Name: loss-of-function approach in the embryonic chick retina by using tol2 transposon-mediated transgenic expression of artificial micrornas
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs at JoVE.com

pT2K-CAGGS 및 pCAGGS-T2TP 벡터는 각각 Yoshiko Takahashi(Kyoto University, Kyoto, Japan)와 Koichi Kawakami(National Institute of Genetics, Mishima, Japan)에 의해 친절하게 제공되었습니다. 원고를 비판적으로 읽어준 Michael Berberoglu에게 감사드립니다. 이 연구는 왕립 학회와 생명 공학 및 생물 과학 연구위원회 (BBSRC) (영국)의 보조금으로 지원되었습니다.

1. miRNA 발현 벡터의 구축
참고: miRNA 발현 벡터를 구성하는 절차(단계 1.1-1.3, 1.5-1.6.)는 앞서 설명한 바와 같이 miRNA 발현 키트인 EmGFP를 사용한 Block-iT Pol II miR RNA 발현 키트에 최적화되어 있습니다(15,16). 이 키트는 miRNA 발현(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), 대조군 벡터(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-음성 대조군 플라스미드), 보조 시약 및 miRNA 발현 ...

<ol>
	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).</li><li>Funahashi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Pax-5+in+the+regulation+of+a+mid-hindbrain+organizer's+activity.">Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer's activity.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).</li><li>Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+methods+in+chick+embryos.">In ovo electroporation methods in chick embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).</li><li>Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+retroviral+pathogenesis+by+RNA+interference.">Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference.</a> Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).</li><li>Katahira, T., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+chick+embryos+with+a+vector-based+small+interfering+RNA+system.">Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).</li><li>Harpavat, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RCAS-RNAi:+a+loss-of-function+method+for+the+developing+chick+retina.">RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina.</a> BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation.">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Methods. 24, 43-48 (2001).</li><li>Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+DNA+transposon+as+a+natural+mutator:+the+medaka+fish+Tol2+element+contributes+to+genetic+variation+without+recognizable+traces.">Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces.</a> Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).</li><li>Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+functional+transposase+of+the+Tol2+element,+an+Ac-like+element+from+the+Japanese+medaka+fish,+and+its+transposition+in+the+zebrafish+germ+lineage.">Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).</li><li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excision+of+the+Tol2+transposable+element+of+the+medaka+fish+Oryzias+latipes+in+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis.">Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Gene. 338 (1), 93-98 (2004).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Developmental Biology. 2 (2), 616-624 (2007).</li><li>Kawakami, K., Noda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+the+Tol2+element,+an+Ac-like+element+from+the+Japanese+medaka+fish+Oryzias+latipes,+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells.</a> Genetics. 166 (2), 895-899 (2004).</li><li>Hou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+knockdown+of+target+gene+expression+by+tetracycline+regulated+transcription+of+double+strand+RNA.">Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 53, 69-75 (2011).</li><li>Nakamoto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nel+positively+regulates+the+genesis+of+retinal+ganglion+cells+by+promoting+their+differentiation+and+survival+during+development.">Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).</li><li>Nakamoto, M., Nakamoto, C., Mao, C. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. 8, 91-108 (2020).</li><li>BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&amp;title=BLOCK-iT&amp;trade">https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&amp;title=BLOCK-iT&amp;trade</a> (2021)</li><li>Flanagan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase+fusions+of+ligands+or+receptors+as+in+situ+probes+for+staining+of+cells,+tissues,+and+embryos.">Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos.</a> Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Matsuhashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+gene,+nel,+encoding+a+M(r)+93+K+protein+with+EGF-like+repeats+is+strongly+expressed+in+neural+tissues+of+early+stage+chick+embryos.">New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos.</a> Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).</li><li>Matsuhashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+gene,+nel,+encoding+a+Mr+91+K+protein+with+EGF-like+repeats+is+strongly+expressed+in+neural+tissues+of+early+stage+chick+embryos.">New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos.</a> Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+guidance+of+retinal+axons+by+a+tectal+lamina-specific+glycoprotein+Nel.">In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).</li><li>Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+Nel,+a+Thrombospondin-1-like+glycoprotein+involved+in+neural+development+and+functions.">Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).</li><li>Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nell2+regulates+the+contralateral-versus-ipsilateral+visual+projection+as+a+domain-specific+positional+cue.">Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue.</a> Development. 146 (4), (2019).</li><li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+from+transcriptionally+disabled+retroviral+vectors.">Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).</li></ol>

이 프로토콜은 ovo electroporation 및 Tol2 transposon 시스템에서 사용하는 인공 miRNA의 형질전환 발현에 의해 발달 중인 병아리 망막의 유전자 침묵에 대한 자세한 가이드를 제공합니다.
이 기술을 성공적으로 수행하는 데 중요한 요소는 다음과 같습니다. 첫째, 강력한 녹다운 효과를 발휘하는 것으로 확인된 miRNA 염기서열을 사용하는 것이 중요합니다. 생체 내 전기천공...

척추동물 망막은 신경 발달을 연구하기 위한 중요한 모델 시스템입니다. 말초 위치에도 불구하고 망막은 해부학적으로나 발달적으로 중추 신경계의 확장이며, 망막 신경절 세포의 축삭으로 구성된 시신경은 중추 신경계 내의 관을 나타냅니다. 병아리 망막은 신경 발달의 분자 메커니즘을 연구하는 모델 시스템으로서 상당한 이점을 가지고 있습니다. 그것은 인간 망막과 구조적 및 기능적 유사성을 가지고 있습니다. 시각화 및 실험적 조작을 위해 접근성이 높습니다. 신경 발달 중 세포 증식 및 분화, 형태 형성 및 축삭 유도의 분자 메커니즘은 닭 망막을 사용하여 광범위하게 연구되었습니다.
난소에서 전기천공법은 발달 중인 병아리 배아의 세포에 이소성 유전자를 도입하기 위해 지난 20년 동안 성공적으로 사용되었습니다. 이 기술은 발달 중인 세포의 표지, 세포 운명 추적, 세포 이동 및 축삭관 추적, 유전자 기능의 생체 내 분석을 위한 이소성 유전자 발현을 가능하게 합니다. 병아리 배아에서 효율적인 이소성 유전자 발현을 위한 난소 전기천공법의 조건은 잘 확립되어 있다 1,2,3.
이러한 장점에도 불구하고 유전자 기능 연구를 위한 안정적인 기능 상실 기술의 부족은 병아리 배아의 주요 기술적 한계였습니다. 작은 간섭 RNA(siRNA)4 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)5 에 대한 발현 벡터로 전기천공된 병아리 배아는 표적 유전자의 녹다운을 나타내는 반면, 세포가 도입된 RNA 또는 DNA를 잃으면 효과가 사라지기 때문에 이러한 접근 방식에서 유전자 억제는 일시적입니다. 보다 안정적인 유전자 억제는 RCAS(Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus(ASLV) long terminal repeat) with a Splice acceptor) 레트로바이러스 시스템에 의해 siRNA를 병아리 배아에 전달함으로써 달성될 수 있다6. 바이러스 벡터는 숙주 게놈에 통합되고 이소성 유전자는 안정적으로 발현됩니다. 그러나 레트로바이러스는 세포 주기의 유사분열(M) 단계 동안에만 분열하는 세포의 게놈에 통합될 수 있으며, 이는 이러한 기능 상실 접근법을 적용할 수 있는 발달 단계 및/또는 세포 유형에 제한을 가할 수 있습니다. 또한, RCAS에 의한 이식유전자의 발현은 ovo전기천공법(ovo)전기천공법( ovo electroporation)에 의해 유도된 것보다 느리고 덜 견고하게 나타난다7.
트랜스포존은 게놈의 한 위치에서 다른 위치로 이동하는 유전적 요소입니다. Tol2 요소는 hAT 전치 가능한 요소 패밀리의 구성원이며, Tol2 요소8의 트랜스포존 반응을 촉매하는 트랜스포사제를 코딩하는 내부 유전자를 함유한다. Tol2 요소(각각 200 bp 및 150 bp)의 좌측 및 우측 말단의 서열에 의해 측면 배치된 유전자 발현 카세트를 운반하는 플라스미드 벡터가 Tol2 전이효소 발현 구조체를 갖는 척추동물 세포 내로 도입될 때, 발현 카세트는 플라스미드로부터 절제되어 이소성 유전자의 안정적인 발현을 지원하는 숙주 게놈 내로 통합된다(도 1). Tol2 전치 요소는 제브라피쉬9,10, 개구리 11, 병아리12 및 생쥐 13을 포함한 다양한 척추동물 종에서 유전자 전이를 매우 효율적으로 유도할 수 있는 것으로 나타났으며, 따라서 형질전환 및 삽입 돌연변이 유발에 유용한 방법입니다. Tol2 트랜스포존 시스템은 긴 이중 가닥 RNA14에서 처리되는 siRNA의 게놈 통합에 의한 표적 유전자의 조건부 녹다운에 성공적으로 사용되었습니다.
이 프로토콜은 Tol2 트랜스포존 시스템15,16에 의한 인공 마이크로RNA(miRNA)의 도입을 포함하는 병아리 배아에서의 기능 상실 접근법을 설명한다. 이 접근법에서는 표적 유전자에 대한 EmGFP(에메랄드 그린 형광 단백질) 마커 및 인공 miRNA에 대한 발현 카세트를 Tol2 트랜스포존 벡터에 클로닝합니다. 이어서, Tol2 트랜스포존 구축물은 난소 전기천공에 의해 Tol2 트랜스포사제 발현 구축물과 함께 배아 병아리 망막 내로 도입된다. 형질감염된 망막 세포에서 전이효소는 트랜스포존 벡터에서 발현 카세트의 절제와 숙주 염색체로의 통합을 촉매하여 miRNA 및 EmGFP 단백질의 안정적인 발현을 유도합니다. 우리의 이전 연구에서, 우리는 발달중인 병아리 망막에서 신경계에서 주로 발현되는 세포 외 당 단백질 인 Nel의 발현을 성공적으로 무너 뜨 렸습니다 (대표 결과 참조). 우리의 결과는 이 기술에 의해 ovo에서 안정적이고 효율적인 유전자 억제가 달성될 수 있음을 나타냅니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 G needle, 2&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89219-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP-TAG kit A and AP-TAG kit B</td>
			<td>GenHunter Corp</td>
			<td>Q201 and Q202</td>
			<td>Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block-iT RNAi Designer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA 10 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C115CB cables</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>C115CB</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;254</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C117 cables</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>C117</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;252</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles)</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td>1 mm O.D. 0.75 mm I.D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUY21 square wave electroporator</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethanolamine (pH 9.8)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>Kurl</td>
			<td>B-Lab-600-110</td>
			<td>https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>CUY580</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrodes</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY611P3-1</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromax DH10B</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18290-015</td>
			<td>Electrocompetent E. coli cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)</td>
			<td>Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gooseneck fiber light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGene 6 transfection reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (50 &#956;L)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>20715</td>
			<td>Hamilton Cat No&#160; 80901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heavy mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>330760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Homoarginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H10007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige (Japan)</td>
			<td>MM3</td>
			<td>http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Shutter Instrument</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Nitrophenylphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>20-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS-T2TP vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F566S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer (Optional)</td>
			<td>Parker</td>
			<td></td>
			<td>Pressure microinjection system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Plasmid maxiprep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2K-CAGGS vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC tubing</td>
			<td>VWR (UK)</td>
			<td>228-3830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9007-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K493600</td>
			<td>Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

loss-of-function approach in the embryonic chick retina by using tol2 transposon-mediated transgenic expression of artificial micrornas

병아리 망막은 오랫동안 발달 신경 생물학에서 중요한 모델 시스템이었으며 큰 크기, 빠른 발달, 시각화 및 실험 조작을 위한 접근성 등의 장점이 있습니다. 그러나 주요 기술적 한계는 유전자 기능 분석을 위한 강력한 기능 상실 접근법이 없다는 것이었습니다. 이 프로토콜은 Tol2 트랜스포존 시스템을 사용하여 인공 microRNA(miRNA)의 형질전환 발현을 포함하는 발달 중인 병아리 망막에서 유전자 침묵 방법론을 설명합니다. 이 접근법에서, EmGFP(에메랄드 그린 형광 단백질) 마커에 대한 발현 카세트와 표적 유전자에 대한 인공 pre-miRNA 서열을 포함하는 Tol2 트랜스포존 플라스미드는 난소 전기천공에 의해 Tol2 트랜스포사제 발현 구조체와 함께 배아 병아리 망막에 도입됩니다. 형질감염된 망막 세포에서 전이효소는 트랜스포존 벡터에서 발현 카세트의 절제와 숙주 염색체로의 통합을 촉매하여 miRNA 및 EmGFP 단백질의 안정적인 발현을 유도합니다. 이전 연구에서 우리는 이 기술을 사용하여 신경 발달에서 여러 기능을 발휘하는 당단백질인 Nel의 발현이 발달 중인 병아리 망막에서 크게 억제될 수 있음을 입증했습니다. 우리의 결과는 이 방법론이 유전자 발현의 안정적이고 강력한 억제를 유도하여 망막 발달 연구를 위한 효율적인 기능 상실 접근법을 제공한다는 것을 나타냅니다.

Nel에 대한 인공 miRNA의 발현을 위한 Tol2 트랜스포존 구조의 구성 넬(Nénural Epidermal growth factor(EGF)-Like; Nell2라고도 함)은 세포외 당단백질이다. 그것은 thrombospondin-1과 구조적 유사성을 가지고 있으며 주로 신경계에서 발현됩니다20,21. 우리는 이전에 Nel이 망막 신경절 세포15의 분화와 생존을 조절하고 망막 ?...

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Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs

우리는 ovo electroporation 및 Tol2 transposon 시스템을 사용하여 병아리 배아에 인공 마이크로 RNA 서열을 도입하고 게놈 통합하는 새로운 기능 상실 접근 방식을 개발했습니다. 이 기술은 개발 중 유전자 기능 연구를 위한 강력하고 안정적인 유전자 녹다운 방법론을 제공합니다.

인공 microRNA의 Tol2 Transposon-Mediated 형질전환 발현을 사용한 배아 병아리 망막의 기능 상실 접근법

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and ...

이 방법론은 병아리의 망막 발달 연구를 위한 기능 상실 접근법을 제공합니다. 이 기술은 망막의 특정 영역에서 표적 유전자의 신속하고 지속적인 억제를 지원합니다. 이 접근법은 신경 조직과 비신경 조직을 모두 포함하여 병아리 배아의 다른 부분에도 적용될 수 있습니다.oovo electroporation의 경우 25mg의 Fast Green FCF를 10ml의 PBS에 용해시켜 0.25%Fast Green 용액을 준비한 다음 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 여과합니다. 다음으로, microRNA 에메랄드 GFP 플라스미드와 Tol2 트랜스포사아제 발현 플라스미드를 2:1 비율로 혼합하여 DNA 칵테일 주사액을 제조한다. 그런 다음 주입 된 영역의 시각화를 위해 준비된 Fast Green 용액을 DNA 칵테일에 1 대 10 비율로 첨가하십시오.다음으로, 미세주입 장치를 설정한다. 이 장치는 해밀턴 주사기, 18 게이지 2 인치 바늘, 2 센티미터 길이의 폴리 염화 비닐 튜브 및 마이크로 피펫 바늘로 구성됩니다. 해밀턴 주사기에 중광유를 채운 다음 18게이지 바늘을 주사기에 부착하고 주사기 플런저를 눌러 바늘 내부 공간을 기름으로 채웁니다.다음으로 폴리염화비닐 튜브를 바늘 끝에 부착하고 튜브에 오일을 채웁니다. 당겨진 마이크로피펫 바늘을 튜브에 부착합니다. 그런 다음 미세 집게를 사용하여 해부 현미경으로 바늘 끝을 직경 10-20 마이크로 미터로 떼어 내고 작은 구멍을 만듭니다.바늘 전체에 기름을 채 웁니다. 다음으로, 5 마이크로 리터의 착색 된 DNA 칵테일을 페트리 접시에 넣는다. 해부 현미경 아래에서 마이크로 피펫 바늘의 끝을 페트리 접시의 DNA 용액에 넣고 용액을 천천히 바늘에 넣습니다.바늘 내부와 외부의 압력이 평형을 이룬 후 바늘 끝을 DNA 용액에서 꺼내 주사할 때까지 작은 비커에 멸균된 PBS에 담근다. 그런 다음 전기 천공 장치를 설정하려면 미세 조작기의 전극 홀더로 한 쌍의 백금 전극을 단단히 고정하십시오. 전극 끝 사이의 간격을 2mm로 조정하고 전극을 케이블로 구형파 펄스 발생기에 연결합니다.다음으로, DNA 미세 주입을 위해 인큐베이터에서 수정 된 화이트 레그혼 알을 제거하고 70 % 에탄올에 적신 티슈 페이퍼로 알의 표면을 닦습니다. 그런 다음 18 게이지 바늘을 10 밀리리터 주사기에 부착하고 노른자가 손상되지 않도록 아래쪽으로 기울어 진 계란의 뭉툭한 끝을 통해 바늘을 삽입합니다. 달걀에서 2-3 밀리리터의 알부민을 꺼낸 후 스카치 테이프로 구멍을 막고 배아와 유리막이 껍질에서 분리되도록하기 위해 달걀에 빛을 촛불로 촛불을 켭니다.다음으로, 집게를 사용하여 달걀 꼭대기에서 달걀 껍질을 제거하여 배아를 노출시킵니다. 전기천공 중 배아가 마르는 것을 방지하기 위해 한 번에 5개 이상의 알을 낳지 마십시오. 바늘 끝을 근위부에서 시신경에 45도 각도로 삽입하고 파란색 용액이 내강을 채울 때까지 플런저를 천천히 눌러 DNA 칵테일을 주입합니다.바늘을 빼고 끝을 PBS에 다시 넣습니다. electroporation의 경우 펄스 전압을 15V로, 펄스 길이를 15밀리초로, 펄스 간격을 915밀리초로, 펄스 수를 5로 설정합니다. 배아 위의 바이텔린 막에 HBSS 몇 방울을 추가한 후 미세 매니퓰레이터를 사용하여 전극을 배아의 전후 축에 수직인 HBSS로 내립니다.시신경의 양쪽에 전극을 놓고 전극이 배아나 혈관에 닿지 않도록 한 다음 펄스 전기장을 적용합니다. 전기천공이 완료되면 전극을 제거하고 알부민 축적을 방지하기 위해 물에 적신 멸균 면봉으로 전극을 부드럽게 청소합니다. 스카치 테이프로 창을 밀봉하고 원하는 발달 단계까지 배아를 재배양하십시오.개별적인 pre-microRNA 서열을 Nel AP 발현 HEK293T 세포 내로 형질감염시키는 것은 뉴클레오티드 482 내지 502, 910 내지 930, 및 2461 내지 2481에 대한 구축물에 의한 Nel 발현의 현저한 억제를 초래하였다. 두 개의 microRNA 서열을 연결하면 녹다운 효율이 크게 향상되었습니다. 세 가지 조합 모두 사슬이 없는 개별 pre-microRNA 서열에 비해 향상된 억제 활성을 보여주었습니다.형질감염 후 최소 13일에 강력한 억제가 관찰되었습니다. 뉴클레오티드 482 내지 502 및 2461 내지 2481을 표적으로 하는 Nel pre-microRNA 구조체를 트랜스포사제 발현 벡터와 함께 병아리 망막 내로 공동 형질감염시켰을 때, 배아 4.5일째에 에메랄드 GFP 발현 세포에서 망막 색소 상피에서의 Nel 발현이 유의하게 감소하였다. 생후 8일 된 배아에서, Nel 발현은 또한 망막 신경절 세포에서 감소하였다.대조적으로, 망막에서의 Nel 발현은 대조군 microRNA의 도입에 의해 영향을 받지 않았다. 이 절차에 따라 세포 증식 및 분화, 세포 사멸, 세포 및 축삭 추적 검사와 같은 다양한 방법을 사용하여 표적 유전자 억제에 미치는 영향을 검사할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

척수 전기 생리학 II : 세포 흡입 전극 제작

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

연구

신경과학

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

의 활동을 Quantifying CIS</emExplant Electroporation하여 마우스 망막에서> - 규제 요소

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

복부 병아리 중뇌에있는 마이크로 RNA의 오보, 식

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

병아리 배아에서 축삭 궤적과 시냅스 대상을 추적하는 후뇌의 일렉트로

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

몸에 붙이기 형질 전환 쥐의 발생에 의해<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로 및<em&gt; 생체 내</em&gt; 생물 발광 상영

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

마우스 망막을 사용하여 중추 신경계의 혈관 재생의 평가

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

electroporation하여 병아리 배아 척수에서 차동 유전자 발현의 RNA-SEQ 분석

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning

쥐 망막 및 원격 사지 허혈 양상의 보호 효과에 기능을 평가하기 위해 전위도를 사용하여

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Thy1를 사용 하 여 기본 Somatosensory 피 질에서 신경 활동을 이미징-GCaMP6s 유전자 변형 쥐

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저 효과 특성 인공 microRNAs Optogenetics 결합

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...