Name: loss-of-function approach in the embryonic chick retina by using tol2 transposon-mediated transgenic expression of artificial micrornas
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs at JoVE.com

הווקטורים pT2K-CAGGS ו-pCAGGS-T2TP סופקו באדיבות על ידי יושיקו טקהאשי (אוניברסיטת קיוטו, קיוטו, יפן) וקואיצ'י קוואקאמי (המכון הלאומי לגנטיקה, מישימה, יפן), בהתאמה. אנו מודים למיכאל ברברוגלו על קריאתו המכרעת של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהחברה המלכותית ומועצת המחקר לביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה (BBSRC) (בריטניה) ל- M.N.

1. בניית וקטורי ביטוי miRNA
הערה: ההליכים לבניית וקטורי ביטוי miRNA (שלבים 1.1-1.3, 1.5-1.6.) ממוטבים עבור ערכת ביטוי miRNA, ערכת ביטוי miR של Block-iT Pol II miR עם EmGFP, כפי שתואר קודם לכן15,16. הערכה מספקת את וקטור הביטוי שנועד לאפשר ביטוי miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), וקטור ?...

<ol>
	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).</li><li>Funahashi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Pax-5+in+the+regulation+of+a+mid-hindbrain+organizer's+activity.">Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer's activity.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).</li><li>Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+methods+in+chick+embryos.">In ovo electroporation methods in chick embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).</li><li>Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+retroviral+pathogenesis+by+RNA+interference.">Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference.</a> Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).</li><li>Katahira, T., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+chick+embryos+with+a+vector-based+small+interfering+RNA+system.">Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).</li><li>Harpavat, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RCAS-RNAi:+a+loss-of-function+method+for+the+developing+chick+retina.">RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina.</a> BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation.">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Methods. 24, 43-48 (2001).</li><li>Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+DNA+transposon+as+a+natural+mutator:+the+medaka+fish+Tol2+element+contributes+to+genetic+variation+without+recognizable+traces.">Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces.</a> Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).</li><li>Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+functional+transposase+of+the+Tol2+element,+an+Ac-like+element+from+the+Japanese+medaka+fish,+and+its+transposition+in+the+zebrafish+germ+lineage.">Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).</li><li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excision+of+the+Tol2+transposable+element+of+the+medaka+fish+Oryzias+latipes+in+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis.">Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Gene. 338 (1), 93-98 (2004).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Developmental Biology. 2 (2), 616-624 (2007).</li><li>Kawakami, K., Noda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+the+Tol2+element,+an+Ac-like+element+from+the+Japanese+medaka+fish+Oryzias+latipes,+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells.</a> Genetics. 166 (2), 895-899 (2004).</li><li>Hou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+knockdown+of+target+gene+expression+by+tetracycline+regulated+transcription+of+double+strand+RNA.">Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 53, 69-75 (2011).</li><li>Nakamoto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nel+positively+regulates+the+genesis+of+retinal+ganglion+cells+by+promoting+their+differentiation+and+survival+during+development.">Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).</li><li>Nakamoto, M., Nakamoto, C., Mao, C. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. 8, 91-108 (2020).</li><li>BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&amp;title=BLOCK-iT&amp;trade">https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&amp;title=BLOCK-iT&amp;trade</a> (2021)</li><li>Flanagan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase+fusions+of+ligands+or+receptors+as+in+situ+probes+for+staining+of+cells,+tissues,+and+embryos.">Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos.</a> Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Matsuhashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+gene,+nel,+encoding+a+M(r)+93+K+protein+with+EGF-like+repeats+is+strongly+expressed+in+neural+tissues+of+early+stage+chick+embryos.">New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos.</a> Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).</li><li>Matsuhashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+gene,+nel,+encoding+a+Mr+91+K+protein+with+EGF-like+repeats+is+strongly+expressed+in+neural+tissues+of+early+stage+chick+embryos.">New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos.</a> Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+guidance+of+retinal+axons+by+a+tectal+lamina-specific+glycoprotein+Nel.">In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).</li><li>Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+Nel,+a+Thrombospondin-1-like+glycoprotein+involved+in+neural+development+and+functions.">Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).</li><li>Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nell2+regulates+the+contralateral-versus-ipsilateral+visual+projection+as+a+domain-specific+positional+cue.">Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue.</a> Development. 146 (4), (2019).</li><li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+from+transcriptionally+disabled+retroviral+vectors.">Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).</li></ol>

פרוטוקול זה מספק מדריך מפורט להשתקת גנים ברשתית האפרוחים המתפתחת על ידי ביטוי מהונדס של miRNA מלאכותי באמצעות אלקטרופורציה ומערכת טרנספוזון Tol2.
הגורמים הבאים הם בעלי חשיבות קריטית בביצוע טכניקה זו בהצלחה. ראשית, קריטי להשתמש ברצפי miRNA שאושרו כבעלי השפעות חזקות של הפלה. ל...

רשתית בעלי החוליות היא מערכת מודל חשובה לחקר התפתחות עצבית. למרות מיקומה ההיקפי, הרשתית היא שלוחה אנטומית והתפתחותית של מערכת העצבים המרכזית, ועצב הראייה, המורכב מאקסונים של תאי גנגליון ברשתית, מייצג מערכת בתוך מערכת העצבים המרכזית. לרשתית האפרוחים יתרונות משמעותיים כמערכת מודל לחקר המנגנון המולקולרי של ההתפתחות העצבית: היא גדולה ומתפתחת במהירות; יש לו דמיון מבני ופונקציונלי לרשתית האנושית; הוא נגיש מאוד עבור ויזואליזציה ומניפולציות ניסיוניות. מנגנונים מולקולריים של התרבות תאים והתמיינותם, מורפוגנזה והנחיית אקסונים במהלך ההתפתחות העצבית נחקרו בהרחבה באמצעות רשתית העוף.
בשני העשורים האחרונים נעשה שימוש מוצלח באלקטרופורציה כדי להחדיר גנים חוץ רחמיים לתאים בעובר האפרוח המתפתח. טכניקה זו מאפשרת תיוג של תאים מתפתחים, מעקב אחר גורל התא ומעקב אחר נדידת תאים ודרכי אקסונים, כמו גם ביטוי גנים חוץ רחמי לניתוח in vivo של תפקוד גנים. התנאים של אלקטרופורציה לביטוי גנים חוץ רחמי יעיל בעוברי אפרוחים נקבעו היטב 1,2,3.
למרות יתרונות אלה, היעדר טכניקת אובדן תפקוד יציבה למחקרים על תפקוד גנים היה מגבלה טכנית משמעותית של עובר האפרוח. בעוד שעוברי אפרוחים שהתחשמלו באמצעות רנ"א מפריע קטן (siRNAs)4 או וקטורי ביטוי לרנ"א קצר סיכת שיער (shRNAs)5 מראים הפלה של גן המטרה, דיכוי גנים בגישות אלה הוא חולף מכיוון שההשפעות נעלמות ברגע שהתאים מאבדים את הרנ"א או הדנ"א שהוכנסו. דיכוי גנים יציב יותר יכול להיות מושג על ידי העברת siRNA לעוברי אפרוחים על ידי RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with a Splice acceptor) retrovirussystem 6. הווקטור הנגיפי משתלב בגנום המארח, והגנים החוץ-רחמיים באים לידי ביטוי יציב. עם זאת, הרטרו-וירוס יכול להשתלב בגנום של תאים מתחלקים רק בשלב המיטוטי (M) של מחזור התא, מה שעשוי להטיל מגבלה על שלבי ההתפתחות ו / או סוגי התאים שעבורם ניתן ליישם גישה זו של אובדן תפקוד. בנוסף, ביטוי טרנסגנים על ידי RCAS נראה איטי יותר ופחות חזק מזה המושרה על ידי אלקטרופורציה7.
טרנספוזונים הם אלמנטים גנטיים הנעים ממקום אחד בגנום למשנהו. אלמנט Tol2 הוא חבר במשפחת האלמנטים הניתנים לטרנספוזון hAT ומכיל גן פנימי המקודד טרנספוזאז המזרז את תגובת הטרנספוזוןשל אלמנט Tol2 8. כאשר וקטור פלסמיד הנושא קלטת ביטוי גנים שמשני צדדיה רצפים של הקצה השמאלי והימני של יסודות Tol2 (200 bp ו-150 bp, בהתאמה) מוכנס לתאי חוליות עם מבנה ביטוי טרנספוזאז Tol2, קלטת הביטוי נכרתת מהפלסמיד ומשולבת בגנום המארח, אשר תומך בביטוי יציב של הגן החוץ רחמי (איור 1). הוכח כי היסוד הטרנספוזי Tol2 יכול לגרום לטרנספוזיציה גנטית ביעילות רבה במינים שונים של בעלי חוליות, כולל דגי זברה9,10, צפרדעים 11, אפרוחים 12 ועכברים 13, ולכן הוא שיטה שימושית של טרנסגנזה ומוטגנזה החדרתית. מערכת הטרנספוזון Tol2 שימשה בהצלחה להפלה מותנית של גן מטרה על ידי אינטגרציה גנומית של siRNA המעובד מ-RNA דו-גדילי ארוך14.
פרוטוקול זה מתאר גישת אובדן תפקוד בעובר אפרוח הכוללת החדרת מיקרו-רנ"א מלאכותי (miRNAs) על ידי מערכת טרנספוזון Tol215,16. בגישה זו, קלטת ביטוי עבור סמן EmGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק אמרלד) ו- miRNA מלאכותי כנגד גן מטרה משובטת לווקטור טרנספוזון Tol2. לאחר מכן מכניסים את מבנה הטרנספוזון Tol2 לרשתית הגוזל העוברי עם מבנה ביטוי טרנספוזון Tol2 על ידי באלקטרופורציה של אובו. בתאי הרשתית הנגועים, הטרנספוזואז מזרז את כריתת קלטת הביטוי מווקטור הטרנספוזון ושילובה בכרומוזומי המאכסן, מה שמוביל לביטוי יציב של miRNA וחלבון EmGFP. במחקרים הקודמים שלנו, הצלחנו להפיל את הביטוי של Nel, גליקופרוטאין חוץ-תאי המתבטא בעיקר במערכת העצבים, ברשתית האפרוח המתפתחת (ראו תוצאות מייצגות). התוצאות שלנו מצביעות על כך שניתן להשיג דיכוי גנים יציב ויעיל באמצעות טכניקה זו.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 G needle, 2&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89219-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP-TAG kit A and AP-TAG kit B</td>
			<td>GenHunter Corp</td>
			<td>Q201 and Q202</td>
			<td>Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block-iT RNAi Designer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA 10 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C115CB cables</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>C115CB</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;254</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C117 cables</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>C117</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;252</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles)</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td>1 mm O.D. 0.75 mm I.D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUY21 square wave electroporator</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethanolamine (pH 9.8)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>Kurl</td>
			<td>B-Lab-600-110</td>
			<td>https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>CUY580</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrodes</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY611P3-1</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromax DH10B</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18290-015</td>
			<td>Electrocompetent E. coli cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)</td>
			<td>Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gooseneck fiber light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGene 6 transfection reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (50 &#956;L)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>20715</td>
			<td>Hamilton Cat No&#160; 80901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heavy mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>330760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Homoarginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H10007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige (Japan)</td>
			<td>MM3</td>
			<td>http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Shutter Instrument</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Nitrophenylphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>20-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS-T2TP vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F566S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer (Optional)</td>
			<td>Parker</td>
			<td></td>
			<td>Pressure microinjection system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Plasmid maxiprep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2K-CAGGS vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC tubing</td>
			<td>VWR (UK)</td>
			<td>228-3830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9007-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K493600</td>
			<td>Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

loss-of-function approach in the embryonic chick retina by using tol2 transposon-mediated transgenic expression of artificial micrornas

רשתית האפרוחים היא כבר מזמן מערכת מודל חשובה בנוירוביולוגיה התפתחותית, עם יתרונות הכוללים את גודלה הגדול, התפתחותה המהירה ונגישותה להדמיה ולמניפולציות ניסיוניות. עם זאת, המגבלה הטכנית העיקרית שלה הייתה היעדר גישות חזקות לאובדן תפקוד עבור ניתוח תפקודי גנים. פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה של השתקת גנים ברשתית האפרוחים המתפתחת הכוללת ביטוי מהונדס של מיקרו-רנ"א מלאכותי (miRNAs) באמצעות מערכת טרנספוזון Tol2. בגישה זו, פלסמיד טרנספוזון Tol2 המכיל קלטת ביטוי לסמן EmGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק אמרלד) ורצפי קדם-miRNA מלאכותיים כנגד גן מטרה מוכנס לרשתית האפרוח העוברי עם מבנה ביטוי טרנספוזאז Tol2 על ידי באלקטרופורציה של אובו . בתאי הרשתית הנגועים, הטרנספוזואז מזרז את כריתת קלטת הביטוי מווקטור הטרנספוזון ושילובה בכרומוזומי המאכסן, מה שמוביל לביטוי יציב של miRNA וחלבון EmGFP. במחקר הקודם שלנו, הראינו כי הביטוי של Nel, גליקופרוטאין המפעיל פונקציות מרובות בהתפתחות עצבית, יכול להיות מדוכא באופן משמעותי ברשתית אפרוח מתפתחת באמצעות טכניקה זו. התוצאות שלנו מצביעות על כך שמתודולוגיה זו גורמת לדיכוי יציב וחזק של ביטוי גנים ובכך מספקת גישה יעילה של אובדן תפקוד למחקרים על התפתחות הרשתית.

בניית מבני טרנספוזון Tol2 לביטוי miRNA מלאכותי כנגד Nel Nel (Neural Epidermal growth factor (EGF)-Like; ידוע גם בשם Nell2) הוא גליקופרוטאין חוץ-תאי. יש לו דמיון מבני עם thrombospondin-1 והוא בא לידי ביטוי בעיקר במערכת העצבים20,21. הוכחנו בעבר כי Nel מווסת התמיינות והישרדות של ת...

Watch this Scientific Journal Video about Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs at JoVE.com

Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs

פיתחנו גישה חדשנית של אובדן תפקוד הכוללת החדרה ואינטגרציה גנומית של רצפי מיקרו-רנ"א מלאכותיים לעוברי אפרוחים באמצעות אלקטרופורציה ומערכת טרנספוזון Tol2. טכניקה זו מספקת מתודולוגיית פירוק גנים חזקה ויציבה לחקר תפקוד גנים במהלך ההתפתחות.

גישת אובדן תפקוד ברשתית הגוזל העוברי באמצעות ביטוי טרנסגני בתיווך Tol2 של מיקרו-רנ"א מלאכותי

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and ...

מתודולוגיה זו מספקת גישה של אובדן תפקוד למחקרים על התפתחות הרשתית בגוזל. טכניקה זו תומכת בדיכוי מהיר ומתמשך של גני מטרות באזור מסוים ברשתית. גישה זו יכולה להיות מיושמת גם על חלקים אחרים של עובר האפרוח, כולל הן את הרקמות העצביות והן את הרקמות הלא עצביות.עבור אלקטרופורציה של אובו, הכינו תמיסה ירוקה מהירה של 0.25% על ידי המסת 25 מיליגרם של FCF ירוק מהיר ב-10 מיליליטר של PBS, ולאחר מכן סננו את התמיסה באמצעות מסנן מזרקים של 0.2 מיקרון. לאחר מכן, הכינו את תמיסת הזרקת קוקטייל ה- DNA על ידי ערבוב פלסמיד ה- microRNA emerald GFP עם פלסמיד ביטוי טרנספוזאז Tol2 ביחס של שניים לאחד. לאחר מכן הוסף את התמיסה המוכנה של Fast Green לקוקטייל ה- DNA ביחס של אחד עד 10 להדמיה של האזור המוזרק.לאחר מכן, להגדיר את מנגנון microinjection. המכשיר מורכב מזרק המילטון, מחט 18 מד שני אינץ ', צינור פוליוויניל כלוריד באורך שני סנטימטרים, ומחט מיקרופיפטה. ממלאים את מזרק המילטון בשמן מינרלי כבד, ואז מחברים את מחט 18 המד למזרק, וממלאים את החלל הפנימי של המחט בשמן על ידי לחיצה על בוכנת המזרק.לאחר מכן, חבר את צינור פוליוויניל כלוריד לקצה המחט, ומלא את הצינור עם השמן. חבר את מחט המיקרופיפטה המשוכה לצינור. לאחר מכן תחת המיקרוסקופ המנתח באמצעות מלקחיים עדינים, לנתק את קצה המחט לקוטר של 10 עד 20 מיקרומטר כדי ליצור פתח קטן.ממלאים את המחט כולה בשמן. לאחר מכן, הניחו חמישה מיקרוליטרים של קוקטייל הדנ"א הצבעוני על צלחת פטרי. מתחת למיקרוסקופ המנתח, הניחו את קצה מחט המיקרופיפטה בתמיסת הדנ"א על צלחת הפטרי, ומשכו לאט את התמיסה לתוך המחט.לאחר שהלחץ התאזן בתוך המחט ומחוצה לה, הוציאו את קצה המחט מתמיסת הדנ"א, והשאירו אותה שקועה ב-PBS סטרילי בכד קטן עד להזרקה. לאחר מכן כדי להגדיר את מנגנון האלקטרופורציה, הגדר זוג אלקטרודות פלטינה בחוזקה עם מחזיק אלקטרודות על מיקרומניפולטור. כוונן את המרווח בין קצה האלקטרודות לשני מילימטרים, וחבר את האלקטרודות למחולל פולס גל מרובע עם כבלים.לאחר מכן, עבור מיקרו-הזרקת DNA, הסר ביצית לגהורן לבנה מופרית מהאינקובטור ונגב את פני השטח של הביצה עם נייר טישו ספוג באתנול 70%. לאחר מכן חברו מחט 18 מד למזרק 10 מיליליטר, והכניסו את המחט דרך הקצה הקהה של הביצה, בזווית כלפי מטה כדי למנוע פגיעה בחלמון. לאחר משיכת שניים עד שלושה מיליליטר אלבומין מהביצה, אטמו את החור עם חתיכת סרט סקוטש, והאירו את הביצה באור כדי להבטיח שהעובר וקרום ויטלין מנותקים מהקליפה.לאחר מכן, באמצעות מלקחיים, להסיר חתיכת קליפת ביצה מראש הביצה, לחשוף את העובר. אין לשלוח יותר מחמש ביציות בכל זמן נתון כדי למנוע התייבשות של עוברים במהלך התחשמלות. הכנס את קצה המחט לתוך שלפוחית הראייה מצידה הפרוקסימלי בזווית של 45 מעלות, והזריק את קוקטייל ה- DNA על ידי לחיצה איטית על הבוכנה עד שתמיסה בצבע כחול ממלאת את הלומן.משוך את המחט, והחזיר את קצהו ל- PBS. עבור אלקטרופורציה, הגדר את מתח הפולס ל- 15 וולט, את אורך הפולס ל- 15 אלפיות השנייה, את מרווח הפולס ל- 915 אלפיות השנייה ואת מספר הפולס לחמש. לאחר הוספת כמה טיפות של HBSS על קרום ויטלין מעל העובר, השתמש במיקרומניפולטור כדי להוריד את האלקטרודות לתוך HBSS בניצב לציר הקדמי-אחורי של העובר.הניחו את האלקטרודות משני צדי שלפוחית הראייה, וודאו שהאלקטרודות אינן נוגעות בעובר או בכלי הדם, ולאחר מכן הפעילו שדות חשמליים פועמים. לאחר השלמת האלקטרופורציה, הסר את האלקטרודות, ונקה בעדינות את האלקטרודות עם צמר גפן סטרילי ספוג מים כדי למנוע הצטברות אלבומין. אוטמים את החלון בסקוטש טייפ, ודורים מחדש על העובר עד לשלב ההתפתחותי הרצוי.טרנספקציה של רצפי קדם-מיקרו-רנ"א בודדים לתאי Nel AP המבטאים תאי HEK293T הביאה לדיכוי משמעותי של ביטוי Nel על ידי מבנים כנגד נוקלאוטידים 482 עד 502, 910 עד 930 ו-2461 עד 2481. שרשור שני רצפי מיקרו-רנ"א שיפר משמעותית את יעילות ההפלה. כל שלושת הצירופים הראו פעילויות דיכוי משופרות בהשוואה לרצפי קדם-מיקרו-רנ"א בודדים ללא מעצורים.דיכוי חזק נצפה לפחות 13 ימים לאחר ההדבקה. כאשר מבנה קדם-מיקרו-רנ"א של Nel המכוון לנוקלאוטידים 482 עד 502 ו-2461 עד 2481 הודבק יחד עם וקטור ביטוי הטרנספוזאז לתוך רשתית האפרוח, ביטוי Nel באפיתל פיגמנט הרשתית הופחת משמעותית בתאי GFP אמרלד המבטאים תאים ביום העוברי 4.5. בעוברים בני שמונה ימים, ביטוי Nel ירד גם בתאי גנגליון ברשתית.לעומת זאת, ביטוי Nel ברשתית לא הושפע מהכנסת מיקרו-רנ"א בקרה. לאחר הליך זה, ניתן לבחון את ההשפעות על דיכוי גני המטרה באמצעות שיטות שונות כגון בדיקות של התרבות תאים והתמיינותם, מוות תאי ומעקב אחר תאים ואקסונים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

חוט השדרה Electrophysiology II: ייצור תאי אלקטרודה יניקה

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

כימות של פעילות Cis-Regulatory אלמנטים ברשתית עכבר ידי electroporation Explant

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

בביטוי אוב של microRNA בגחון צ&#39;יק מוח התיכון

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation של המוח האחורי כדי לעקוב אחר מסלולים ויעדי axonal Synaptic בעובר האפרוח

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

דור של חולדות למריחה מהונדסים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation ו<em&gt; בvivo</em&gt; הקרנת פליטת אור

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

הערכה של כלי דם התחדשות במערכת העצבים המרכזית באמצעות רשתית העכבר

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq ניתוח של ביטוי הגנים בדיפרנציאל חוט השדרה Electroporated אפרוח עוברי

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning

שימוש בelectroretinogram כדי להעריך את התפקוד ברשתית מכרסמים וההשפעות המגנות של האיבר המרוחק איסכמי אכשור קד

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

שילוב Optogenetics עם מיקרו Rna מלאכותי כדי לאפיין תופעות נוקאאוט גנטי על פונקציה Presynaptic בתוך מעגלים עצביים ללא פגע

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...