Name: loss-of-function approach in the embryonic chick retina by using tol2 transposon-mediated transgenic expression of artificial micrornas
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs at JoVE.com

pT2K-CAGGS- og pCAGGS-T2TP-vektorerne blev venligst leveret af henholdsvis Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Kyoto, Japan) og Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Mishima, Japan). Vi takker Michael Berberoglu for hans afgørende læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Royal Society and Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (UK) til M.N.

1. Konstruktion af miRNA-ekspressionsvektorer
BEMÆRK: Procedurerne til konstruktion af miRNA-ekspressionsvektorer (trin 1.1-1.3, 1.5-1.6.) er optimeret til miRNA-ekspressionssættet, Block-iT Pol II miR RNA-ekspressionssæt med EmGFP, som tidligere beskrevet15,16. Sættet indeholder ekspressionsvektoren designet til at tillade miRNA-ekspression (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), en kontrolvektor (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativ...

<ol>
	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).</li><li>Funahashi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Pax-5+in+the+regulation+of+a+mid-hindbrain+organizer's+activity.">Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer's activity.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).</li><li>Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+methods+in+chick+embryos.">In ovo electroporation methods in chick embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).</li><li>Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+retroviral+pathogenesis+by+RNA+interference.">Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference.</a> Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).</li><li>Katahira, T., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+chick+embryos+with+a+vector-based+small+interfering+RNA+system.">Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).</li><li>Harpavat, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RCAS-RNAi:+a+loss-of-function+method+for+the+developing+chick+retina.">RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina.</a> BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation.">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Methods. 24, 43-48 (2001).</li><li>Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+DNA+transposon+as+a+natural+mutator:+the+medaka+fish+Tol2+element+contributes+to+genetic+variation+without+recognizable+traces.">Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces.</a> Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).</li><li>Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+functional+transposase+of+the+Tol2+element,+an+Ac-like+element+from+the+Japanese+medaka+fish,+and+its+transposition+in+the+zebrafish+germ+lineage.">Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).</li><li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excision+of+the+Tol2+transposable+element+of+the+medaka+fish+Oryzias+latipes+in+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis.">Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Gene. 338 (1), 93-98 (2004).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Developmental Biology. 2 (2), 616-624 (2007).</li><li>Kawakami, K., Noda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+the+Tol2+element,+an+Ac-like+element+from+the+Japanese+medaka+fish+Oryzias+latipes,+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells.</a> Genetics. 166 (2), 895-899 (2004).</li><li>Hou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+knockdown+of+target+gene+expression+by+tetracycline+regulated+transcription+of+double+strand+RNA.">Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 53, 69-75 (2011).</li><li>Nakamoto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nel+positively+regulates+the+genesis+of+retinal+ganglion+cells+by+promoting+their+differentiation+and+survival+during+development.">Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).</li><li>Nakamoto, M., Nakamoto, C., Mao, C. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. 8, 91-108 (2020).</li><li>BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&amp;title=BLOCK-iT&amp;trade">https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&amp;title=BLOCK-iT&amp;trade</a> (2021)</li><li>Flanagan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase+fusions+of+ligands+or+receptors+as+in+situ+probes+for+staining+of+cells,+tissues,+and+embryos.">Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos.</a> Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Matsuhashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+gene,+nel,+encoding+a+M(r)+93+K+protein+with+EGF-like+repeats+is+strongly+expressed+in+neural+tissues+of+early+stage+chick+embryos.">New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos.</a> Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).</li><li>Matsuhashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+gene,+nel,+encoding+a+Mr+91+K+protein+with+EGF-like+repeats+is+strongly+expressed+in+neural+tissues+of+early+stage+chick+embryos.">New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos.</a> Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+guidance+of+retinal+axons+by+a+tectal+lamina-specific+glycoprotein+Nel.">In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).</li><li>Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+Nel,+a+Thrombospondin-1-like+glycoprotein+involved+in+neural+development+and+functions.">Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).</li><li>Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nell2+regulates+the+contralateral-versus-ipsilateral+visual+projection+as+a+domain-specific+positional+cue.">Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue.</a> Development. 146 (4), (2019).</li><li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+from+transcriptionally+disabled+retroviral+vectors.">Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).</li></ol>

Denne protokol giver en detaljeret vejledning til genhæmning i den udviklende chick retina ved transgen ekspression af kunstige miRNA'er ved anvendelse af i ovo elektroporation og Tol2 transposon systemet.
Følgende faktorer er af afgørende betydning for at udføre denne teknik med succes. For det første er det afgørende at bruge miRNA-sekvenser, der er bekræftet for at udøve robuste knockdown-effekter. Før du anvender dem til in ovo-elektroporation , skal du teste ind...

Hvirveldyrets nethinde er et vigtigt modelsystem til at studere neural udvikling. På trods af sin perifere placering er nethinden anatomisk og udviklingsmæssigt en forlængelse af centralnervesystemet, og synsnerven, der består af axoner af retinale ganglionceller, repræsenterer en kanal i centralnervesystemet. Kyllingens nethinden har betydelige fordele som modelsystem til at studere den molekylære mekanisme for neural udvikling: Den er stor og udvikler sig hurtigt; det har strukturelle og funktionelle ligheder med den menneskelige nethinden; Det er meget tilgængeligt for visualisering og eksperimentelle manipulationer. Molekylære mekanismer for celleproliferation og differentiering, morfogenese og axonvejledning under neural udvikling er blevet grundigt undersøgt ved hjælp af kyllingens nethinden.
I ovo er elektroporation blevet anvendt med succes i løbet af de sidste to årtier til at indføre ektopiske gener i celler i det udviklende kyllingembryo. Denne teknik muliggør mærkning af udviklende celler, sporing af celleskæbne og sporing af cellemigration og axonkanaler samt ektopisk genekspression til in vivo-analyse af genfunktion. Betingelserne for in ovo elektroporation for effektiv ektopisk genekspression i kyllingembryoner er veletablerede 1,2,3.
På trods af disse fordele havde manglen på en stabil tab-af-funktion-teknik til undersøgelser af genfunktion været en stor teknisk begrænsning af kyllingeembryoet. Mens kyllingeembryoner elektroporeret med små interfererende RNA'er (siRNA'er)4 eller ekspressionsvektorer for korte hårnåle-RNA'er (shRNA'er)5 viser knockdown af det målrettede gen, er genundertrykkelse i disse tilgange forbigående, fordi virkningerne forsvinder, når cellerne mister de indførte RNA'er eller DNA'er. En mere stabil genundertrykkelse kan opnås ved at levere siRNA'er i kyllingembryoner af et RCAS (R-eplikation Competent Avian sarkom-leukosevirus (ASLV) lang terminal gentagelse (LTR) med en S-plice-acceptor) retrovirussystem6. Den virale vektor integreres i værtsgenomet, og de ektopiske gener udtrykkes stabilt. Imidlertid kan retrovirus kun integreres i genomet af delende celler under den mitotiske (M) fase af cellecyklussen, hvilket kan pålægge en begrænsning på udviklingsstadierne og / eller celletyperne, for hvilke denne tab-af-funktion-tilgang kan anvendes. Desuden forekommer ekspression af transgener ved RCAS langsommere og mindre robust end den, der induceres af in ovo elektroporation7.
Transposoner er genetiske elementer, der bevæger sig fra et sted på genomet til et andet. Tol2-elementet er medlem af hAT-transponerbar elementfamilie og indeholder et internt gen, der koder for en transposase, der katalyserer transposonreaktionen af Tol2-elementet8. Når en plasmidvektor, der bærer en genekspressionskassette flankeret af sekvenserne i venstre og højre ende af Tol2-elementerne (henholdsvis 200 bp og 150 bp) indføres i hvirveldyrceller med en Tol2-transposaseekspressionskonstruktion, udskæres ekspressionskassetten fra plasmidet og integreres i værtsgenomet, hvilket understøtter en stabil ekspression af det ektopiske gen (figur 1). Det har vist sig, at det transponerbare Tol2-element kan inducere gentransponering meget effektivt i forskellige hvirveldyrarter, herunder zebrafisk9,10, frøer 11, kyllinger 12 og mus 13, og dermed er en nyttig metode til transgenese og insertionel mutagenese. Tol2-transposonsystemet er med succes blevet anvendt til betinget knockdown af et målgen ved genomisk integration af siRNA, der behandles fra langt dobbeltstrenget RNA14.
Denne protokol beskriver en tab-af-funktion tilgang i kyllingembryoet, der involverer introduktion af kunstige mikroRNA'er (miRNA'er) af Tol2-transposonsystemet15,16. I denne tilgang klones en ekspressionskassette til EmGFP-markøren (smaragdgrønt fluorescerende protein) og kunstige miRNA'er mod et målgen til en Tol2-transposonvektor. Tol2-transposonkonstruktionen introduceres derefter i den embryonale chick retina med en Tol2 transposaseekspressionskonstruktion ved in ovo elektroporation. I de transfekterede retinale celler katalyserer transposasen udskæringen af ekspressionskassetten fra transposonvektoren og dens integration i værtskromosomer, hvilket fører til den stabile ekspression af miRNA'er og EmGFP-proteinet. I vores tidligere undersøgelser lykkedes det os at slå ekspressionen af Nel, et ekstracellulært glycoprotein, der overvejende udtrykkes i nervesystemet, ned i den udviklende chick retina (se repræsentative resultater). Vores resultater indikerer, at stabil og effektiv genundertrykkelse kan opnås i ovo ved denne teknik.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 G needle, 2&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89219-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP-TAG kit A and AP-TAG kit B</td>
			<td>GenHunter Corp</td>
			<td>Q201 and Q202</td>
			<td>Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block-iT RNAi Designer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA 10 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C115CB cables</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>C115CB</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;254</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C117 cables</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>C117</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;252</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles)</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td>1 mm O.D. 0.75 mm I.D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUY21 square wave electroporator</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethanolamine (pH 9.8)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>Kurl</td>
			<td>B-Lab-600-110</td>
			<td>https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>CUY580</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrodes</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY611P3-1</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromax DH10B</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18290-015</td>
			<td>Electrocompetent E. coli cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)</td>
			<td>Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gooseneck fiber light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGene 6 transfection reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (50 &#956;L)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>20715</td>
			<td>Hamilton Cat No&#160; 80901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heavy mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>330760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Homoarginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H10007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige (Japan)</td>
			<td>MM3</td>
			<td>http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Shutter Instrument</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Nitrophenylphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>20-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS-T2TP vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F566S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer (Optional)</td>
			<td>Parker</td>
			<td></td>
			<td>Pressure microinjection system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Plasmid maxiprep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2K-CAGGS vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC tubing</td>
			<td>VWR (UK)</td>
			<td>228-3830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9007-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K493600</td>
			<td>Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

loss-of-function approach in the embryonic chick retina by using tol2 transposon-mediated transgenic expression of artificial micrornas

Kyllingens nethinden har længe været et vigtigt modelsystem inden for udviklingsneurobiologi med fordele, herunder dens store størrelse, hurtige udvikling og tilgængelighed til visualisering og eksperimentelle manipulationer. Den største tekniske begrænsning havde imidlertid været manglen på robuste tab-af-funktion-tilgange til genfunktionsanalyser. Denne protokol beskriver en metode til genhæmning i den udviklende chick retina, der involverer transgen ekspression af kunstige mikroRNA'er (miRNA'er) ved hjælp af Tol2 transposonsystemet. I denne tilgang indføres et Tol2-transposonplasmid, der indeholder en ekspressionskassette til EmGFP-markøren (smaragdgrønt fluorescerende protein) og kunstige præ-miRNA-sekvenser mod et målgen i den embryonale chick retina med en Tol2-transposaseekspressionskonstruktion ved in ovo-elektroporation . I de transfekterede retinale celler katalyserer transposasen udskæringen af ekspressionskassetten fra transposonvektoren og dens integration i værtskromosomer, hvilket fører til den stabile ekspression af miRNA'er og EmGFP-proteinet. I vores tidligere undersøgelse har vi vist, at ekspressionen af Nel, et glycoprotein, der udøver flere funktioner i neural udvikling, kan undertrykkes signifikant i den udviklende chick nethinden ved hjælp af denne teknik. Vores resultater indikerer, at denne metode inducerer en stabil og robust undertrykkelse af genekspression og dermed giver en effektiv tab-af-funktion tilgang til studier af retinal udvikling.

Konstruktion af Tol2 transposon konstruktioner til ekspression af kunstige miRNA'er mod Nel Nel (Neural Epidermal vækstfaktor (EGF)-Like; også kendt som Nell2) er et ekstracellulært glycoprotein. Det har strukturelle ligheder med thrombospondin-1 og udtrykkes overvejende i nervesystemet20,21. Vi har tidligere vist, at Nel regulerer differentiering og overlevelse af retinale ganglionceller15 og fu...

Watch this Scientific Journal Video about Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs at JoVE.com

Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs

Vi har udviklet en ny tab-af-funktion tilgang, der involverer introduktion og genomisk integration af kunstige mikro-RNA-sekvenser i kyllingembryoner ved hjælp af i ovo-elektroporation og Tol2-transposonsystemet. Denne teknik giver en robust og stabil genknockdown-metode til undersøgelser af genfunktion under udvikling.

Tab af funktionsmetode i den embryonale chick nethinden ved hjælp af Tol2 transposon-medieret transgen ekspression af kunstige mikroRNA'er

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and ...

Denne metode giver en tab-af-funktion tilgang til undersøgelser af retinal udvikling hos kyllingen. Denne teknik understøtter hurtig og vedvarende undertrykkelse af målgener i et bestemt område af nethinden. Denne tilgang kan også anvendes på andre dele af kyllingembryoet, herunder både neurale og ikke-neurale væv.Til ægcelleporation fremstilles en 0,25% Fast Green-opløsning ved at opløse 25 mg Fast Green FCF i 10 ml PBS og derefter filtreres opløsningen ved hjælp af et 0,2 mikron sprøjtefilter. Forbered derefter DNA-cocktailinjektionsopløsningen ved at blande microRNA emerald GFP-plasmidet med Tol2-transposaseekspressionsplasmidet i et forhold på to til en. Derefter tilsættes den tilberedte Fast Green-opløsning til DNA-cocktailen i forholdet en til 10 til visualisering af det injicerede område.Derefter skal du oprette mikroinjektionsapparatet. Apparatet består af en Hamilton-sprøjte, en 18 gauge to tommer nål, en to centimeter lang polyvinylchloridslange og en mikropipettenål. Fyld Hamilton-sprøjten med tung mineralolie, sæt derefter kanylen på 18 gauge til sprøjten, og fyld kanylens indre rum med olie ved at trykke sprøjtestemplet ned.Fastgør derefter polyvinylchloridslangen til enden af nålen, og fyld slangen med olien. Sæt den udtrukne mikropipettekanyle på slangen. Derefter under dissekeringsmikroskopet ved hjælp af fine tang, afbryd nålens spids til en diameter på 10 til 20 mikrometer for at lave en lille åbning.Fyld hele nålen med olie. Sæt derefter fem mikroliter af den farvede DNA-cocktail på en petriskål. Under dissekeringsmikroskopet placeres spidsen af mikropipettenålen i DNA-opløsningen på petriskålen, og langsomt trækkes opløsningen ind i nålen.Når trykket er ekvilibreret i og uden for nålen, tages spidsen af kanylen ud af DNA-opløsningen, og den nedsænkes i sterilt PBS i et lille bægerglas indtil injektionen. For at opsætte elektroporationsapparatet skal du indstille et par platinelektroder fast med en elektrodeholder på en mikromanipulator. Juster afstanden mellem spidsen af elektroderne til to millimeter, og tilslut elektroderne til en firkantet bølgepulsgenerator med kabler.Derefter fjernes et befrugtet hvidt leghornæg fra inkubatoren til DNA-mikroinjektionen og tørres ægets overflade af med silkepapir gennemblødt i 70% ethanol. Fastgør derefter en 18 gauge nål til en 10 ml sprøjte, og indsæt nålen gennem den stumpe ende af ægget, vinklet nedad for at undgå at beskadige æggeblommen. Efter at have trukket to til tre ml albumin ud af ægget, forsegl hullet med et stykke scotch tape og lys ægget med lys for at sikre, at embryoet og vitellinmembranen løsnes fra skallen.Derefter skal du bruge tang til at fjerne et stykke æggeskal fra toppen af ægget og udsætte embryoet. Vinduet må ikke være mere end fem æg ad gangen for at forhindre udtørring af embryoner under elektroporation. Indsæt spidsen af nålen i den optiske vesikel fra dens proksimale side i en 45 graders vinkel, og injicer DNA-cocktailen ved langsomt at trykke stemplet ned, indtil den blåfarvede opløsning fylder lumen.Træk kanylen ud, og sæt spidsen tilbage i PBS. Til elektroporation skal du indstille pulsspændingen til 15 volt, pulslængden til 15 millisekunder, pulsintervallet til 915 millisekunder og pulstallet til fem. Efter tilsætning af et par dråber HBSS på vitellinmembranen over embryoet, skal du bruge mikromanipulatoren til at sænke elektroderne ned i HBSS vinkelret på embryoets forreste bageste akse.Placer elektroderne på hver side af den optiske vesikel, og sørg for, at elektroderne ikke berører embryoet eller blodkarrene, og anvend derefter pulserende elektriske felter. Når elektroporationen er afsluttet, skal du fjerne elektroderne og forsigtigt rengøre elektroderne med en vandgennemblødt steril vatpind for at undgå albuminakkumulering. Forsegl vinduet med scotch tape, og reinkuber embryoet indtil det ønskede udviklingsstadium.Transfektion af individuelle præmikroRNA-sekvenser til Nel AP, der udtrykker HEK293T celler, resulterede i signifikant undertrykkelse af Nel-ekspression ved konstruktioner mod nukleotider 482 til 502, 910 til 930 og 2461 til 2481. Sammenkædning af to microRNA-sekvenser forbedrede knockdown-effektiviteten betydeligt. Alle tre kombinationer viste forbedrede undertrykkelsesaktiviteter sammenlignet med ukædede individuelle præmikroRNA-sekvenser.Robust suppression blev observeret mindst 13 dage efter transfektion. Når en Nel præ-microRNA-konstruktion rettet mod nukleotider 482 til 502 og 2461 til 2481 blev co-transfekteret med transposaseekspressionsvektoren ind i kyllingnethinden, blev Nel-ekspression i retinale pigmentepitel signifikant reduceret i smaragd GFP, der udtrykte celler på embryonal dag 4.5. I otte dage gamle embryoner faldt Nel-ekspression også i retinale ganglionceller.I modsætning hertil blev Nel-ekspression i nethinden ikke påvirket af introduktionen af kontrolmikroRNA. Efter denne procedure kan virkninger på målgenundertrykkelse undersøges ved hjælp af forskellige metoder såsom undersøgelser af celleproliferation og differentiering, celledød og celle- og axonsporing.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

I ovo Angivelse af MicroRNA i Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Elektroporation af baghjerne at spore axonale baner og Synaptic Mål i Chick Embryo

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generering af Topisk Transgene rotter ved<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation og<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescens Screening

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Vurdering af Vascular Regeneration i CNS Brug af musen Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq analyse af differentiel genekspression i elektroporerede Chick embryonale Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning

Brug af elektroretinogrammet at vurdere Funktion i gnaver Retina og beskyttende virkninger af fjernbetjening Limb iskæmisk prækonditionering

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging neurale aktivitet i den primære somatosensoriske Cortex ved hjælp af Thy1-GCaMP6s Transgene mus

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Ved at kombinere Optogenetics med kunstige MicroRNA at karakterisere effekter af genet Knockdown på præsynaptiske funktion inden for intakt Neuronal kredsløb

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...