Name: rapid antimicrobial susceptibility testing by stimulated raman scattering imaging of deuterium incorporation in a single bacterium
Uploaded: 2022-02-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium at JoVE.com

Bu çalışma J.-X.C ve M.S.'ye NIH R01AI141439 ve J.-X.C.'ye R35GM136223 tarafından desteklenmiştir.

İnsan kan örneklerinin kullanımı, Boston Üniversitesi IRB ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) yönergelerine uygundur. Spesifik olarak, örnekler bir bankadan alınmıştır ve tamamen tanımlanmamıştır. Bu örnekler, Boston Üniversitesi'ndeki kurumsal inceleme kurulu (IRB) ofisi tarafından insan denekler olarak kabul edilmez.
1. Bakteri ve antibiyotik stok çözeltisinin hazırlanması
<ol><li>Antibiyotik (gentamisin sülfat veya amoksisilin) stok çözeltisini, sterile1x fosfat...

Hızlı AST, tek hücreli SRS metabolik görüntüleme kullanılarak antibiyotik tedavisine bakteriyel metabolik aktivitenin yanıtının numuneden SC-MIC sonuçlarına 2,5 saat içinde değerlendirilmesiyle elde edilebilir. Bakteriyel metabolik aktivitenin ve antimikrobiyal duyarlılığın yanıtı, C-D bağlarının SRS görüntülemesi kullanılarak biyomolekül sentezi için D2O'nun metabolik katılımının izlenmesiyle tespit edilebilir. Su, canlı hücrelerde her yerde kullanıldığından, SRS metabol...

Antimikrobiyal direnç (AMR), bulaşıcı hastalığın etkili tedavisi için büyüyen küresel bir tehdittir1. AMR'nin, antibiyotiğe dirençli bakterilerle mücadele için herhangi bir eylemde bulunulmaması durumunda 2050 yılına kadar yılda 10 milyon ölüme ve 100 trilyon dolarlık küresel GSYİH kaybına neden olacağı tahmin edilmektedir 1,2. Bu, antibiyotiğe dirençli bakterilerin ortaya çıkışını yavaşlatmak ve ilgili ölüm oranını azaltmak için enfeksiyöz bakterilerin antibiyotik duyarlılık testi (AST) için hızlı ve yenilikçi tanı yöntemlerine olan acil ihtiyacı vurgulamaktadır3. Mümkün olan en iyi klinik sonucu sağlamak için, 24 saat içinde etkili tedavinin uygulanması çok önemlidir. Bununla birlikte, disk difüzyonu veya et suyu seyreltme yöntemi gibi mevcut altın standart yöntem, klinik numuneler için ön inkübasyon prosedürü için genellikle en az 24 saat ve minimum inhibitör konsantrasyon (MIC) sonuçlarını elde etmek için ek 16-24 saat gerektirir. Genel olarak, bu yöntemler klinikte bulaşıcı hastalık tedavisi için acil bir karara rehberlik etmek için çok zaman alıcıdır ve bu da antimikrobiyal direncin ortaya çıkmasına ve yayılmasına yol açar4.
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı teknikler5 gibi genotipik AST yöntemleri, hızlı tespit için geliştirilmiştir. Bu tür teknikler, hızlı AST sonuçları sağlamak için spesifik direnç genetik dizilerini ölçer. Zaman alıcı hücre kültürüne güvenmezler; Bununla birlikte, sadece direnci olan bilinen spesifik genetik diziler test edilir. Bu nedenle, uygulaması çeşitli bakteri türleri veya farklı direnç mekanizmaları ile sınırlıdır. Ayrıca, tedavi kararları için MIC sonuçları veremezler 6,7. Ayrıca, bu sınırlamaların üstesinden gelmek için yeni fenotipik yöntemler geliştirilmektedir8, mikroakışkan cihazlar 9,10,11,12,13, optik cihazlar14,15,16, nükleik asitlerin kopya numarası 17,18'i ölçen fenotipik AST ve Raman spektroskopik yöntemler 19, 20,21,22,23,24. Bu yöntemler AST sonuçlarını yönlendirmek için gereken süreyi kısaltır, ancak çoğu doğrudan klinik numunelere değil, yalnızca bakteriyel izolatlara uygulanabilir ve yine de uzun süreli ön inkübasyon gerektirir.
Bu çalışmada, SRS görüntüleme ile hücresel metabolik aktivitenin izlenmesi yoluyla idrar ve tam kandaki bakterilerin duyarlılığının hızlı bir şekilde belirlenmesi için bir yöntem sunuyoruz. Su (H2O), canlı hücrelerdeki temel biyomoleküler sentez süreçlerinin büyük çoğunluğunda yer alır. Bir su izotopologu olarak, NADPH'deki redoks-aktif hidrojen atomu ile D2O'daki D atomu arasındaki enzim katalizörlü H / D değişim reaksiyonu yoluyla, döteryum bir hücre25,26 içindeki biyokütleye dahil edilebilir. Deuterated yağ asidi sentez reaksiyonu, NADPH etiketli döteryum tarafından aracılık edilir. D2O'nun amino asitlerin (AA'lar) reaksiyonlarına dahil edilmesi, deuterated protein üretimi26 ile sonuçlanır (Şekil 1). Bu şekilde, tek mikrobiyal hücrelerde yeni sentezlenen C-D bağı içeren biyomoleküller, tespit edilecek genel bir metabolik aktivite belirteci olarak kullanılabilir. De novo sentezlenmiş C-D bağlarını okumak için, biyomoleküllerin spesifik ve kantitatif kimyasal bilgilerini sağlayan çok yönlü bir analitik araç olan Raman spektroskopisi, antimikrobiyal duyarlılığı belirlemek ve test süresini birkaç saate düşürmek için yaygın olarak kullanılmaktadır27,28,29,30 . Bununla birlikte, Raman saçılma işleminin doğal düşük verimliliği nedeniyle, spontan Raman spektroskopisi düşük algılama hassasiyetine sahiptir. Bu nedenle, spontan Raman spektroskopisi kullanarak gerçek zamanlı görüntü sonuçları elde etmek zordur. Tutarlı anti-Stokes Raman saçılması (CARS) ve uyarılmış Raman saçılması (SRS) dahil olmak üzere tutarlı Raman saçılması (CRS), spontan Raman spektroskopisininkinden daha büyük büyüklük sıraları üretmek için tutarlı ışık alanı nedeniyle yüksek algılama hassasiyetine ulaşmıştır, böylece tek hücre seviyesinde yüksek hızlı, spesifik ve kantitatif kimyasal görüntüleme 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.
Burada, en son çalışmamız40'a dayanarak, bakterilerin normal ortamda, idrarda ve tam kan ortamında tek hücre düzeyinde dahil edilmesinin femtosaniye SRS C-D görüntülemesi ilemetabolik aktivitenin ve antimikrobiyal duyarlılığın hızlı bir şekilde belirlenmesi için bir protokol sunuyoruz. Femtosaniye SRS görüntüleme, 2.5 saat içinde tek bakteri seviyesinde antibiyotiklere karşı tek hücre metabolizması inaktivasyon konsantrasyonunun (SC-MIC) izlenmesini kolaylaştırır. SC-MIC sonuçları, et suyu mikrodilüsyonu yoluyla standart MIC testi ile doğrulanır. Yöntemimiz, bakteri üriner sistem enfeksiyonu (İYE) ve kan dolaşımı enfeksiyonu (BSI) patojenlerinin antimikrobiyal duyarlılığını, geleneksel yönteme göre çok daha kısa bir tahlil süresi ile belirlemek için uygulanabilir olup, klinikte tek hücre düzeyinde hızlı fenotipik AST için fırsat yaratmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acousto-optic modulation</td>
			<td>Gooch&#38;Housego</td>
			<td>R15180-1.06-LTD</td>
			<td>Modulating stokes laser beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amoxicillin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8523-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ825/150m</td>
			<td>Block the stokes laser beam before the photodiode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td>Cation adjustment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B12322</td>
			<td>Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tube with snap cap</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>149569B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daptomycin</td>
			<td>Acros</td>
			<td>A0386346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td></td>
			<td>151882</td>
			<td>Organic solvent to dissolve antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide-d6</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>156914</td>
			<td>Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BW 25113</td>
			<td>The Coli Genetic Stock Center</td>
			<td>7636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G4918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>SLSV025NB</td>
			<td>pore size 5 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Version: 2.0.0-rc-69/1.52t</td>
			<td>Image processing and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubating orbital shaker set at 37 &#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97009-890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BR452201-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSight DeepSee femtosecond pulsed laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td>Model: insight X3</td>
			<td>Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>Zurich Instrument</td>
			<td>HF2LI</td>
			<td>Demodulate the SRS signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil condenser</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-AAC</td>
			<td>NA 1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC 47085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>S3994-01</td>
			<td>Detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene conical tube 15 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene filters</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>726-2520</td>
			<td>pore size 0.2 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-202-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 10 mL</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>14955459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Model: DU 530</td>
			<td>Measuring optical density at wavelength of 600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLANAPO/IR</td>
			<td>60&#215;, NA 1.2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid antimicrobial susceptibility testing by stimulated raman scattering imaging of deuterium incorporation in a single bacterium

Antimikrobiyal dirençli enfeksiyonların yayılmasını yavaşlatmak ve önlemek için, patojenler üzerindeki antimikrobiyal etkileri nicel olarak belirlemek için hızlı antimikrobiyal duyarlılık testine (AST) acil ihtiyaç duyulmaktadır. AST'nin uzun süreli kültüre dayanan geleneksel yöntemlerle tamamlanması genellikle günler alır ve doğrudan klinik örnekler için çalışmazlar. Burada, döteryum oksit (D2O) metabolik katılımının uyarılmış Raman saçılması (SRS) görüntülemesi ile sağlanan hızlı bir AST yöntemi sunulmuştur. D2O'nun biyokütleye metabolik katılımı ve tek bakteri düzeyinde antibiyotiklere maruz kalındığında metabolik aktivite inhibisyonu SRS görüntüleme ile izlenir. Antibiyotiklere maruz kaldıktan sonra bakterilerin tek hücreli metabolizma inaktivasyon konsantrasyonu (SC-MIC), toplam 2.5 saatlik numune hazırlama ve tespitinden sonra elde edilebilir. Ayrıca, bu hızlı AST yöntemi, idrar veya tam kan gibi karmaşık biyolojik ortamlardaki bakteri örneklerine doğrudan uygulanabilir. Döteryum katılımının SRS metabolik görüntülemesi, klinikte hızlı tek hücreli fenotipik AST için dönüştürücüdür.

Kuluçka süresinin döteryum infüzyonu üzerindeki etkisi, C-D (2070 ila 2250 cm-1) ve C-H (2.800 ila 3.100 cm-1) bölgesindeki spontan Raman mikrospektroskopisi ile ölçülür (Şekil 4a). % 70 D2O içeren orta maddede kültürlenen P. aeruginosa'nın hızlandırılmış tek hücreli Raman spektrumu, kuluçka süresi boyunca CD / CH yoğunluğunu 0'dan 180 dakikaya çıkardığını göstermektedir. (Şekil 4b) Tek m...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium at JoVE.com

Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium

Bu protokol, D 2O metabolizmasının tek hücreli uyarılmış Raman saçılma görüntülemesi ile 2.5 saat içinde hızlı antimikrobiyal duyarlılık testi (AST) testi sunar. Bu yöntem, klinikte hızlı tek hücreli fenotipik AST için dönüştürücü olan idrar veya tam kan ortamındaki bakteriler için geçerlidir.

Tek Bir Bakteride Döteryum Birleşmesinin Uyarılmış Raman Saçılma Görüntülemesi ile Hızlı Antimikrobiyal Duyarlılık Testi

To slow and prevent the spread of antimicrobial resistant infections, rapid antimicrobial susceptibility testing (AST) is in urgent need to ...

Hızlı antimikrobiyal duyarlılık testi, idrar ve kanda 2,5 saat içinde elde edilebilir, bu da geleneksel et suyu mikrodilüsyon yöntemine kıyasla analiz süresinde muazzam bir azalma olarak kabul edilir. Tam kan gibi karmaşık bir ortamda bakteriyel metabolik aktiviteyi izleyebilir. Başlamak için, optik yoğunluğu 600 nanometre dalga boyunda bir fotometre ile ölçerek numunelerden bakteri konsantrasyonunu kontrol edin.Mililitre başına sekiz kez 10 ila beşinci Koloni Oluşturma Birimleri veya CFU'luk bir nihai hücre konsantrasyonuna ulaşmak için, döteryum içermeyen normal MHB ortamını kullanarak bakteriyel çözeltiyi seyreltin. Bakteri hücrelerini vorteks ile karıştırdıktan sonra, yedi adet 1.5 mililitrelik mikrotüp içinde bakteri çözeltisinin 300 mikrolitrelik alikotunu ve 1.5 mililitrelik bir mikrotüpte bakteriyel çözeltinin 600 mikrolitrelik alikotunu çıkarın. Daha sonra, mililitre başına sekiz mikrogramlık nihai antibiyotik konsantrasyonunu elde etmek için 600 mikrolitre bakteriyel çözelti içeren mikrotüpe 4.8 mikrolitre antibiyotik stok çözeltisi ekleyin.Mililitre başına dört mikrogramlık son antibiyotik konsantrasyonu ile iki kat seyreltilmiş bir çözelti elde etmek için antibiyotiksiz bakteriyel çözeltinin 300 mikrolitrelik bir alikotuna antibiyotikli 300 mikrolitre bakteri çözeltisi ekleyin. Test antibiyotiklerinin iki kat seri seyreltilmesini, mililitre başına 0.25 mikrogramlık en düşük konsantrasyona ulaşılana kadar tekrarlayın. Son mikrotüpten çözeltinin 300 mikrolitresini atın.Antibiyotik içermeyen bir tüpü döteryum tedavisi ile pozitif kontrole, negatif kontrole döteryum olmadan tahsis edin. Bakteriyel aliquot'u MHB ortamı içeren antibiyotik ile bir saat boyunca inkübe edin. Bu arada, daha önce tarif edildiği gibi aynı konsantrasyon gradyanlarına sahip% 100 döteryum içeren MHB ortamı ile antibiyotiklerin seri seyreltilmesini hazırlayın.Bir saatlik inkübasyondan sonra, aynı antibiyotik konsantrasyonunda 300 mikrolitre antibiyotik önceden işlenmiş bakteriye% 100 döteryum içeren% 100 döteryum ile seri olarak seyreltilmiş 700 mikrolitre antibiyotik ekleyin. Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak karışımı homojenize edin. Pozitif kontrol olarak MHB ortamı içeren 700 mikrolitre antibiyotiksiz% 100 döteryum ila 300 mikrolitre antibiyotik içermeyen bakteri ekleyin.Negatif kontrol olarak MHB ortamı içeren 700 mikrolitre antibiyotiksiz% 0 döteryum ila 300 mikrolitre antibiyotik içermeyen bakteri ekleyin. Tüm mikrotüpleri 37 santigrat derecede ve 30 dakika boyunca dakikada 200 rotasyonda inkübe edin. Kuluçkadan sonra, bir mililitre antibiyotik ve döteryum ile muamele edilmiş bakteri örneğini dört santigrat derecede beş dakika boyunca 6.200 kez g'de santrifüj edin.Daha sonra peleti arıtılmış suyla iki kez yıkayın. Numuneleri hacimce %10'luk bir hacimde sabitleyin ve formalin çözeltisini dört santigrat derecede saklayın. Optik yoğunluğu 600 nanometre dalga boyunda bir fotometre ile ölçerek taze hazırlanmış bakteri örneğinden Escherichia coli konsantrasyonunu kontrol edin.Klinik idrar yolu enfeksiyonu örneklerini taklit etmek için, Escherichia coli örneğini 10 mililitre tanımlanmamış idrar örneğine yükseltin ve mililitre başına 10 ila altı CFU'luk bir nihai konsantrasyona ulaşın. Escherichia coli çivili idrarını beş mikronluk bir filtre kullanarak filtreleyin ve filtrelenmiş bakteri çözeltisini 300 mikrolitrelik alikotlarda yedi adet 1.5 mililitrelik mikrotüpe ve 600 mikrolitrelik bir alikotu 1.5 mililitrelik bir mikrotüpte bölün. Daha önce tarif edildiği gibi antibiyotik varlığında döteryum birleştirme tedavisi gerçekleştirin.Klinik kan dolaşımı enfeksiyonu örneklerini taklit etmek için, mililitre başına 10 ila altıncı CFU'luk bir nihai konsantrasyona ulaşmak için bir mililitre tanımlanmamış insan kanındaki Pseudomonas aeruginosa'yı yükseltin. Kanı lize etmek için dokuz mililitre steril arıtılmış su ekleyin. Pseudomonas aeruginosa çivili kanını beş mikronluk bir filtre kullanarak filtreleyin.Daha sonra, filtrelenmiş numuneden bakterileri, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 6.200 kez g'de santrifüjleme yoluyla bir mililitrelik bir hacme kadar hasat edin. Santrifüjlemeden sonra, Pseudomonas aeruginosa çivili kan çözeltisini 300 mikrolitrelik alikotta yedi adet 1.5 mililitrelik mikrotüpe ve 1.5 mililitrelik bir mikrotüpte bakteriyel çözeltinin 600 mikrolitrelik alikotuna bölün ve daha önce tarif edildiği gibi antibiyotiklerin varlığında döteryum birleştirme tedavisi gerçekleştirin. Numune hazırlama için, bir mililitre sabit bakteri çözeltisini arıtılmış suyla yıkayın ve yıkanmış bakteri çözeltisini dört santigrat derecede beş dakika boyunca 6.200 kez g'de santrifüj edin.Süpernatantı çıkarın ve bakteriyel çözeltiyi sterilize edilmiş suyla yaklaşık 20 mikrolitreye zenginleştirin. Bakteriyel çözeltiyi poli-L-lizin kaplı bir kapak camı üzerine koyun, başka bir kapak camı ile sandviç yapın ve numuneyi kapatın. SRS mikroskobunda, 80 megahertz tekrarlama hızına sahip ayarlanabilir bir femtosaniye lazer, pompayı ve Stokes uyarma lazerlerini sağlar.Stokes ışını 2.4 megahertz'de bir akusto-optik modülatör tarafından modüle edilir. İki ışın, dikroik bir ayna aracılığıyla kolineredeyse birleştirilir. Daha sonra pompa ve Stokes ışınları, lazer tarama için 2D Galvo aynalı laboratuvar yapımı bir lazer tarama mikroskobuna yönlendirilir.60x su hedefi, lazerleri numuneye odaklar ve bir yağ kondenseri numuneden gelen sinyali toplar. Stokes ışınını filtrelemek için iki filtre kullanılırken, pompa ışını bir fotodiyot tarafından algılanır, daha sonra uyarılan Raman sinyali bir kilitleme amplifikatörü tarafından çıkarılır. Kontrol yazılımını kullanarak, pompa dalga boyunu 852 nanometreye girin ve ayarlayın.SRS mikroskobu kullanarak bakterileri görüntülemek için C'den D'ye titreşim frekansını 2.168 dalga numarasına ayarlayın. Bir güç ölçer kullanarak lazer gücünü ölçün. Lazer çıkışının önündeki yarım dalga plakasını ayarlayarak numunedeki pompa lazerinin gücünü sekiz miliwatt'a ve numunedeki Stokes lazerinin gücünü 50 miliwatt'a ayarlayın.Standart DMSO d6 numunesini numune aşamasına yerleştirin ve pompayı ve Stokes lazerlerini numuneye odaklamak için 60x suya daldırma hedefi kullanın. Yansıma aynalarının vidalarını ayarlayarak, pompayı ve Stokes ışınlarını uzamsal olarak hizalayın ve iki ışını lazer tarama için 2D Galvo ayna sistemi ile donatılmış dik bir mikroskopa yönlendirin. Yazılım kontrol panelinde, her SRS görüntüsünü 200 x 200 piksel içerecek ve piksel bekleme süresini 30 mikrosaniye olarak ayarlayın.Bir görüntü için toplam elde etme süresi yaklaşık 1,2 saniyedir. Adım boyutunu 150 nanometre olarak ayarlayın, böylece görüntü boyutu yaklaşık 30 x 30 mikrometre karedir. Sistemi optimize ettikten sonra, standart numuneyi çıkarın ve bakteri numunesini 60x suya daldırma hedefi altında numune aşamasına koyun.Bakteri örneklerinin SRS görüntülemesini başlatın. Her örnek için en az üç görüş alanı görüntüleyin. Kuluçka süresinin döteryum kaynaşması üzerindeki etkisi, CD ve CH bölgelerinde spontan Raman mikrospektroskopisi ile ölçülür.Tek bakteriler için döteryum inkübasyon süresi üzerindeki CD over CH yoğunluk oranı grafiği, inkübasyon süresi boyunca CH yoğunluğu üzerinde CD'nin sıfırdan 180 dakikaya yükseldiğini göstermiştir. Pseudomonas aeruginosa'nın SRS görüntülemesi gentamisin ve %70 döteryum ile inkübasyon üzerine yapıldı. Daha ileri nicel istatistiksel analiz, bakterilerin CD sinyallerinin mililitre başına iki mikrogramda veya gentamisin tedavisi olmadan daha yüksek gentamisin konsantrasyonunda önemli ölçüde daha düşük olduğunu göstermiştir.0.60'taki kesme yoğunluğu eşiği, Pseudomonas aeruginosa'nın mililitre başına iki mikrogram ve daha yüksek gentamisin konsantrasyonlarında metabolik olarak inhibe edildiği sonucuna varmıştır. Normal bir MHB ortamında gentamisine karşı Pseudomonas aeruginosa için SC-MIC'nin, et suyu mikrodilüsyon yöntemi ile belirlenen mililitre başına dört mikrogramlık MIC ile mililitre başına dört mikrogram ile bir kat fark aralığında olan mililitre başına iki mikrogram olduğu belirlenmiştir. Escherichia coli çivili idrar örneklerinin Hızlı Antimikrobiyal Duyarlılık Testi veya AST, SRS görüntüleme ile gerçekleştirildi.Amoksisilin'e karşı Escherichia coli çivili idrar örneği için SC-MIC'nin, normal MHB ortamında saf Escherichia coli için geleneksel et suyu seyreltme yöntemi ile mililitre başına sekiz mikrogramlık MIC ile aynı duyarlılık okumasına sahip olan mililitre başına dört mikrogram olduğu belirlenmiştir. İnsan kanında çivilenmiş Pseudomonas aeruginosa'nın hızlı AST'sinin uygulanabilirliği SRS görüntüleme ile araştırıldı. SRS görüntüsünün santimetre başına 2.168'deki CD yoğunluğuna, canlı bakterilerin metabolik döteryum katılımından kaynaklanan bakteri sinyalleri hakimdi.Kandaki Pseudomonas aeruginosa için SC-MIC'nin mililitre başına iki mikrogram olduğu belirlendi ve bu da normal büyüme ortamındaki Pseudomonas aeruginosa için geleneksel standart MIC sonucuyla iyi bir şekilde uyuştu. Antimikrobiyal duyarlılık testi için kullanılan bakteriyel hücre sayısı, Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü tarafından önerildiği gibi, mililitre başına beşinci koloni oluşturan birimlere yaklaşık beş kat 10 ila 10 arasında tutulur. Daha yüksek bakteri konsantrasyonu, minimal inhibitör konsantrasyonunda bir artışa neden olabilir.İn situ patojen tanımlaması ve hızlı antimikrobiyal duyarlılık testi tanısının birleştirilmesi, hassas tedavi için uygun antimikrobiyal ajanların zamanında tanımlanmasına izin veren bir kliniğe çeviri için büyük bir potansiyel olabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Yağ Asidi Kantitatif Phosphoproteomics Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS)

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS

Çifte rezonans Tutarlı Anti-Stokes Raman saçılımı (CARS) Biyolojik Yapıların Diferansiyel Görüntüleme

Coherent Raman imaging techniques have seen a dramatic increase in activity over the past decade due to their promise to enable label-free optical imaging ...

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

HO-Endonuclease Oluşum kantitasyonu ve Analiz Tavlama Tek-Strand kromozomal Translokasyonlar Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

Genetic variation is frequently mediated by genomic rearrangements that arise through interaction between dispersed repetitive elements present in every ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Pak2 Etkinleştirme Amid Hidrojen / Döteryum Alım Satım &amp; MALDI-TOF Kütle Spektrometre Analiz

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Gen Yönetmelik Tek molekül Görüntüleme<em&gt; In vivo</em&gt; Dilinim tarafından Cotranslational Aktivasyon (CoTrAC) kullanma

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Doku Ayrışma Ve Diferansiyel süzülerek Nakli İçin Mitokondri Of Rapid İzolasyon ve saflaştırma

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Sapphire ve OPO Lazer Bazlı Standart Lazer Tarama Mikroskobu: Bir Ti bir Tutarlı Anti-Stokes Raman saçılması (CARS) Sisteminin Uygulanması

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...