיקרוליטרים של 0%דאוטריום ללא אנטיביוטיקה המכילים מדיום MHB ל-300 מיקרוליטרים של חיידקים נטולי אנטיביוטיקה כבקרה שלילית. לדגום את כל המיקרו-צינוריות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-200 סיבובים לדקה למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה של מיליליטר אחד של אנטיביוטיקה ודאוטריום מטופלים דגימת חיידקים ב 6, 200 פעמים גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.ואז לשטוף את הכדור פעמיים עם מים מטוהרים. תקן את הדגימות בתמיסת פורמלין בנפח של 10% לפי נפח, ואחסן אותן בארבע מעלות צלזיוס. בדוק את ריכוז Escherichia coli מדגימת החיידקים שזה עתה הוכנה על ידי מדידת הצפיפות האופטית באמצעות פוטומטר באורך גל של 600 ננומטר.כדי לחקות את דגימות הזיהום הקליניות בדרכי השתן, הגדילו את דגימת Escherichia coli ל-10 מיליליטר של דגימות שתן ללא זיהוי כדי להגיע לריכוז סופי של 10 עד 6 CFU למיליליטר. מסננים את השתן המחורץ Escherichia coli באמצעות מסנן של חמישה מיקרון, ומחלקים את תמיסת החיידקים המסוננים ב-300 מיקרוליטרים אליקוטים לשבעה מיקרו-צינוריות של 1.5 מיליליטר, ו-600 מיקרוליטר אליקוט במיקרו-צינורית אחת של 1.5 מיליליטר. לבצע טיפול משולב דאוטריום בנוכחות אנטיביוטיקה כפי שתואר קודם.כדי לחקות את דגימות הזיהום הקליניות בזרם הדם, ספייק Pseudomonas aeruginosa במיליליטר אחד של דם אנושי לא מזוהה כדי להגיע לריכוז סופי של 10 עד CFU השישי למיליליטר. כדי ללכלך את הדם, להוסיף תשעה מיליליטר של מים מטוהרים סטריליים. סנן את הדם המסולסל של Pseudomonas aeruginosa באמצעות מסנן של חמישה מיקרון.לאחר מכן קצור חיידקים מהדגימה המסוננת לנפח של מיליליטר אחד על ידי צנטריפוגה ב 6, 200 פעמים גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, חלקו את תמיסת הדם המדממת של Pseudomonas aeruginosa ב-300 מיקרוליטרים אליקוטים לשבעה מיקרו-צינוריות של 1.5 מיליליטר ואליקוט של 600 מיקרוליטר של תמיסת החיידקים במיקרו-צינורית אחת של 1.5 מיליליטר, ובצעו טיפול משולב דאוטריום בנוכחות אנטיביוטיקה כפי שתואר קודם לכן. להכנת הדגימה, לשטוף מיליליטר אחד של תמיסת חיידקים קבועים עם מים מטוהרים, צנטריפוגה תמיסת חיידקים שטף ב 6, 200 פעמים גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.הסר את supernatant ולהעשיר את הפתרון החיידקי כ 20 microliters עם מים מעוקרים. מניחים את תמיסת החיידקים על כיסוי מצופה פולי-L-ליזין, כורכים עם כיסוי נוספת ואוטמים את הדגימה. במיקרוסקופ SRS, לייזר פמטו-שניות הניתן לכוונון עם קצב חזרות של 80 מגה-הרץ מספק את המשאבה ואת לייזרי העירור של סטוקס.קרן סטוקס מווסתת על ידי אפנן אקוסטו-אופטי ב-2.4 מגה-הרץ. שתי הקורות משולבות זו בזו דרך מראה דיכרואית. לאחר מכן המשאבה ואלומות סטוקס מופנות למיקרוסקופ סריקת לייזר שנבנה במעבדה עם מראה Galvo דו-ממדית לסריקת לייזר.מטרת מים של פי 60 ממקדת את הלייזרים לדגימה ומעבה שמן אוסף את האות מהדגימה. שני מסננים משמשים לסינון קרן סטוקס, בעוד קרן המשאבה מזוהה על ידי פוטודיודה, ולאחר מכן אות הראמן המגורה מופק על ידי מגבר נעילה. באמצעות תוכנת הבקרה, הזן וכוונן את אורך הגל של המשאבה ל-852 ננומטר.התאם את תדר הרטט C ל-D למספר גל של 2, 168 כדי לצלם חיידקים באמצעות מיקרוסקופ SRS. מדוד את עוצמת הלייזר באמצעות מד כוח. הגדר את עוצמת לייזר המשאבה בדגימה לשמונה מילי-וואט, ואת עוצמת הלייזר של סטוקס בדגימה ל-50 מילי-וואט על-ידי התאמת צלחת חצי הגל לפני פלט הלייזר.הנח את הדגימה הסטנדרטית DMSO d6 על שלב הדגימה, והשתמש במטרת טבילה במים פי 60 כדי למקד את המשאבה ולייזרים של סטוקס על הדגימה. על ידי כוונון הברגים של מראות ההשתקפות, יישרו מרחבית את המשאבה ואת אלומות סטוקס והכוונו את שתי הקרניים למיקרוסקופ זקוף המצויד במערכת מראות Galvo דו-ממדית לסריקת לייזר. בלוח הבקרה של התוכנה, הגדר כל תמונת SRS כך שתכיל 200 על 200 פיקסלים וזמן השהייה של הפיקסלים הוא 30 מיקרו-שניות.זמן הרכישה הכולל של תמונה אחת הוא כ-1.2 שניות. הגדר את גודל הצעד ל- 150 ננומטר, כך שגודל התמונה הוא כ- 30 על 30 מיקרומטר בריבוע. לאחר אופטימיזציה של המערכת, הוציאו את הדגימה הסטנדרטית והניחו את דגימת החיידקים על שלב הדגימה מתחת ליעד טבילה במים של 60x.התחל את הדמיית SRS של דגימות חיידקים. תמונה של לפחות שלושה שדות ראייה עבור כל דוגמה. ההשפעה של זמן הדגירה על התאגדות דאוטריום נמדדת על ידי מיקרוספקטרוסקופיית ראמאן ספונטנית באזורי CD ו-CH.יחס עוצמת ה-CD על פני CH מתווה על פני זמן הדגירה של דאוטריום עבור חיידקים בודדים הראה עלייה בעוצמת CD על פני CH על פני זמן הדגירה מאפס ל-180 דקות. הדמיית SRS של Pseudomonas aeruginosa נערכה עם דגירה עם גנטמיצין ו-70% דאוטריום. הניתוח הסטטיסטי הכמותי הנוסף הראה כי אותות CD של חיידקים היו נמוכים משמעותית בשני מיקרוגרם למיליליטר, או ריכוז גנטמיצין גבוה יותר מאשר ללא טיפול בגנטמיצין.סף עוצמת הניתוק ב-0.60 הגיע למסקנה כי Pseudomonas aeruginosa עוכב מטבולית בשני מיקרוגרם למיליליטר ובריכוזים גבוהים יותר של גנטמיצין. ה-SC-MIC עבור Pseudomonas aeruginosa נגד גנטמיצין במדיום MHB רגיל נקבע כשני מיקרוגרם למיליליטר, שהיה בטווח ההפרש החד פעמי עם MIC של ארבעה מיקרוגרם למיליליטר שנקבע על ידי שיטת המיקרודילוציה של המרק. בדיקת רגישות אנטי-מיקרוביאלית מהירה, או AST, של דגימות שתן מסוג Escherichia coli בוצעה על ידי הדמיית SRS.דגימת השתן של Escherichia coli נגד אמוקסיצילין נקבעה כארבעה מיקרוגרם למיליליטר, שיש להם את אותה קריאת רגישות כמו MIC של שמונה מיקרוגרם למיליליטר בשיטת דילול המרק הקונבנציונלית עבור Escherichia coli טהור במדיום MHB רגיל. הישימות של AST מהיר של Pseudomonas aeruginosa spikeed בדם אנושי נחקרה על ידי הדמיית SRS. עוצמת התקליטור של תמונת ה-SRS ב-2, 168 אחוזים נשלטה על ידי אותות חיידקיים שמקורם בשילוב דאוטריום מטבולי של חיידקים חיים.ה- SC-MIC עבור Pseudomonas aeruginosa בדם נקבע להיות שני מיקרוגרם למיליליטר, מה שהסכים היטב עם תוצאת ה- MIC הסטנדרטית המקובלת עבור Pseudomonas aeruginosa במדיום הגידול הרגיל. מספר תאי החיידקים המשמשים לבדיקת רגישות מיקרוביאלית נשמר בערך חמש פעמים 10 עד למושבה החמישית היוצרת יחידות למיליליטר, כפי שמומלץ על ידי מכון התקנים הקליניים והמעבדתיים. ריכוז חיידקים גבוה יותר יכול להוביל לעלייה בריכוז המעכב המינימלי.שילוב של זיהוי פתוגנים באתרו ואבחון מהיר של בדיקות רגישות מיקרוביאלית יכול להיות בעל פוטנציאל גדול לתרגום למרפאה המאפשרת זיהוי בזמן של חומרים אנטי מיקרוביאליים מתאימים לטיפול מדויק.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS)

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS

דיפרנציאל הדמיה של מבנים ביולוגיים עם פיזור כפליים-התהודה אנטי סטוקס קוהירנט ראמאן (CARS)

Coherent Raman imaging techniques have seen a dramatic increase in activity over the past decade due to their promise to enable label-free optical imaging ...

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

Quantitation וניתוח של היווצרות של HO-Endonuclease מגורה טרנסלוקציות כרומוזומלית ידי Strand-סינגל חישול ב Saccharomyces cerevisiae</em

Genetic variation is frequently mediated by genomic rearrangements that arise through interaction between dispersed repetitive elements present in every ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

אמיד מימן / דאוטריום Exchange &amp; MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית ניתוח של הפעלת Pak2

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

הדמית מולקולה הבודדה של רגולציה גנטית<em&gt; בחי</em&gt; שימוש הפעלת Cotranslational ידי מחשוף (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

בידוד מהיר וטיהור של מיטוכונדריה להשתלה על ידי דיסוציאציה רקמות ודיפרנציאל סינון

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

יישום של מערכת קוהרנטית אנטי סטוקס פיזור ראמאן (CARS) על טי: ספיר OPO לייזר מבוסס תקן לייזר מיקרוסקופ סריקה

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...