Name: loss-of-function approach in the embryonic chick retina by using tol2 transposon-mediated transgenic expression of artificial micrornas
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs at JoVE.com

تم توفير نواقل pT2K-CAGGS و pCAGGS-T2TP من قبل يوشيكو تاكاهاشي (جامعة كيوتو ، كيوتو ، اليابان) وكويتشي كاواكامي (المعهد الوطني لعلم الوراثة ، ميشيما ، اليابان) ، على التوالي. نشكر مايكل بربر أوغلو على قراءته الحاسمة للمخطوطة. تم دعم هذا العمل بمنح من الجمعية الملكية ومجلس أبحاث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية (BBSRC) (المملكة المتحدة) إلى M.N.

1. بناء متجهات تعبير miRNA
ملاحظة: تم تحسين إجراءات إنشاء متجهات تعبير miRNA (الخطوات 1.1-1.3 ، 1.5-1.6.) لمجموعة تعبير miRNA ، مجموعة تعبير Block-iT Pol II miR RNA مع EmGFP ، كما هو موضح سابقا15،16. توفر المجموعة متجه التعبير المصمم للسماح بتعبير miRNA (pcDNA6.2-GW / EmGFP-miRNA) ...

<ol>
	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).</li><li>Funahashi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Pax-5+in+the+regulation+of+a+mid-hindbrain+organizer's+activity.">Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer's activity.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).</li><li>Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+methods+in+chick+embryos.">In ovo electroporation methods in chick embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).</li><li>Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+retroviral+pathogenesis+by+RNA+interference.">Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference.</a> Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).</li><li>Katahira, T., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+chick+embryos+with+a+vector-based+small+interfering+RNA+system.">Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).</li><li>Harpavat, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RCAS-RNAi:+a+loss-of-function+method+for+the+developing+chick+retina.">RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina.</a> BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation.">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Methods. 24, 43-48 (2001).</li><li>Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+DNA+transposon+as+a+natural+mutator:+the+medaka+fish+Tol2+element+contributes+to+genetic+variation+without+recognizable+traces.">Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces.</a> Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).</li><li>Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+functional+transposase+of+the+Tol2+element,+an+Ac-like+element+from+the+Japanese+medaka+fish,+and+its+transposition+in+the+zebrafish+germ+lineage.">Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).</li><li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excision+of+the+Tol2+transposable+element+of+the+medaka+fish+Oryzias+latipes+in+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis.">Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Gene. 338 (1), 93-98 (2004).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Developmental Biology. 2 (2), 616-624 (2007).</li><li>Kawakami, K., Noda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+the+Tol2+element,+an+Ac-like+element+from+the+Japanese+medaka+fish+Oryzias+latipes,+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells.</a> Genetics. 166 (2), 895-899 (2004).</li><li>Hou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+knockdown+of+target+gene+expression+by+tetracycline+regulated+transcription+of+double+strand+RNA.">Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 53, 69-75 (2011).</li><li>Nakamoto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nel+positively+regulates+the+genesis+of+retinal+ganglion+cells+by+promoting+their+differentiation+and+survival+during+development.">Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).</li><li>Nakamoto, M., Nakamoto, C., Mao, C. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. 8, 91-108 (2020).</li><li>BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&amp;title=BLOCK-iT&amp;trade">https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&amp;title=BLOCK-iT&amp;trade</a> (2021)</li><li>Flanagan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase+fusions+of+ligands+or+receptors+as+in+situ+probes+for+staining+of+cells,+tissues,+and+embryos.">Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos.</a> Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Matsuhashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+gene,+nel,+encoding+a+M(r)+93+K+protein+with+EGF-like+repeats+is+strongly+expressed+in+neural+tissues+of+early+stage+chick+embryos.">New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos.</a> Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).</li><li>Matsuhashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+gene,+nel,+encoding+a+Mr+91+K+protein+with+EGF-like+repeats+is+strongly+expressed+in+neural+tissues+of+early+stage+chick+embryos.">New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos.</a> Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+guidance+of+retinal+axons+by+a+tectal+lamina-specific+glycoprotein+Nel.">In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).</li><li>Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+Nel,+a+Thrombospondin-1-like+glycoprotein+involved+in+neural+development+and+functions.">Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).</li><li>Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nell2+regulates+the+contralateral-versus-ipsilateral+visual+projection+as+a+domain-specific+positional+cue.">Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue.</a> Development. 146 (4), (2019).</li><li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+from+transcriptionally+disabled+retroviral+vectors.">Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).</li></ol>

يوفر هذا البروتوكول دليلا مفصلا لإسكات الجينات في شبكية العين النامية عن طريق التعبير المعدل وراثيا عن miRNAs الاصطناعية باستخدام التثقيب الكهربائي للبيض ونظام Tol2 transposon.
العوامل التالية لها أهمية حاسمة في أداء هذه التقنية بنجاح. أولا ، من الأهمية بمكان استخدام تسلسلات mi...

شبكية الفقاريات هي نظام نموذجي مهم لدراسة التطور العصبي. على الرغم من موقعها المحيطي ، فإن شبكية العين هي امتداد تشريحي وتنموي للجهاز العصبي المركزي ، ويمثل العصب البصري ، الذي يتكون من محاور عصبية لخلايا العقدة الشبكية ، مسلك داخل الجهاز العصبي المركزي. تتمتع شبكية العين بمزايا كبيرة كنظام نموذجي لدراسة الآلية الجزيئية للتطور العصبي: إنها كبيرة وتتطور بسرعة. لديها أوجه تشابه هيكلية ووظيفية مع شبكية العين البشرية. يمكن الوصول إليه بشكل كبير للتصور والتلاعب التجريبي. تمت دراسة الآليات الجزيئية لتكاثر الخلايا وتمايزها ، والتشكل ، وتوجيه المحور العصبي أثناء التطور العصبي على نطاق واسع باستخدام شبكية الدجاج.
تم استخدام التثقيب الكهربائي في البويضات بنجاح على مدى العقدين الماضيين لإدخال جينات خارج الرحم في الخلايا في جنين الفرخ النامي. تسمح هذه التقنية بوضع العلامات على الخلايا النامية ، وتتبع مصير الخلية ، وتتبع هجرة الخلايا والمسالك المحورية ، بالإضافة إلى التعبير الجيني خارج الرحم للتحليل في الجسم الحي لوظيفة الجينات. تم تأسيس شروط التثقيب الكهربائي في البويضة للتعبير الجيني خارج الرحم الفعال في أجنة الكتاكيتبشكل جيد 1،2،3.
على الرغم من هذه المزايا ، كان عدم وجود تقنية مستقرة لفقدان الوظيفة لدراسات وظيفة الجينات بمثابة قيد تقني رئيسي لجنين الفرخ. في حين أن أجنة الكتاكيت المكهربة بالحمض النووي الريبي الصغير المتداخل (siRNAs)4 أو ناقلات التعبير للحمض النووي الريبي قصير الدبوس (shRNAs)5 تظهر ضربة قاضية للجين المستهدف ، فإن قمع الجينات في هذه الأساليب عابر لأن التأثيرات تختفي بمجرد أن تفقد الخلايا الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي المدخل. يمكن تحقيق قمع جيني أكثر استقرارا عن طريق توصيل siRNAs إلى أجنة الكتاكيت بواسطة RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) التكرار الطرفي الطويل (LTR) مع مستقبل Splice) نظام الفيروس القهقري6. يندمج الناقل الفيروسي في جينوم المضيف ، ويتم التعبير عن الجينات خارج الرحم بثبات. ومع ذلك ، لا يمكن للفيروس القهقري الاندماج إلا في جينوم الخلايا المنقسمة خلال المرحلة الانقسامية (M) من دورة الخلية ، مما قد يفرض قيودا على مراحل النمو و / أو أنواع الخلايا التي يمكن تطبيق نهج فقدان الوظيفة عليها. بالإضافة إلى ذلك ، يبدو التعبير عن جينات التحوير بواسطة RCAS أبطأ وأقل قوة من ذلك الناجم عن التثقيب الكهربائي للبيض 7.
الترانسبوزونات هي عناصر وراثية تنتقل من موقع على الجينوم إلى آخر. عنصر Tol2 هو عضو في عائلة العناصر القابلة للنقل hAT ويحتوي على جين داخلي يشفر ترانسبوزاز يحفز تفاعل الترانسبوزون لعنصر Tol28. عندما يتم إدخال ناقل البلازميد الذي يحمل شريط تعبير جيني محاط بتسلسل الطرفين الأيسر والأيمن لعناصر Tol2 (200 bp و 150 bp ، على التوالي) في خلايا الفقاريات مع بنية تعبير Tol2 transposase ، يتم استئصال كاسيت التعبير من البلازميد ودمجه في جينوم المضيف ، والذي يدعم تعبيرا مستقرا للجين خارج الرحم (الشكل 1). لقد ثبت أن عنصر Tol2 القابل للنقل يمكن أن يحفز نقل الجينات بكفاءة عالية في أنواع الفقاريات المختلفة ، بما في ذلك الزرد9،10 ، والضفادع11 ، والكتاكيت 12 ، والفئران 13 ، وبالتالي فهي طريقة مفيدة للتحوير الجيني والطفرات الإدراجية. تم استخدام نظام ترانسبوزون Tol2 بنجاح للضربة القاضية الشرطية للجين المستهدف عن طريق التكامل الجيني ل siRNA الذي تتم معالجته من الحمض النووي الريبي14 الطويل المزدوج الشريط.
يصف هذا البروتوكول نهج فقدان الوظيفة في جنين الفرخ الذي يتضمن إدخال الحمض النووي الريبي الدقيق الاصطناعي (miRNAs) بواسطة نظام Tol2 transposon15,16. في هذا النهج ، يتم استنساخ شريط تعبير لعلامة EmGFP (بروتين الفلورسنت الأخضر الزمردي) و miRNAs الاصطناعية ضد الجين المستهدف في ناقل ترانسبوزون Tol2. ثم يتم إدخال بنية ترانسبوزون Tol2 في شبكية العين الجنينية مع بناء تعبير Tol2 transposase بواسطة التثقيب الكهربائي للبيض. في خلايا الشبكية المنقولة ، يحفز transposase استئصال كاسيت التعبير من ناقل transposon واندماجه في الكروموسومات المضيفة ، مما يؤدي إلى التعبير المستقر عن miRNAs وبروتين EmGFP. في دراساتنا السابقة ، نجحنا في التخلص من تعبير نيل ، وهو بروتين سكري خارج الخلية يتم التعبير عنه في الغالب في الجهاز العصبي ، في شبكية العين النامية (انظر النتائج التمثيلية). تشير نتائجنا إلى أنه يمكن تحقيق قمع الجينات المستقر والفعال في البويضات بهذه التقنية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 G needle, 2&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89219-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP-TAG kit A and AP-TAG kit B</td>
			<td>GenHunter Corp</td>
			<td>Q201 and Q202</td>
			<td>Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block-iT RNAi Designer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA 10 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C115CB cables</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>C115CB</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;254</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C117 cables</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>C117</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;252</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles)</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td>1 mm O.D. 0.75 mm I.D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUY21 square wave electroporator</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethanolamine (pH 9.8)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>Kurl</td>
			<td>B-Lab-600-110</td>
			<td>https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>CUY580</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrodes</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY611P3-1</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromax DH10B</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18290-015</td>
			<td>Electrocompetent E. coli cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)</td>
			<td>Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gooseneck fiber light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGene 6 transfection reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (50 &#956;L)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>20715</td>
			<td>Hamilton Cat No&#160; 80901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heavy mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>330760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Homoarginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H10007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige (Japan)</td>
			<td>MM3</td>
			<td>http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Shutter Instrument</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Nitrophenylphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>20-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS-T2TP vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F566S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer (Optional)</td>
			<td>Parker</td>
			<td></td>
			<td>Pressure microinjection system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Plasmid maxiprep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2K-CAGGS vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC tubing</td>
			<td>VWR (UK)</td>
			<td>228-3830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9007-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K493600</td>
			<td>Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

loss-of-function approach in the embryonic chick retina by using tol2 transposon-mediated transgenic expression of artificial micrornas

لطالما كانت شبكية العين كتكوت نظاما نموذجيا مهما في علم الأعصاب التنموي ، مع مزايا تشمل حجمها الكبير وتطورها السريع وإمكانية الوصول إليها للتصور والتلاعب التجريبي. ومع ذلك، كان القيد التقني الرئيسي هو عدم وجود نهج قوية لفقدان الوظيفة لتحليل وظائف الجينات. يصف هذا البروتوكول منهجية إسكات الجينات في شبكية العين النامية التي تنطوي على التعبير الوراثي للحمض النووي الريبي الدقيق الاصطناعي (miRNAs) باستخدام نظام Tol2 transposon. في هذا النهج ، يتم إدخال بلازميد Tol2 transposon الذي يحتوي على شريط تعبير لعلامة EmGFP (بروتين الفلورسنت الأخضر الزمردي) وتسلسلات اصطناعية قبل miRNA ضد جين مستهدف في شبكية العين الجنينية مع تعبير Tol2 transposase بناء بواسطة في التثقيب الكهربائي للبيض . في خلايا الشبكية المنقولة ، يحفز transposase استئصال كاسيت التعبير من ناقل transposon واندماجه في الكروموسومات المضيفة ، مما يؤدي إلى التعبير المستقر عن miRNAs وبروتين EmGFP. في دراستنا السابقة ، أثبتنا أن التعبير عن Nel ، وهو بروتين سكري يمارس وظائف متعددة في التطور العصبي ، يمكن قمعه بشكل كبير في شبكية العين النامية باستخدام هذه التقنية. تشير نتائجنا إلى أن هذه المنهجية تحفز قمعا مستقرا وقويا للتعبير الجيني وبالتالي توفر نهجا فعالا لفقدان الوظيفة لدراسات تطور الشبكية.

بناء ترانسبوزون Tol2 ترانسبوزون للتعبير عن miRNAs الاصطناعية ضد نيل Nel (Neural Epidermal growth factor (EGF) -Like ؛ المعروف أيضا باسم Nell2) هو بروتين سكري خارج الخلية. لديها أوجه تشابه هيكلية مع thrombospondin-1 ويتم التعبير عنها في الغالب في الجهاز العصبي20,21. لقد أثبت...

Watch this Scientific Journal Video about Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs at JoVE.com

Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs

لقد طورنا نهجا جديدا لفقدان الوظيفة يتضمن إدخال تسلسل الحمض النووي الريبي الدقيق الاصطناعي ودمجه الجينومي في أجنة الفرخ باستخدام التثقيب الكهربائي في البويضات ونظام ترانسبوزون Tol2. توفر هذه التقنية منهجية قوية ومستقرة لضربة قاضية للجينات لدراسات وظيفة الجينات أثناء التطوير.

نهج فقدان الوظيفة في شبكية العين الجنينية باستخدام التعبير الوراثي بوساطة Tol2 transposon للحمض النووي الريبي الدقيق الاصطناعي

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and ...

توفر هذه المنهجية نهج فقدان الوظيفة لدراسات تطور الشبكية في الفرخ. تدعم هذه التقنية القمع السريع والمستمر للجينات المستهدفة في منطقة معينة من شبكية العين. يمكن أيضا تطبيق هذا النهج على أجزاء أخرى من جنين الفرخ ، بما في ذلك الأنسجة العصبية وغير العصبية.بالنسبة للتثقيب الكهربائي للبيض ، قم بإعداد محلول أخضر سريع بنسبة 0.25٪ عن طريق إذابة 25 ملليغرام من Fast Green FCF في 10 ملليلتر من PBS ، ثم قم بتصفية المحلول باستخدام مرشح حقنة 0.2 ميكرون. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول حقن كوكتيل الحمض النووي عن طريق خلط بلازميد الزمرد GFP microRNA مع بلازميد تعبير Tol2 transposase بنسبة اثنين إلى واحد. ثم أضف محلول Fast Green المحضر إلى كوكتيل الحمض النووي بنسبة واحد إلى 10 لتصور المنطقة المحقونة.بعد ذلك ، قم بإعداد جهاز الحقن المجهري. يتكون الجهاز من حقنة هاملتون ، وإبرة قياس 18 بوصة بوصتين ، وأنبوب كلوريد البولي فينيل بطول سنتيمترين ، وإبرة ماصة دقيقة. املأ حقنة هاملتون بالزيت المعدني الثقيل ، ثم قم بتوصيل إبرة قياس 18 بالمحقنة ، واملأ المساحة الداخلية للإبرة بالزيت عن طريق الضغط على مكبس المحقنة.بعد ذلك ، قم بتوصيل أنبوب البولي فينيل كلوريد بنهاية الإبرة ، واملأ الأنبوب بالزيت. قم بتوصيل إبرة الماصة الدقيقة المسحوبة بالأنبوب. ثم تحت المجهر التشريحي باستخدام ملقط دقيق ، قم بقطع طرف الإبرة إلى قطر 10 إلى 20 ميكرومتر لعمل فتحة صغيرة.املأ الإبرة بأكملها بالزيت. بعد ذلك ، ضع خمسة ميكرولترات من كوكتيل الحمض النووي الملون على طبق بتري. تحت المجهر التشريحي ، ضع طرف إبرة الماصة الدقيقة في محلول الحمض النووي على طبق بتري ، وارسم المحلول ببطء في الإبرة.بعد توازن الضغط داخل الإبرة وخارجها ، أخرج طرف الإبرة من محلول الحمض النووي ، واحتفظ بها مغمورة في برنامج تلفزيوني معقم في دورق صغير حتى الحقن. ثم لإعداد جهاز التثقيب الكهربائي ، قم بتعيين زوج من الأقطاب الكهربائية البلاتينية بإحكام مع حامل قطب كهربائي على معالج دقيق. اضبط التباعد بين طرف الأقطاب الكهربائية إلى ملليمترين ، وقم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمولد نبض موجة مربعة مع كابلات.بعد ذلك ، بالنسبة للحقن المجهري للحمض النووي ، قم بإزالة بيضة White Leghorn المخصبة من الحاضنة وامسح سطح البويضة بورق مناديل مبللة بالإيثانول بنسبة 70٪. ثم قم بتوصيل إبرة قياس 18 بحقنة سعة 10 ملليلتر ، وأدخل الإبرة من خلال الطرف الحاد للبيضة ، بزاوية لأسفل لتجنب إتلاف صفار البيض. بعد سحب ملليلتر إلى ثلاثة ملليلتر من الألبومين من البويضة ، أغلق الفتحة بقطعة من شريط سكوتش ، وقم بشموع البيضة بالضوء لضمان فصل الجنين وغشاء vitelline عن القشرة.بعد ذلك ، باستخدام ملقط ، قم بإزالة قطعة من قشرة البيضة من أعلى البويضة ، وفضح الجنين. لا تقم بنافذة أكثر من خمس بيضات في وقت واحد لمنع جفاف الأجنة أثناء التثقيب الكهربائي. أدخل طرف الإبرة في الحويصلة البصرية من جانبها القريب بزاوية 45 درجة ، وقم بحقن كوكتيل الحمض النووي عن طريق الضغط ببطء على المكبس حتى يملأ المحلول الأزرق اللون التجويف.اسحب الإبرة ، ثم ضع طرفها مرة أخرى في برنامج تلفزيوني. للتثقيب الكهربائي ، اضبط جهد النبض على 15 فولت ، وطول النبضة على 15 مللي ثانية ، والفاصل الزمني للنبض على 915 مللي ثانية ، وعدد النبض على خمسة. بعد إضافة بضع قطرات من HBSS على غشاء vitelline فوق الجنين ، استخدم المعالج الدقيق لخفض الأقطاب الكهربائية في HBSS عموديا على المحور الأمامي الخلفي للجنين.ضع الأقطاب الكهربائية على جانبي الحويصلة البصرية ، وتأكد من أن الأقطاب الكهربائية لا تلمس الجنين أو الأوعية الدموية ، ثم ضع المجالات الكهربائية النبضية. بعد اكتمال التثقيب الكهربائي ، قم بإزالة الأقطاب الكهربائية ، ونظف الأقطاب الكهربائية برفق باستخدام قطعة قطن معقمة مبللة بالماء لتجنب تراكم الألبومين. أغلق النافذة بشريط سكوتش ، وأعد احتضان الجنين حتى مرحلة النمو المطلوبة.أدى نقل تسلسلات ما قبل الحمض النووي الريبي الميكروي الفردية إلى خلايا Nel AP التي تعبر عن خلايا HEK293T إلى قمع كبير لتعبير Nel من خلال التركيبات ضد النيوكليوتيدات 482 إلى 502 ، و 910 إلى 930 ، و 2461 إلى 2481. أدى تسلسل تسلسل microRNA إلى تحسين كفاءة الضربة القاضية بشكل كبير. أظهرت جميع المجموعات الثلاث أنشطة قمع محسنة مقارنة بتسلسلات ما قبل الحمض النووي الريبي الميكروي الفردية غير المقيدة.لوحظ قمع قوي بعد 13 يوما على الأقل من النقل. عندما تم نقل بنية Nel pre-microRNA التي تستهدف النيوكليوتيدات 482 إلى 502 و 2461 إلى 2481 مع ناقل تعبير transposase إلى شبكية العين ، تم تقليل تعبير Nel في ظهارة صبغة الشبكية بشكل كبير في خلايا التعبير عن GFP الزمردي في اليوم الجنيني 4.5. في الأجنة البالغة من العمر ثمانية أيام ، انخفض تعبير نيل أيضا في خلايا العقدة الشبكية.في المقابل ، لم يتأثر تعبير نيل في شبكية العين بإدخال الحمض النووي الريبي الميكروي الضابط. باتباع هذا الإجراء ، يمكن فحص التأثيرات على قمع الجينات المستهدفة باستخدام طرق مختلفة مثل فحوصات تكاثر الخلايا وتمايزها ، وموت الخلايا ، وتتبع الخلايا والمحور العصبي.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

الحبل الشوكي الكهربية ثانيا : خارج الخلية التصنيع الكهربائي شفط

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

قياس نشاط رابطة الدول المستقلة عناصر التنظيم في الشبكية بواسطة الماوس Electroporation يزدرع

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

في التعبير البيضة من الرنا الميكروي في بطني الدماغ المتوسط ​​الفرخ

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation من الدماغ المؤخر لتتبع مسارات محور عصبي والأهداف متشابك في الجنين الفرخ

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

جيل من الفئران المعدلة وراثيا من قبل موضعيا<em&gt; في الرحم</em&gt; التثقيب الكهربائي و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; ضوء بارد الفرز

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

تقييم الأوعية الدموية التجديد في الجهاز العصبي المركزي عن طريق الماوس الشبكية

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA تسلسل تحليل التفاضلية التعبير الجيني في Electroporated الفرخ الجنينية الحبل الشوكي

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning

باستخدام مخطط كهربية لتقييم وظيفة في القوارض الشبكية وتأثيرات واقية من بعيد الاطراف الدماغية شروط مسبقة

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

التصوير النشاط العصبي في القشرة الأولية Somatosensory باستخدام Thy1-GCaMP6s الفئران المحورة وراثيا

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

الجمع بين أوبتوجينيتيكس ميكرورناس الاصطناعية لتوصيف "تأثيرات الجينات ضربة قاضية" في وظيفة Presynaptic داخل "الدوائر العصبية سليمة"

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...