Name: loss-of-function approach in the embryonic chick retina by using tol2 transposon-mediated transgenic expression of artificial micrornas
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
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pT2K-CAGGSおよびpCAGGS-T2TPベクターは、それぞれ高橋佳子(京都大学、京都)および川上浩一(国立遺伝学研究所、三島)から提供された。原稿を批判的に読んでくれたマイケル・ベルベログルに感謝します。この研究は、王立協会およびバイオテクノロジーおよび生物科学研究評議会(BBSRC)(英国)からM.N.への助成金によってサポートされました。

1. miRNA発現ベクターの構築
注:miRNA発現ベクターを構築するための手順(ステップ1.1-1.3、1.5-1.6)は、前述のように、miRNA発現キットであるEmGFPを用いたBlock-iT Pol II miR RNA発現キット用に最適化されています15,16。このキットには、miRNA発現を可能にするように設計された発現ベクター(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA)、コントロールベク?...

<ol>
	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).</li><li>Funahashi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Pax-5+in+the+regulation+of+a+mid-hindbrain+organizer's+activity.">Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer's activity.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).</li><li>Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+methods+in+chick+embryos.">In ovo electroporation methods in chick embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).</li><li>Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+retroviral+pathogenesis+by+RNA+interference.">Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference.</a> Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).</li><li>Katahira, T., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+chick+embryos+with+a+vector-based+small+interfering+RNA+system.">Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).</li><li>Harpavat, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RCAS-RNAi:+a+loss-of-function+method+for+the+developing+chick+retina.">RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina.</a> BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation.">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Methods. 24, 43-48 (2001).</li><li>Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+DNA+transposon+as+a+natural+mutator:+the+medaka+fish+Tol2+element+contributes+to+genetic+variation+without+recognizable+traces.">Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces.</a> Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).</li><li>Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+functional+transposase+of+the+Tol2+element,+an+Ac-like+element+from+the+Japanese+medaka+fish,+and+its+transposition+in+the+zebrafish+germ+lineage.">Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).</li><li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excision+of+the+Tol2+transposable+element+of+the+medaka+fish+Oryzias+latipes+in+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis.">Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Gene. 338 (1), 93-98 (2004).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Developmental Biology. 2 (2), 616-624 (2007).</li><li>Kawakami, K., Noda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+the+Tol2+element,+an+Ac-like+element+from+the+Japanese+medaka+fish+Oryzias+latipes,+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells.</a> Genetics. 166 (2), 895-899 (2004).</li><li>Hou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+knockdown+of+target+gene+expression+by+tetracycline+regulated+transcription+of+double+strand+RNA.">Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 53, 69-75 (2011).</li><li>Nakamoto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nel+positively+regulates+the+genesis+of+retinal+ganglion+cells+by+promoting+their+differentiation+and+survival+during+development.">Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).</li><li>Nakamoto, M., Nakamoto, C., Mao, C. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. 8, 91-108 (2020).</li><li>BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&amp;title=BLOCK-iT&amp;trade">https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&amp;title=BLOCK-iT&amp;trade</a> (2021)</li><li>Flanagan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase+fusions+of+ligands+or+receptors+as+in+situ+probes+for+staining+of+cells,+tissues,+and+embryos.">Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos.</a> Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Matsuhashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+gene,+nel,+encoding+a+M(r)+93+K+protein+with+EGF-like+repeats+is+strongly+expressed+in+neural+tissues+of+early+stage+chick+embryos.">New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos.</a> Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).</li><li>Matsuhashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+gene,+nel,+encoding+a+Mr+91+K+protein+with+EGF-like+repeats+is+strongly+expressed+in+neural+tissues+of+early+stage+chick+embryos.">New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos.</a> Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+guidance+of+retinal+axons+by+a+tectal+lamina-specific+glycoprotein+Nel.">In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).</li><li>Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+Nel,+a+Thrombospondin-1-like+glycoprotein+involved+in+neural+development+and+functions.">Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).</li><li>Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nell2+regulates+the+contralateral-versus-ipsilateral+visual+projection+as+a+domain-specific+positional+cue.">Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue.</a> Development. 146 (4), (2019).</li><li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+from+transcriptionally+disabled+retroviral+vectors.">Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).</li></ol>

このプロトコルは、 in ovo エレクトロポレーションと Tol2 トランスポゾンシステムを用いた人工 miRNA のトランスジェニック発現による、発生中のニワトリ網膜における遺伝子サイレンシングの詳細なガイドを提供します。
この手法を正常に実行するには、次の要素が非常に重要です。まず、堅牢なノックダウン効果を発揮することが確認されているmiRNA配列を使用...

脊椎動物の網膜は、神経発生を研究するための重要なモデルシステムです。その末梢位置にもかかわらず、網膜は解剖学的および発達的に中枢神経系の延長であり、網膜神経節細胞の軸索からなる視神経は中枢神経系内の管を表す。ひよこ網膜は、神経発達の分子メカニズムを研究するためのモデルシステムとして重要な利点があります:それは大きく、急速に発達します。それは人間の網膜と構造的および機能的類似性を持っています。視覚化や実験的な操作に非常にアクセスしやすいです。神経発生中の細胞増殖・分化、形態形成、軸索誘導の分子機構は、ニワトリ網膜を用いて広く研究されている。
卵子では、エレクトロポレーションは、発生中のニワトリ胚の細胞に異所性遺伝子を導入するために過去20年間にわたって首尾よく使用されてきました。この技術により、発生中の細胞の標識、細胞運命の追跡、細胞移動および軸索路のトレース、および遺伝子機能のin vivo分析のための異所性遺伝子発現が可能になります。ニワトリ胚における効率的な異所性遺伝子発現のためのin ovoエレクトロポレーションの条件は十分に確立されている1,2,3。
これらの利点にもかかわらず、遺伝子機能の研究のための安定した機能喪失技術の欠如は、ニワトリ胚の主要な技術的限界であった。低分子干渉RNA(siRNA)4やショートヘアピンRNA(shRNA)5の発現ベクターでエレクトロポレーションしたニワトリ胚は標的遺伝子のノックダウンを示しますが、これらのアプローチでは、導入されたRNAまたはDNAを失うと細胞が効果が消失するため、遺伝子抑制は一過性です。より安定した遺伝子抑制は、RCAS(RエプリケーションCompetent Avian slicoma-leukosisウイルス(ASLV)ロングターミナルリピート(LTR)とSプライスアクセプター)レトロウイルスシステム6によってニワトリ胚にsiRNAを送達することによって達成され得る。ウイルスベクターは宿主ゲノムに組み込まれ、異所性遺伝子が安定に発現します。ただし、レトロウイルスは、細胞周期の有糸分裂(M)期にのみ分裂細胞のゲノムに組み込まれるため、この機能喪失アプローチを適用できる発生段階および/または細胞型に制限が課される可能性があります。さらに、RCASによる導入遺伝子の発現は、in ovoエレクトロポレーションによって誘導されるものよりも遅く、頑健ではないようです7。
トランスポゾンは、ゲノム上のある場所から別の場所に移動する遺伝的要素です。Tol2エレメントは、hAT転移エレメントファミリーのメンバーであり、Tol2エレメント8のトランスポゾン反応を触媒するトランスポザーゼをコードする内部遺伝子を含む。Tol2エレメントの左端と右端の配列(それぞれ200 bpと150 bp)に挟まれた遺伝子発現カセットを担持したプラスミドベクターをTol2トランスポザーゼ発現コンストラクトで脊椎動物細胞に導入すると、プラスミドから発現カセットが切り出され、宿主ゲノムに組み込まれ、異所性遺伝子の安定発現をサポートします(図1).Tol2転移因子は、ゼブラフィッシュ9,10、カエル11、ヒナ12、マウス13を含む異なる脊椎動物種において非常に効率的に遺伝子転位を誘導できることが示されており、したがって、遺伝子導入および挿入突然変異誘発の有用な方法である。Tol2トランスポゾン系は、長鎖二本鎖RNAからプロセシングされたsiRNAのゲノム組み込みによる標的遺伝子の条件付きノックダウンに使用されています14。
このプロトコルは、Tol2トランスポゾンシステムによる人工マイクロRNA(miRNA)の導入を含むニワトリ胚における機能喪失アプローチを説明しています15,16。このアプローチでは、EmGFP(エメラルドグリーン蛍光タンパク質)マーカーと標的遺伝子に対する人工miRNAの発現カセットをTol2トランスポゾンベクターにクローニングします。次いで、Tol2トランスポゾン構築物を、in ovoエレクトロポレーションによってTol2トランスポザーゼ発現構築物と共に胚性ニワトリ網膜に導入する。トランスフェクトされた網膜細胞において、トランスポザーゼはトランスポゾンベクターからの発現カセットの切除および宿主染色体への組み込みを触媒し、miRNAおよびEmGFPタンパク質の安定した発現をもたらす。これまでの研究では、主に神経系に発現する細胞外糖タンパク質であるNelの発現を、発生中のニワトリ網膜でノックダウンすることに成功しました(代表的な結果を参照)。我々の結果は、この手法により、ovoにおいて安定的かつ効率的な遺伝子抑制を達成できることを示しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 G needle, 2&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89219-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP-TAG kit A and AP-TAG kit B</td>
			<td>GenHunter Corp</td>
			<td>Q201 and Q202</td>
			<td>Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block-iT RNAi Designer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA 10 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C115CB cables</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>C115CB</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;254</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C117 cables</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>C117</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;252</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles)</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td>1 mm O.D. 0.75 mm I.D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUY21 square wave electroporator</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethanolamine (pH 9.8)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>Kurl</td>
			<td>B-Lab-600-110</td>
			<td>https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>CUY580</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrodes</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY611P3-1</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromax DH10B</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18290-015</td>
			<td>Electrocompetent E. coli cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)</td>
			<td>Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gooseneck fiber light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGene 6 transfection reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (50 &#956;L)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>20715</td>
			<td>Hamilton Cat No&#160; 80901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heavy mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>330760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Homoarginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H10007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige (Japan)</td>
			<td>MM3</td>
			<td>http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Shutter Instrument</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Nitrophenylphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>20-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS-T2TP vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F566S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer (Optional)</td>
			<td>Parker</td>
			<td></td>
			<td>Pressure microinjection system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Plasmid maxiprep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2K-CAGGS vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC tubing</td>
			<td>VWR (UK)</td>
			<td>228-3830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9007-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K493600</td>
			<td>Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

loss-of-function approach in the embryonic chick retina by using tol2 transposon-mediated transgenic expression of artificial micrornas

ニワトリ網膜は、その大きなサイズ、迅速な発達、視覚化や実験操作のためのアクセシビリティなどの利点を備えた、発生神経生物学における重要なモデルシステムです。しかし、その主な技術的限界は、遺伝子機能解析のための堅牢な機能喪失アプローチの欠如でした。このプロトコルは、Tol2トランスポゾンシステムを使用した人工マイクロRNA(miRNA)のトランスジェニック発現を含む、発生中のニワトリ網膜における遺伝子サイレンシングの方法論を説明しています。このアプローチでは、EmGFP(エメラルドグリーン蛍光タンパク質)マーカーの発現カセットと標的遺伝子に対する人工pre-miRNA配列を含むTol2トランスポゾンプラスミドを、 in ovo エレクトロポレーションによってTol2トランスポザーゼ発現コンストラクトとともに胚性ニワトリ網膜に導入します。トランスフェクトされた網膜細胞において、トランスポザーゼはトランスポゾンベクターからの発現カセットの切除および宿主染色体への組み込みを触媒し、miRNAおよびEmGFPタンパク質の安定した発現をもたらす。これまでの研究では、この手法を用いることで、神経発生において複数の機能を発揮する糖タンパク質であるNelの発現を、発生中のニワトリ網膜において有意に抑制できることを実証しました。我々の結果は、この方法論が遺伝子発現の安定的かつ堅牢な抑制を誘導し、したがって網膜発生の研究のための効率的な機能喪失アプローチを提供することを示しています。

Nelに対する人工miRNA発現のためのTol2トランスポゾンコンストラクトの構築 ネル(N耳Eピダーマル成長因子(EGF)-Like;Nell2としても知られています)は、細胞外糖タンパク質です。トロンボスポンジン-1と構造的に類似しており、主に神経系で発現しています20,21。我々は以前に、Nelが網膜神経節細胞15の分化...

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Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs

我々は、ニワトリ胚への人工マイクロRNA配列の導入とゲノム組み込みを、 in ovo エレクトロポレーションとTol2トランスポゾンシステムを用いて行う新しい機能喪失アプローチを開発しました。この技術は、発生中の遺伝子機能の研究のための堅牢で安定した遺伝子ノックダウン方法論を提供します。

Tol2トランスポゾンを介した人工マイクロRNAのトランスジェニック発現を用いたニワトリ胚網膜における機能喪失アプローチ

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and ...

この方法論は、ニワトリの網膜発達の研究のための機能喪失アプローチを提供します。この技術は、網膜の特定の領域における標的遺伝子の迅速かつ持続的な抑制をサポートします。このアプローチは、神経組織と非神経組織の両方を含む、ニワトリ胚の他の部分にも適用できます。インオボエレクトロポレーションでは、25ミリグラムのファストグリーンFCFを10ミリリットルのPBSに溶解して0.25%ファストグリーン溶液を調製し、0.2ミクロンのシリンジフィルターを使用して溶液をろ過します。次に、マイクロRNAエメラルドGFPプラスミドとTol2トランスポザーゼ発現プラスミドとを2対1の比率で混合してDNAカクテル注入液を調製する。次に、注入された領域を視覚化するために、調製したファストグリーン溶液を1対10の比率でDNAカクテルに加えます。次に、マイクロインジェクション装置を設置した。この装置は、ハミルトンシリンジ、18ゲージの2インチ針、長さ2センチメートルのポリ塩化ビニルチューブ、およびマイクロピペット針で構成されています。ハミルトンシリンジに重鉱物油を充填し、次に18ゲージの針をシリンジに取り付け、シリンジプランジャーを押し下げて針の内部空間をオイルで満たします。次に、ポリ塩化ビニルチューブを針の端に取り付け、チューブにオイルを充填します。引っ張ったマイクロピペット針をチューブに取り付けます。次に、細かい鉗子を使用して解剖顕微鏡の下で、針の先端を直径10〜20マイクロメートルに折って小さな開口部を作ります。針全体をオイルで満たします。次に、5マイクロリットルの着色されたDNAカクテルをペトリ皿に入れます。解剖顕微鏡下で、マイクロピペット針の先端をペトリ皿のDNA溶液に入れ、溶液をゆっくりと針に引き込みます。針の内側と外側の圧力が平衡になったら、針の先端をDNA溶液から取り出し、注射するまで小さなビーカー内の滅菌PBSに沈めたままにします。次にエレクトロポレーション装置を設置し、マイクロマニピュレーター上に電極ホルダーで一対の白金電極を強固にセットする。電極の先端の間隔を2ミリメートルに調整し、電極をケーブルで矩形波パルス発生器に接続します。次に、DNAマイクロインジェクションのために、インキュベーターから受精したホワイトレグホン卵を取り出し、70%エタノールに浸したティッシュペーパーで卵の表面を拭きます。次に、18ゲージの針を10ミリリットルの注射器に取り付け、卵黄を傷つけないように下向きに傾けた卵の鈍い端に針を挿入します。卵から2〜3ミリリットルのアルブミンを引き出した後、スコッチテープで穴を塞ぎ、卵を光でろうそくにして、胚と硝子膜が殻から外れていることを確認します。次に、鉗子を使用して、卵の上から卵殻を取り除き、胚を露出させます。エレクトロポレーション中の胚の乾燥を防ぐために、一度に5個を超える卵を窓に入れないでください。針の先端を近位側から視小胞に45度の角度で挿入し、青色の溶液が内腔を満たすまでプランジャーをゆっくりと押し下げてDNAカクテルを注入します。針を引き出し、その先端をPBSに戻します。エレクトロポレーションの場合は、パルス電圧を15ボルト、パルス長を15ミリ秒、パルス間隔を915ミリ秒、パルス数を5に設定します。胚の上の硝子膜に数滴のHBSSを加えた後、マイクロマニピュレーターを使用して電極を胚の前後軸に垂直なHBSSに下げます。視静脈胞の両側に電極を置き、電極が胚や血管に触れないようにしてから、パルス電界を印加します。エレクトロポレーションが完了したら、電極を取り外し、アルブミンの蓄積を防ぐために、水に浸した滅菌綿棒で電極をそっと洗浄します。スコッチテープで窓を密封し、目的の発達段階まで胚を再インキュベートします。個々のプレマイクロRNA配列をNel AP発現細胞にトランスフェクションするとHEK293Tヌクレオチド482〜502、910〜930、および2461〜2481に対するコンストラクトによるNel発現の有意な抑制がもたらされました。2つのマイクロRNA配列を連鎖させることで、ノックダウン効率が大幅に向上しました。3つの組み合わせはすべて、非鎖の個々のプレマイクロRNA配列と比較して、強化された抑制活性を示しました。トランスフェクションの少なくとも13日後に強力な抑制が観察されました。ヌクレオチド482〜502および2461〜2481を標的とするNelプレマイクロRNA構築物をトランスポザーゼ発現ベクターとニワトリ網膜に同時トランスフェクトすると、胚4.5日目にエメラルドGFP発現細胞において網膜色素上皮におけるNel発現が有意に減少した。8日齢の胚では、網膜神経節細胞でもNel発現が減少しました。対照的に、網膜におけるNel発現は、対照マイクロRNAの導入によって影響を受けなかった。この手順に続いて、細胞の増殖と分化、細胞死、細胞と軸索のトレースなどのさまざまな方法を使用して、標的遺伝子抑制への影響を調べることができます。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

脊髄電気生理学II：細胞外吸引電極の作製

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

の活動の定量化シス</em植片エレクトロポレーションによってマウス網膜で>調節エレメント

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

腹チック中脳マイクロRNAの発現OVO中

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

ニワトリ胚における軸索軌道とシナプスターゲットを追跡する後脳のエレクトロ

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

局所トランスジェニックラットの発生により<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションおよび<em&gt;インビボ</em&gt;生物発光スクリーニング

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

マウス網膜を使用してCNSにおける血管再生の評価

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

エレクトロポひよこ胚脊髄における遺伝子発現差のRNA-配列解析

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning

齧歯類網膜とリモート四肢虚血プレコンディショニングの保護効果に機能を評価するために電図を用いて、

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニック マウス

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

オプトジェネティクスを組み合わせてそのまま神経回路内でのシナプス前機能に関する遺伝子ノックダウンの効果を特徴付ける人工マイクロ Rna

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...