Name: loss-of-function approach in the embryonic chick retina by using tol2 transposon-mediated transgenic expression of artificial micrornas
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
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Os vetores pT2K-CAGGS e pCAGGS-T2TP foram gentilmente cedidos por Yoshiko Takahashi (Universidade de Kyoto, Kyoto, Japão) e Koichi Kawakami (Instituto Nacional de Genética, Mishima, Japão), respectivamente. Agradecemos a Michael Berberoglu por sua leitura crucial do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por bolsas da Royal Society and Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (Reino Unido) para M.N.

1. Construção de vetores de expressão de miRNA
NOTA: Os procedimentos para a construção de vetores de expressão de miRNA (etapas 1.1-1.3, 1.5-1.6.) são otimizados para o kit de expressão de miRNA, Block-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP, conforme descrito anteriormente15,16. O kit fornece o vetor de expressão projetado para permitir a expressão de miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), um vetor de controle ...

<ol>
	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).</li><li>Funahashi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Pax-5+in+the+regulation+of+a+mid-hindbrain+organizer's+activity.">Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer's activity.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).</li><li>Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+methods+in+chick+embryos.">In ovo electroporation methods in chick embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).</li><li>Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+retroviral+pathogenesis+by+RNA+interference.">Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference.</a> Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).</li><li>Katahira, T., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+chick+embryos+with+a+vector-based+small+interfering+RNA+system.">Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).</li><li>Harpavat, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RCAS-RNAi:+a+loss-of-function+method+for+the+developing+chick+retina.">RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina.</a> BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation.">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Methods. 24, 43-48 (2001).</li><li>Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+DNA+transposon+as+a+natural+mutator:+the+medaka+fish+Tol2+element+contributes+to+genetic+variation+without+recognizable+traces.">Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces.</a> Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).</li><li>Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+functional+transposase+of+the+Tol2+element,+an+Ac-like+element+from+the+Japanese+medaka+fish,+and+its+transposition+in+the+zebrafish+germ+lineage.">Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).</li><li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excision+of+the+Tol2+transposable+element+of+the+medaka+fish+Oryzias+latipes+in+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis.">Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Gene. 338 (1), 93-98 (2004).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Developmental Biology. 2 (2), 616-624 (2007).</li><li>Kawakami, K., Noda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+the+Tol2+element,+an+Ac-like+element+from+the+Japanese+medaka+fish+Oryzias+latipes,+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells.</a> Genetics. 166 (2), 895-899 (2004).</li><li>Hou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+knockdown+of+target+gene+expression+by+tetracycline+regulated+transcription+of+double+strand+RNA.">Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 53, 69-75 (2011).</li><li>Nakamoto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nel+positively+regulates+the+genesis+of+retinal+ganglion+cells+by+promoting+their+differentiation+and+survival+during+development.">Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).</li><li>Nakamoto, M., Nakamoto, C., Mao, C. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. 8, 91-108 (2020).</li><li>BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&amp;title=BLOCK-iT&amp;trade">https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&amp;title=BLOCK-iT&amp;trade</a> (2021)</li><li>Flanagan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase+fusions+of+ligands+or+receptors+as+in+situ+probes+for+staining+of+cells,+tissues,+and+embryos.">Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos.</a> Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Matsuhashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+gene,+nel,+encoding+a+M(r)+93+K+protein+with+EGF-like+repeats+is+strongly+expressed+in+neural+tissues+of+early+stage+chick+embryos.">New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos.</a> Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).</li><li>Matsuhashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+gene,+nel,+encoding+a+Mr+91+K+protein+with+EGF-like+repeats+is+strongly+expressed+in+neural+tissues+of+early+stage+chick+embryos.">New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos.</a> Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+guidance+of+retinal+axons+by+a+tectal+lamina-specific+glycoprotein+Nel.">In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).</li><li>Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+Nel,+a+Thrombospondin-1-like+glycoprotein+involved+in+neural+development+and+functions.">Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).</li><li>Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nell2+regulates+the+contralateral-versus-ipsilateral+visual+projection+as+a+domain-specific+positional+cue.">Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue.</a> Development. 146 (4), (2019).</li><li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+from+transcriptionally+disabled+retroviral+vectors.">Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).</li></ol>

Este protocolo fornece um guia detalhado para o silenciamento gênico na retina de pintinhos em desenvolvimento pela expressão transgênica de miRNAs artificiais usando eletroporação em ovo e o sistema transposon Tol2.
Os seguintes fatores são de fundamental importância para a realização bem-sucedida desta técnica. Primeiro, é fundamental usar sequências de miRNA que são confirmadas para exercer efeitos knockdown robustos. Antes de aplicá-los para eletroporação in ov...

A retina de vertebrados é um importante sistema modelo para o estudo do desenvolvimento neural. Apesar de sua localização periférica, a retina é anatômica e em desenvolvimento uma extensão do sistema nervoso central, e o nervo óptico, que consiste em axônios de células ganglionares da retina, representa um trato dentro do sistema nervoso central. A retina de pintinhos tem vantagens significativas como um sistema modelo para estudar o mecanismo molecular do desenvolvimento neural: é grande e se desenvolve rapidamente; tem semelhanças estruturais e funcionais com a retina humana; É altamente acessível para visualização e manipulações experimentais. Mecanismos moleculares de proliferação e diferenciação celular, morfogênese e orientação axonal durante o desenvolvimento neural têm sido extensivamente estudados usando a retina de galinha.
A eletroporação in ovo tem sido utilizada com sucesso nas últimas duas décadas para introduzir genes ectópicos em células do embrião de pintinhos em desenvolvimento. Esta técnica permite a marcação de células em desenvolvimento, o rastreamento do destino celular e o rastreamento da migração celular e dos tratos axonais, bem como a expressão gênica ectópica para análise in vivo da função gênica. As condições de eletroporação in ovo para a expressão gênica ectópica eficiente em embriões de pintinhos estão bem estabelecidas 1,2,3.
Apesar dessas vantagens, a falta de uma técnica estável de perda de função para estudos da função gênica tem sido uma grande limitação técnica do embrião de pintinho. Enquanto embriões de pintinhos eletroporados com pequenos RNAs interferentes (siRNAs)4 ou vetores de expressão para RNAs curtos (shRNAs)5 apresentam knockdown do gene alvo, a supressão gênica nessas abordagens é transitória porque os efeitos desaparecem quando as células perdem os RNAs ou DNAs introduzidos. Uma supressão gênica mais estável pode ser obtida pela entrega de siRNAs em embriões de pintos por um sistema de retrovírus RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with a Splice acceptor)6. O vetor viral integra-se ao genoma do hospedeiro, e os genes ectópicos são expressos de forma estável. No entanto, o retrovírus só pode se integrar ao genoma de células em divisão durante a fase mitótica (M) do ciclo celular, o que pode impor uma limitação nos estágios de desenvolvimento e/ou tipos celulares para os quais essa abordagem de perda de função pode ser aplicada. Além disso, a expressão de transgenes por RCAS parece mais lenta e menos robusta do que a induzida pela eletroporação in ovo 7.
Transposons são elementos genéticos que se movem de um local no genoma para outro. O elemento Tol2 é um membro da família de elementos transponíveis hAT e contém um gene interno que codifica uma transposase que catalisa a reação de transposon do elemento Tol28. Quando um vetor plasmidial que carrega um de expressão gênica flanqueado pelas sequências das extremidades esquerda e direita dos elementos Tol2 (200 pb e 150 pb, respectivamente) é introduzido em células vertebradas com uma construção de expressão de transposase de Tol2, o de expressão é extirpado do plasmídeo e integrado ao genoma do hospedeiro, o que suporta uma expressão estável do gene ectópico (Figura 1). Tem sido demonstrado que o elemento transponível Tol2 pode induzir a transposição gênica de forma muito eficiente em diferentes espécies de vertebrados, incluindo zebrafish9,10, rãs 11, pintos 12 e camundongos 13, sendo, portanto, um método útil de transgênese e mutagênese insercional. O sistema transposon Tol2 tem sido usado com sucesso para knockdown condicional de um gene alvo por integração genômica de siRNA que é processado a partir de RNA de fita dupla longa14.
Este protocolo descreve uma abordagem de perda de função no embrião de pintinho que envolve a introdução de microRNAs artificiais (miRNAs) pelo sistema transposon Tol215,16. Nesta abordagem, um de expressão para o marcador EmGFP (proteína fluorescente verde esmeralda) e miRNAs artificiais contra um gene alvo é clonado em um vetor transposon Tol2. A construção transposon Tol2 é então introduzida na retina embrionária de pintos com uma construção de expressão transposase Tol2 por eletroporação in ovo. Nas células retinianas transfectadas, a transposase catalisa a excisão do de expressão do vetor transposon e sua integração nos cromossomos do hospedeiro, levando à expressão estável de miRNAs e da proteína EmGFP. Em nossos estudos anteriores, derrubamos com sucesso a expressão de Nel, uma glicoproteína extracelular predominantemente expressa no sistema nervoso, na retina de pintinhos em desenvolvimento (ver Resultados Representativos). Nossos resultados indicam que a supressão gênica estável e eficiente pode ser alcançada em ovo por esta técnica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 G needle, 2&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89219-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP-TAG kit A and AP-TAG kit B</td>
			<td>GenHunter Corp</td>
			<td>Q201 and Q202</td>
			<td>Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block-iT RNAi Designer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA 10 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C115CB cables</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>C115CB</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;254</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C117 cables</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>C117</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;252</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles)</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td>1 mm O.D. 0.75 mm I.D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUY21 square wave electroporator</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethanolamine (pH 9.8)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>Kurl</td>
			<td>B-Lab-600-110</td>
			<td>https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>CUY580</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrodes</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY611P3-1</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromax DH10B</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18290-015</td>
			<td>Electrocompetent E. coli cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)</td>
			<td>Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gooseneck fiber light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGene 6 transfection reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (50 &#956;L)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>20715</td>
			<td>Hamilton Cat No&#160; 80901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heavy mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>330760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Homoarginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H10007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige (Japan)</td>
			<td>MM3</td>
			<td>http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Shutter Instrument</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Nitrophenylphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>20-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS-T2TP vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F566S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer (Optional)</td>
			<td>Parker</td>
			<td></td>
			<td>Pressure microinjection system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Plasmid maxiprep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2K-CAGGS vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC tubing</td>
			<td>VWR (UK)</td>
			<td>228-3830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9007-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K493600</td>
			<td>Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

loss-of-function approach in the embryonic chick retina by using tol2 transposon-mediated transgenic expression of artificial micrornas

A retina de pintinhos tem sido um importante sistema modelo em neurobiologia do desenvolvimento, com vantagens que incluem seu grande tamanho, rápido desenvolvimento e acessibilidade para visualização e manipulações experimentais. No entanto, sua principal limitação técnica tem sido a falta de abordagens robustas de perda de função para análises de função gênica. Este protocolo descreve uma metodologia de silenciamento gênico na retina de pintinhos em desenvolvimento que envolve a expressão transgênica de microRNAs artificiais (miRNAs) usando o sistema transposon Tol2. Nesta abordagem, um plasmídeo transposon Tol2 que contém um de expressão para o marcador EmGFP (proteína fluorescente verde esmeralda) e sequências artificiais de pré-miRNA contra um gene alvo é introduzido na retina embrionária de pintinhos com uma construção de expressão de transposase de Tol2 por eletroporação in ovo . Nas células retinianas transfectadas, a transposase catalisa a excisão do de expressão do vetor transposon e sua integração nos cromossomos do hospedeiro, levando à expressão estável de miRNAs e da proteína EmGFP. Em nosso estudo anterior, demonstramos que a expressão de Nel, uma glicoproteína que exerce múltiplas funções no desenvolvimento neural, pode ser significativamente suprimida na retina de pintinhos em desenvolvimento usando esta técnica. Nossos resultados indicam que esta metodologia induz uma supressão estável e robusta da expressão gênica e, portanto, fornece uma abordagem eficiente de perda de função para estudos do desenvolvimento da retina.

Construção de construtos de transposon Tol2 para expressão de miRNAs artificiais contra Nel Nel (Neural Epidermal growth factor (EGF)-Like; também conhecido como Nell2) é uma glicoproteína extracelular. Apresenta semelhanças estruturais com a trombospondina-1 e é predominantemente expressa no sistema nervoso20,21. Demonstramos anteriormente que o Nel regula a diferenciação e a sobrevivência das células ganglion...

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Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs

Desenvolvemos uma nova abordagem de perda de função que envolve a introdução e integração genômica de sequências artificiais de micro-RNA em embriões de pintinhos usando eletroporação em ovo e o sistema transposon Tol2. Esta técnica fornece uma metodologia robusta e estável de knockdown gênico para estudos da função gênica durante o desenvolvimento.

Abordagem da Perda de Função na Retina de Pintinhos Embrionários Utilizando a Expressão Transgênica Mediada por Transposon Tol2 de MicroRNAs Artificiais

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and ...

Esta metodologia fornece uma abordagem de perda de função para estudos do desenvolvimento da retina em pintinhos. Esta técnica suporta a supressão rápida e persistente de genes-alvo em uma área específica da retina. Esta abordagem também pode ser aplicada a outras partes do embrião de pintinho, incluindo os tecidos neurais e não neurais.Para eletroporação in ovo, prepare uma solução 0,25%Fast Green dissolvendo 25 miligramas de Fast Green FCF em 10 mililitros de PBS e, em seguida, filtre a solução usando um filtro de seringa de 0,2 mícron. Em seguida, prepare a solução de injeção de coquetel de DNA misturando o plasmídeo de GFP esmeralda de microRNA com o plasmídeo de expressão da transposase Tol2 em uma proporção de dois para um. Em seguida, adicione a solução Fast Green preparada ao coquetel de DNA na proporção de um para 10 para visualização da área injetada.Em seguida, configure o aparelho de microinjeção. O aparelho consiste em uma seringa de Hamilton, uma agulha de duas polegadas de calibre 18, um tubo de cloreto de polivinila de dois centímetros de comprimento e uma agulha de micropipeta. Encha a seringa de Hamilton com óleo mineral pesado, em seguida, prenda a agulha de calibre 18 à seringa e preencha o espaço interno da agulha com óleo, pressionando o êmbolo da seringa.Em seguida, prenda o tubo de cloreto de polivinila na extremidade da agulha e encha o tubo com o óleo. Conecte a agulha de micropipeta puxada à tubulação. Em seguida, sob o microscópio dissecante usando pinças finas, quebre a ponta da agulha para um diâmetro de 10 a 20 micrômetros para fazer uma pequena abertura.Encha toda a agulha com óleo. Em seguida, coloque cinco microlitros do coquetel de DNA colorido em uma placa de Petri. Sob o microscópio dissecante, coloque a ponta da agulha de micropipeta na solução de DNA na placa de Petri e lentamente puxe a solução para dentro da agulha.Depois que a pressão tiver se equilibrado dentro e fora da agulha, retire a ponta da agulha da solução de DNA e mantenha-a submersa em PBS estéril em um copo pequeno até a injeção. Em seguida, para montar o aparelho de eletroporação, ajuste um par de eletrodos de platina firmemente com um suporte de eletrodos em um micromanipulador. Ajuste o espaçamento entre a ponta dos eletrodos para dois milímetros e conecte os eletrodos a um gerador de pulsos de onda quadrada com cabos.Em seguida, para a microinjeção de DNA, remova um ovo fertilizado de White Leghorn da incubadora e limpe a superfície do ovo com papel de seda embebido em etanol 70%. Em seguida, prenda uma agulha calibre 18 a uma seringa de 10 mililitros e insira a agulha através da extremidade romba do ovo, inclinada para baixo para evitar danificar a gema. Depois de retirar dois a três mililitros de albumina do ovo, sele o orifício com um pedaço de fita adesiva e vele o ovo com luz para garantir que o embrião e a membrana vitelínica estejam desprendidos da casca.Em seguida, usando pinças, retire um pedaço de casca do ovo da parte superior do ovo, expondo o embrião. Não retire mais de cinco ovos ao mesmo tempo para evitar a secagem dos embriões durante a eletroporação. Insira a ponta da agulha na vesícula óptica a partir de seu lado proximal em um ângulo de 45 graus e injete o coquetel de DNA pressionando lentamente o êmbolo até que a solução de cor azul preencha o lúmen.Retire a agulha e coloque sua ponta de volta no PBS. Para eletroporação, ajuste a tensão de pulso para 15 volts, o comprimento do pulso para 15 milissegundos, o intervalo de pulso para 915 milissegundos e o número de pulso para cinco. Depois de adicionar algumas gotas de HBSS na membrana vitelínica sobre o embrião, use o micromanipulador para baixar os eletrodos no HBSS perpendicularmente ao eixo anteroposterior do embrião.Coloque os eletrodos em ambos os lados da vesícula óptica, garantindo que os eletrodos não toquem o embrião ou os vasos sanguíneos, em seguida, aplique campos elétricos pulsados. Após a eletroporação estar completa, remova os eletrodos e limpe suavemente os eletrodos com um cotonete estéril embebido em água para evitar o acúmulo de albumina. Sele a janela com fita adesiva e reincube o embrião até o estágio de desenvolvimento desejado.A transfecção de sequências individuais de pré-microRNA em Nel AP expressando células HEK293T resultou em supressão significativa da expressão de Nel por construções contra os nucleotídeos 482 a 502, 910 a 930 e 2461 a 2481. O encadeamento de duas sequências de microRNA aumentou significativamente a eficiência do knockdown. Todas as três combinações mostraram atividades de supressão aumentadas em comparação com sequências individuais de pré-microRNA desencadeadas.Supressão robusta foi observada pelo menos 13 dias após a transfecção. Quando uma construção de pré-microRNA de Nel visando os nucleotídeos 482 a 502 e 2461 a 2481 foi co-transfectada com o vetor de expressão de transposase para a retina de pintinhos, a expressão de Nel no epitélio pigmentar da retina foi significativamente reduzida em células de GFP esmeralda expressando células no dia embrionário 4.5. Em embriões de oito dias de idade, a expressão de Nel também diminuiu nas células ganglionares da retina.Em contraste, a expressão de Nel na retina não foi afetada pela introdução do microRNA controle. Após esse procedimento, os efeitos sobre a supressão do gene alvo podem ser examinados usando vários métodos, como exames de proliferação e diferenciação celular, morte celular e rastreamento celular e axonal.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Spinal Cord Eletrofisiologia II: Fabricação Eletrodo de Sucção Extracelular

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Neurociência

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Quantificar a atividade de Cis Elements-Regulação na retina do rato por Eletroporação Remoção

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Em Expression in ovo de microRNA em Ventral Pintinho Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Eletroporação do rombencéfalo rastrear Trajetórias axonal e Metas Synaptic no embrião de galinha

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Geração de topicamente transgênicas Rats por<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação e<em&gt; In vivo</em&gt; Triagem Bioluminescência

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Assessment of Vascular regeneração no SNC Usando o rato Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq Análise de Gene Expression Diferencial em electroporados Pintainho Embryonic Medular

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning

Usando o Eletrorretinograma na Avaliação da Função na Roedor Retina e os efeitos protetores do remoto Limb Pré-Condicionamento Isquêmico

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imagem de atividade Neural no córtex somatossensorial primário usando Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Combinação de Optogenetics com microRNAs Artificial para caracterizar os efeitos do Gene Knockdown na função pré-sináptica dentro circuitos neuronais intacta

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...