Name: loss-of-function approach in the embryonic chick retina by using tol2 transposon-mediated transgenic expression of artificial micrornas
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs at JoVE.com

pT2K-CAGGS- og pCAGGS-T2TP-vektorene ble levert av henholdsvis Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Kyoto, Japan) og Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Mishima, Japan). Vi takker Michael Berberoglu for hans avgjørende lesning av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Royal Society and Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (UK) til M.N.

1. Konstruksjon av miRNA-ekspresjonsvektorer
MERK: Prosedyrene for konstruksjon av miRNA-ekspresjonsvektorer (trinn 1.1-1.3, 1.5-1.6.) er optimalisert for miRNA-uttrykkssettet, Block-iT Pol II miR RNA-uttrykkssett med EmGFP, som tidligere beskrevet15,16. Settet inneholder ekspresjonsvektoren designet for å tillate miRNA-ekspresjon (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), en kontrollvektor (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativt kontrollpla...

<ol>
	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).</li><li>Funahashi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Pax-5+in+the+regulation+of+a+mid-hindbrain+organizer's+activity.">Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer's activity.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).</li><li>Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+methods+in+chick+embryos.">In ovo electroporation methods in chick embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).</li><li>Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+retroviral+pathogenesis+by+RNA+interference.">Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference.</a> Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).</li><li>Katahira, T., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+chick+embryos+with+a+vector-based+small+interfering+RNA+system.">Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).</li><li>Harpavat, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RCAS-RNAi:+a+loss-of-function+method+for+the+developing+chick+retina.">RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina.</a> BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation.">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Methods. 24, 43-48 (2001).</li><li>Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+DNA+transposon+as+a+natural+mutator:+the+medaka+fish+Tol2+element+contributes+to+genetic+variation+without+recognizable+traces.">Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces.</a> Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).</li><li>Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+functional+transposase+of+the+Tol2+element,+an+Ac-like+element+from+the+Japanese+medaka+fish,+and+its+transposition+in+the+zebrafish+germ+lineage.">Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).</li><li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excision+of+the+Tol2+transposable+element+of+the+medaka+fish+Oryzias+latipes+in+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis.">Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Gene. 338 (1), 93-98 (2004).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Developmental Biology. 2 (2), 616-624 (2007).</li><li>Kawakami, K., Noda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+the+Tol2+element,+an+Ac-like+element+from+the+Japanese+medaka+fish+Oryzias+latipes,+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells.</a> Genetics. 166 (2), 895-899 (2004).</li><li>Hou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+knockdown+of+target+gene+expression+by+tetracycline+regulated+transcription+of+double+strand+RNA.">Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 53, 69-75 (2011).</li><li>Nakamoto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nel+positively+regulates+the+genesis+of+retinal+ganglion+cells+by+promoting+their+differentiation+and+survival+during+development.">Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).</li><li>Nakamoto, M., Nakamoto, C., Mao, C. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. 8, 91-108 (2020).</li><li>BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&amp;title=BLOCK-iT&amp;trade">https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&amp;title=BLOCK-iT&amp;trade</a> (2021)</li><li>Flanagan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase+fusions+of+ligands+or+receptors+as+in+situ+probes+for+staining+of+cells,+tissues,+and+embryos.">Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos.</a> Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Matsuhashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+gene,+nel,+encoding+a+M(r)+93+K+protein+with+EGF-like+repeats+is+strongly+expressed+in+neural+tissues+of+early+stage+chick+embryos.">New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos.</a> Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).</li><li>Matsuhashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+gene,+nel,+encoding+a+Mr+91+K+protein+with+EGF-like+repeats+is+strongly+expressed+in+neural+tissues+of+early+stage+chick+embryos.">New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos.</a> Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+guidance+of+retinal+axons+by+a+tectal+lamina-specific+glycoprotein+Nel.">In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).</li><li>Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+Nel,+a+Thrombospondin-1-like+glycoprotein+involved+in+neural+development+and+functions.">Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).</li><li>Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nell2+regulates+the+contralateral-versus-ipsilateral+visual+projection+as+a+domain-specific+positional+cue.">Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue.</a> Development. 146 (4), (2019).</li><li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+from+transcriptionally+disabled+retroviral+vectors.">Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).</li></ol>

Denne protokollen gir en detaljert veiledning til geninaktivering i den utviklende kyllingnetthinnen ved transgen ekspresjon av kunstige miRNA ved bruk av ovo-elektroporering og Tol2-transposonsystemet.
Følgende faktorer er av avgjørende betydning for å utføre denne teknikken vellykket. For det første er det kritisk å bruke miRNA-sekvenser som er bekreftet for å utøve robuste knockdown-effekter. Før du bruker dem til ovo-elektroporering, test individuelle pre-miRNA-...

Virveldyrets netthinne er et viktig modellsystem for å studere nevral utvikling. Til tross for sin perifere plassering er netthinnen anatomisk og utviklingsmessig en forlengelse av sentralnervesystemet, og optisk nerve, som består av axoner av retinale ganglionceller, representerer en kanal i sentralnervesystemet. Chick retina har betydelige fordeler som et modellsystem for å studere den molekylære mekanismen for nevral utvikling: Den er stor og utvikler seg raskt; den har strukturelle og funksjonelle likheter med den menneskelige netthinnen; Det er svært tilgjengelig for visualisering og eksperimentelle manipulasjoner. Molekylære mekanismer for celleproliferasjon og differensiering, morfogenese og aksonveiledning under nevral utvikling har blitt grundig studert ved bruk av kyllingnetthinnen.
I ovo har elektroporering blitt brukt i løpet av de siste to tiårene for å introdusere ektopiske gener i celler i det utviklende kyllingembryoet. Denne teknikken tillater merking av utviklingsceller, sporing av celleskjebne og sporing av cellemigrasjon og aksonkanaler, samt ektopisk genuttrykk for in vivo-analyse av genfunksjon. Betingelsene for in ovo elektroporering for effektiv ektopisk genekspresjon i kyllingembryoer har vært godt etablert 1,2,3.
Til tross for disse fordelene hadde mangelen på en stabil tap-av-funksjon-teknikk for studier av genfunksjon vært en stor teknisk begrensning for kyllingembryoet. Mens kyllingembryoer elektroporert med små forstyrrende RNA (siRNAer)4 eller ekspresjonsvektorer for korte hårnåls-RNA (shRNA)5 viser nedslag av det målrettede genet, er genundertrykkelse i disse tilnærmingene forbigående fordi effektene forsvinner når cellene mister de introduserte RNAene eller DNAene. En mer stabil genundertrykkelse kan oppnås ved å levere siRNA til kyllingembryoer ved hjelp av et RCAS (R-eplikasjon Competent Avian sarkom-leukosevirus (ASLV) long terminal repeat (LTR) med en Splice acceptor) retrovirussystem 6. Den virale vektoren integreres i vertsgenomet, og ektopiske gener uttrykkes stabilt. Imidlertid kan retroviruset bare integreres i genomet av delende celler under den mitotiske (M) fasen av cellesyklusen, noe som kan pålegge en begrensning på utviklingsstadiene og / eller celletypene som denne tap-av-funksjon-tilnærmingen kan brukes på. I tillegg virker ekspresjon av transgener av RCAS langsommere og mindre robust enn det som induseres av i ovo elektroporering7.
Transposoner er genetiske elementer som beveger seg fra ett sted på genomet til et annet. Tol2-elementet er medlem av hAT-transponerbar elementfamilie og inneholder et internt gen som koder for en transposase som katalyserer transposonreaksjonen til Tol2-elementet8. Når en plasmidvektor som bærer en genuttrykkskassett flankert av sekvensene av venstre og høyre ende av Tol2-elementene (henholdsvis 200 bp og 150 bp) blir introdusert i virveldyrceller med en Tol2-transposaseekspresjonskonstruksjon, blir ekspresjonskassetten skåret ut fra plasmidet og integrert i vertsgenomet, som støtter et stabilt uttrykk av ektopisk gen (figur 1). Det har vist seg at det transponerbare elementet Tol2 kan indusere gentransposisjon svært effektivt hos forskjellige virveldyrarter, inkludert sebrafisk9,10, frosker 11, kyllinger 12 og mus 13, og er dermed en nyttig metode for transgenese og innsettingsmutagenese. Tol2-transposonsystemet har blitt brukt til betinget knockdown av et målgen ved genomisk integrasjon av siRNA som behandles fra langt dobbeltstrenget RNA14.
Denne protokollen beskriver en tap-av-funksjon-tilnærming i kyllingembryoet som involverer innføring av kunstige mikroRNA (miRNA) av Tol2-transposonsystemet15,16. I denne tilnærmingen klones en ekspresjonskassett for EmGFP-markøren (smaragdgrønt fluorescerende protein) og kunstige miRNA mot et målgen til en Tol2-transposonvektor. Tol2 transposon-konstruksjonen blir deretter introdusert i den embryonale chick retina med en Tol2 transposase ekspresjonskonstruksjon ved i ovo elektroporering. I de transfekterte retinale cellene katalyserer transposasen eksisjonen av ekspresjonskassetten fra transposonvektoren og dens integrasjon i vertskromosomer, noe som fører til stabilt uttrykk for miRNA og EmGFP-proteinet. I våre tidligere studier slo vi vellykket ned uttrykket av Nel, et ekstracellulært glykoprotein hovedsakelig uttrykt i nervesystemet, i den utviklende kyllingretina (se representative resultater). Våre resultater tyder på at stabil og effektiv gensuppresjon kan oppnås i ovo ved denne teknikken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 G needle, 2&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89219-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP-TAG kit A and AP-TAG kit B</td>
			<td>GenHunter Corp</td>
			<td>Q201 and Q202</td>
			<td>Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block-iT RNAi Designer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA 10 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C115CB cables</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>C115CB</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;254</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C117 cables</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>C117</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;252</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles)</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td>1 mm O.D. 0.75 mm I.D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUY21 square wave electroporator</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethanolamine (pH 9.8)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>Kurl</td>
			<td>B-Lab-600-110</td>
			<td>https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>CUY580</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrodes</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY611P3-1</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromax DH10B</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18290-015</td>
			<td>Electrocompetent E. coli cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)</td>
			<td>Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gooseneck fiber light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGene 6 transfection reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (50 &#956;L)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>20715</td>
			<td>Hamilton Cat No&#160; 80901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heavy mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>330760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Homoarginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H10007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige (Japan)</td>
			<td>MM3</td>
			<td>http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Shutter Instrument</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Nitrophenylphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>20-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS-T2TP vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F566S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer (Optional)</td>
			<td>Parker</td>
			<td></td>
			<td>Pressure microinjection system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Plasmid maxiprep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2K-CAGGS vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC tubing</td>
			<td>VWR (UK)</td>
			<td>228-3830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9007-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K493600</td>
			<td>Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

loss-of-function approach in the embryonic chick retina by using tol2 transposon-mediated transgenic expression of artificial micrornas

Chick retina har lenge vært et viktig modellsystem i utviklingsnevrobiologi, med fordeler som inkluderer sin store størrelse, raske utvikling og tilgjengelighet for visualisering og eksperimentelle manipulasjoner. Den største tekniske begrensningen hadde imidlertid vært mangelen på robuste tap-av-funksjon-tilnærminger for genfunksjonsanalyser. Denne protokollen beskriver en metodikk for geninaktivering i den utviklende kyllingnetthinnen som involverer transgen ekspresjon av kunstige mikroRNA (miRNA) ved bruk av Tol2-transposonsystemet. I denne tilnærmingen blir et Tol2-transposonplasmid som inneholder en ekspresjonskassett for EmGFP-markøren (smaragdgrønt fluorescerende protein) og kunstige pre-miRNA-sekvenser mot et målgen introdusert i den embryonale kyllingnetthinnen med en Tol2-transposaseuttrykkskonstruksjon ved i ovo-elektroporering . I de transfekterte retinale cellene katalyserer transposasen eksisjonen av ekspresjonskassetten fra transposonvektoren og dens integrasjon i vertskromosomer, noe som fører til stabilt uttrykk for miRNA og EmGFP-proteinet. I vår tidligere studie har vi vist at uttrykket av Nel, et glykoprotein som utøver flere funksjoner i nevral utvikling, kan undertrykkes betydelig i den utviklende kyllingnetthinnen ved å bruke denne teknikken. Våre resultater indikerer at denne metodikken induserer en stabil og robust undertrykkelse av genuttrykk og dermed gir en effektiv tap-av-funksjon-tilnærming for studier av netthinneutvikling.

Konstruksjon av Tol2 transposon konstruksjoner for uttrykk av kunstige miRNA mot Nel Nel (Neural Epidermal growth factor (EGF)-Like; også kjent som Nell2) er et ekstracellulært glykoprotein. Det har strukturelle likheter med trombospondin-1 og uttrykkes hovedsakelig i nervesystemet20,21. Vi har tidligere vist at Nel regulerer differensiering og overlevelse av retinale ganglionceller15 og fungerer ...

Watch this Scientific Journal Video about Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs at JoVE.com

Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs

Vi har utviklet en ny tap-av-funksjon-tilnærming som involverer introduksjon og genomisk integrering av kunstige mikro-RNA-sekvenser i kyllingembryoer ved bruk i ovo-elektroporering og Tol2-transposonsystemet. Denne teknikken gir en robust og stabil genknockdown-metodikk for studier av genfunksjon under utvikling.

Tap-av-funksjon tilnærming i den embryonale Chick Retina ved bruk av Tol2 transposonmediert transgen ekspresjon av kunstige mikroRNA

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and ...

Denne metodikken gir en tap-av-funksjon-tilnærming for studier av retinal utvikling hos kyllingen. Denne teknikken støtter rask og vedvarende undertrykkelse av målgener i et bestemt område av netthinnen. Denne tilnærmingen kan også brukes på andre deler av kyllingembryoet, inkludert både nevrale og ikke-nevrale vev.For i ovo elektroporering, forberede en 0,25% Fast Green løsning ved å oppløse 25 milligram Fast Green FCF i 10 ml PBS, deretter filtrere løsningen ved hjelp av en 0,2 mikron sprøyte filter. Forbered deretter DNA-cocktailinjeksjonsløsningen ved å blande mikroRNA-smaragd GFP-plasmidet med Tol2-transposaseekspresjonsplasmidet i forholdet to til ett. Deretter tilsettes den forberedte Fast Green-løsningen til DNA-cocktailen i forholdet ett til 10 for visualisering av det injiserte området.Sett deretter opp mikroinjeksjonsapparatet. Apparatet består av en Hamilton sprøyte, en 18 gauge to tommers nål, en to centimeter lang polyvinylkloridslange og en mikropipettenål. Fyll Hamilton-sprøyten med tung mineralolje, fest deretter 18 gauge kanylen til sprøyten, og fyll det indre rommet av nålen med olje ved å trykke inn sprøytestempelet.Fest deretter polyvinylkloridslangen til enden av nålen, og fyll slangen med oljen. Fest den trukne mikropipettkanylen til slangen. Deretter under dissekeringsmikroskopet ved hjelp av fine tang, bryt av nålens spiss til en diameter på 10 til 20 mikrometer for å lage en liten åpning.Fyll hele kanylen med olje. Deretter legger du fem mikroliter av den fargede DNA-cocktailen på en petriskål. Under dissekeringsmikroskopet, plasser spissen av mikropipettnålen inn i DNA-løsningen på petriskålen, og trekk sakte oppløsningen inn i nålen.Etter at trykket har likevektet på innsiden og utsiden av nålen, ta spissen av nålen ut av DNA-oppløsningen, og hold den nedsenket i steril PBS i et lite beger til injeksjon. For å sette opp elektroporasjonsapparatet, sett deretter et par platinaelektroder fast med en elektrodeholder på en mikromanipulator. Juster avstanden mellom tuppen av elektrodene til to millimeter, og koble elektrodene til en firkantbølgepulsgenerator med kabler.Neste, for DNA-mikroinjeksjon, fjern et befruktet hvitt leghornegg fra inkubatoren og tørk eggets overflate med silkepapir gjennomvåt i 70% etanol. Fest deretter en 18 gauge nål til en 10 ml sprøyte, og sett nålen gjennom den stumpe enden av egget, vinklet nedover for å unngå å skade eggeplommen. Etter å ha trukket to til tre milliliter albumin fra egget, forsegl hullet med et stykke scotch tape, og stearinlys egget med lys for å sikre at embryoet og vitelline membranen løsnes fra skallet.Deretter fjerner du et stykke eggeskall fra toppen av egget ved hjelp av tang, og utsetter embryoet. Ikke vindu mer enn fem egg til enhver tid for å forhindre uttørking av embryoer under elektroporering. Sett spissen av nålen inn i optisk vesikkel fra sin proksimale side i en 45 graders vinkel, og injiser DNA-cocktailen ved sakte å trykke ned stempelet til den blåfargede løsningen fyller lumen.Trekk kanylen ut og sett spissen tilbake i PBS. For elektroporering, sett pulsspenningen til 15 volt, pulslengden til 15 millisekunder, pulsintervallet til 915 millisekunder og pulsnummer til fem. Etter å ha tilsatt noen dråper HBSS på vitellinemembranen over embryoet, bruk mikromanipulatoren til å senke elektrodene inn i HBSS vinkelrett på embryoets fremre bakre akse.Plasser elektrodene på hver side av den optiske vesikkelen, slik at elektrodene ikke berører embryoet eller blodkarene, og bruk deretter pulserende elektriske felt. Etter at elektroporeringen er fullført, fjern elektrodene og rengjør elektrodene forsiktig med en vannfuktet steril bomullspinne for å unngå albuminakkumulering. Forsegl vinduet med scotch tape, og reinkuber embryoet til ønsket utviklingsstadium.Transfeksjon av individuelle pre-mikroRNA-sekvenser til Nel AP som uttrykker HEK293T celler resulterte i signifikant undertrykkelse av Nel-ekspresjon ved konstruksjoner mot nukleotider 482 til 502, 910 til 930 og 2461 til 2481. Kjetting av to mikroRNA-sekvenser forbedret knockdown-effektiviteten betydelig. Alle tre kombinasjonene viste forsterkede undertrykkelsesaktiviteter sammenlignet med ukjedede individuelle pre-mikroRNA-sekvenser.Robust suppresjon ble observert minst 13 dager etter transfeksjon. Når en Nel pre-microRNA-konstruksjon rettet mot nukleotider 482 til 502 og 2461 til 2481 ble co-transfektet med transposase-ekspresjonsvektoren i kyllingnetthinnen, ble Nel-ekspresjon i retinalpigmentepitelet signifikant redusert i smaragd GFP-uttrykkende celler ved embryonal dag 4,5. I åtte dager gamle embryoer ble Nel-uttrykket også redusert i retinale ganglionceller.I motsetning til dette ble Nel-uttrykk i netthinnen ikke påvirket av introduksjonen av kontrollmikroRNA. Etter denne prosedyren kan effekter på målgenundertrykkelse undersøkes ved hjelp av ulike metoder som undersøkelser av celleproliferasjon og differensiering, celledød og celle- og aksonsporing.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

I ovo Expression av mikroRNA i ventral Chick midthjernen

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation av hindbrain å spore Aksonal Trajectories og Synaptic Targets i Chick Embryo

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generering av Topically Transgene Rats etter<em&gt; I utero</em&gt; Electroporation og<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminesens Screening

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Assessment of Vascular Regeneration i CNS Bruke musen Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq Analyse av Differential Gene Expression i elektroporerte Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning

Bruke elektroretinogrammet å vurdere funksjonen til gnager Retina og den beskyttende effekten av Remote Limb iskemisk prekondisjonering

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging nevrale aktivitet i primære Somatosensory Cortex ved hjelp av Thy1-GCaMP6s transgene mus

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Kombinere Optogenetics med kunstig microRNAs å karakterisere effekter av Gene Knockdown Presynaptic funksjonen i intakt nevrale kretser

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...