Name: loss-of-function approach in the embryonic chick retina by using tol2 transposon-mediated transgenic expression of artificial micrornas
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs at JoVE.com

pT2K-CAGGS ve pCAGGS-T2TP vektörleri sırasıyla Yoshiko Takahashi (Kyoto Üniversitesi, Kyoto, Japonya) ve Koichi Kawakami (Ulusal Genetik Enstitüsü, Mishima, Japonya) tarafından sağlanmıştır. Michael Berberoğlu'na makaleyi çok önemli bir şekilde okuduğu için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Royal Society ve Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi'nden (BBSRC) (İngiltere) MN'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.

1. miRNA ekspresyon vektörlerinin oluşturulması
NOT: miRNA ekspresyon vektörleri oluşturma prosedürleri (adım 1.1-1.3, 1.5-1.6.), daha önce açıklandığı gibi emGFP'li miRNA ekspresyon kiti, Block-iT Pol II miR RNA ekspresyon kiti için optimize edilmiştir15,16. Kit, miRNA ekspresyonuna (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), bir kontrol vektörüne (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negatif kontrol plazmidi), aksesuar reaktiflerin...

<ol>
	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).</li><li>Funahashi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Pax-5+in+the+regulation+of+a+mid-hindbrain+organizer's+activity.">Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer's activity.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).</li><li>Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+methods+in+chick+embryos.">In ovo electroporation methods in chick embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).</li><li>Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+retroviral+pathogenesis+by+RNA+interference.">Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference.</a> Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).</li><li>Katahira, T., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+chick+embryos+with+a+vector-based+small+interfering+RNA+system.">Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).</li><li>Harpavat, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RCAS-RNAi:+a+loss-of-function+method+for+the+developing+chick+retina.">RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina.</a> BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation.">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Methods. 24, 43-48 (2001).</li><li>Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+DNA+transposon+as+a+natural+mutator:+the+medaka+fish+Tol2+element+contributes+to+genetic+variation+without+recognizable+traces.">Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces.</a> Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).</li><li>Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+functional+transposase+of+the+Tol2+element,+an+Ac-like+element+from+the+Japanese+medaka+fish,+and+its+transposition+in+the+zebrafish+germ+lineage.">Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).</li><li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excision+of+the+Tol2+transposable+element+of+the+medaka+fish+Oryzias+latipes+in+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis.">Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Gene. 338 (1), 93-98 (2004).</li><li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Developmental Biology. 2 (2), 616-624 (2007).</li><li>Kawakami, K., Noda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+the+Tol2+element,+an+Ac-like+element+from+the+Japanese+medaka+fish+Oryzias+latipes,+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells.</a> Genetics. 166 (2), 895-899 (2004).</li><li>Hou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+knockdown+of+target+gene+expression+by+tetracycline+regulated+transcription+of+double+strand+RNA.">Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 53, 69-75 (2011).</li><li>Nakamoto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nel+positively+regulates+the+genesis+of+retinal+ganglion+cells+by+promoting+their+differentiation+and+survival+during+development.">Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).</li><li>Nakamoto, M., Nakamoto, C., Mao, C. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. 8, 91-108 (2020).</li><li>BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&amp;title=BLOCK-iT&amp;trade">https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&amp;title=BLOCK-iT&amp;trade</a> (2021)</li><li>Flanagan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+phosphatase+fusions+of+ligands+or+receptors+as+in+situ+probes+for+staining+of+cells,+tissues,+and+embryos.">Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos.</a> Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Matsuhashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+gene,+nel,+encoding+a+M(r)+93+K+protein+with+EGF-like+repeats+is+strongly+expressed+in+neural+tissues+of+early+stage+chick+embryos.">New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos.</a> Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).</li><li>Matsuhashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+gene,+nel,+encoding+a+Mr+91+K+protein+with+EGF-like+repeats+is+strongly+expressed+in+neural+tissues+of+early+stage+chick+embryos.">New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos.</a> Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+guidance+of+retinal+axons+by+a+tectal+lamina-specific+glycoprotein+Nel.">In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).</li><li>Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+Nel,+a+Thrombospondin-1-like+glycoprotein+involved+in+neural+development+and+functions.">Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).</li><li>Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nell2+regulates+the+contralateral-versus-ipsilateral+visual+projection+as+a+domain-specific+positional+cue.">Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue.</a> Development. 146 (4), (2019).</li><li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+from+transcriptionally+disabled+retroviral+vectors.">Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).</li></ol>

Bu protokol, in ovo elektroporasyon ve Tol2 transpozon sistemi kullanılarak yapay miRNA'ların transgenik ekspresyonu ile gelişmekte olan civciv retinasında gen susturma için ayrıntılı bir kılavuz sağlar.
Bu tekniğin başarılı bir şekilde uygulanmasında aşağıdaki faktörler kritik öneme sahiptir. İlk olarak, sağlam yıkım etkileri uyguladığı onaylanan miRNA dizilerini kullanmak çok önemlidir. Bunları in ovo elektroporasyon için uygulamadan önce, <...

Omurgalı retinası, nöral gelişimi incelemek için önemli bir model sistemdir. Periferik konumuna rağmen, retina anatomik ve gelişimsel olarak merkezi sinir sisteminin bir uzantısıdır ve retina ganglion hücrelerinin aksonlarından oluşan optik sinir, merkezi sinir sistemi içindeki bir yolu temsil eder. Civciv retinası, nöral gelişimin moleküler mekanizmasını incelemek için bir model sistem olarak önemli avantajlara sahiptir: Büyüktür ve hızla gelişir; İnsan retinası ile yapısal ve işlevsel benzerlikleri vardır; Görselleştirme ve deneysel manipülasyonlar için son derece erişilebilirdir. Nöral gelişim sırasında hücre proliferasyonu ve farklılaşması, morfogenez ve akson rehberliğinin moleküler mekanizmaları, tavuk retinası kullanılarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir.
In ovo elektroporasyon, gelişmekte olan civciv embriyosundaki hücrelere ektopik genleri sokmak için son yirmi yılda başarıyla kullanılmıştır. Bu teknik, gelişmekte olan hücrelerin etiketlenmesine, hücre kaderinin izlenmesine ve hücre göçü ve akson yollarının izlenmesine ve ayrıca gen fonksiyonunun in vivo analizi için ektopik gen ekspresyonuna izin verir. Civciv embriyolarında etkili ektopik gen ekspresyonu için in ovo elektroporasyonun koşulları iyi belirlenmiştir 1,2,3.
Bu avantajlara rağmen, gen fonksiyonu çalışmaları için kararlı bir fonksiyon kaybı tekniğinin olmaması, civciv embriyosunun önemli bir teknik sınırlaması olmuştur. Küçük enterferans yapan RNA'lar (siRNA'lar)4 veya kısa firkete RNA'ları (shRNA'lar) için ekspresyon vektörleri5 ile elektroporasyonlu civciv embriyoları, hedeflenen genin yıkıldığını gösterirken, bu yaklaşımlarda gen baskılanması geçicidir, çünkü hücreler eklenen RNA'ları veya DNA'ları kaybettiğinde etkiler ortadan kalkar. SiRNA'ların bir RCAS (Replication Copetent Avian sarkom-lökoz virüsü (ASLV) uzun terminal tekrarı (LTR) ile bir Splice alıcısı ile civciv embriyolarına verilmesiyle daha kararlı bir gen baskılanması sağlanabilir6. Viral vektör, konakçı genomuna entegre olur ve ektopik genler kararlı bir şekilde eksprese edilir. Bununla birlikte, retrovirüs yalnızca hücre döngüsünün mitotik (M) fazı sırasında bölünen hücrelerin genomuna entegre olabilir, bu da bu işlev kaybı yaklaşımının uygulanabileceği gelişim aşamaları ve/veya hücre tipleri üzerinde bir sınırlama getirebilir. Ek olarak, transgenlerin RCAS tarafından ekspresyonu, in ovo elektroporasyon7 tarafından indüklenenden daha yavaş ve daha az sağlam görünmektedir.
Transpozonlar, genom üzerinde bir konumdan diğerine hareket eden genetik elementlerdir. Tol2 elementi, hAT transpoze edilebilir element ailesinin bir üyesidir ve Tol2 elementi8'in transpozon reaksiyonunu katalize eden bir transpozazı kodlayan dahili bir gen içerir. Tol2 elementlerinin sol ve sağ uçlarının dizileri (sırasıyla 200 bp ve 150 bp) ile çevrili bir gen ekspresyon kaseti taşıyan bir plazmit vektörü, bir Tol2 transpozaz ekspresyon yapısına sahip omurgalı hücrelerine sokulduğunda, ekspresyon kaseti plazmitten çıkarılır ve ektopik genin kararlı bir ekspresyonunu destekleyen konakçı genomuna entegre edilir (Şekil 1). Tol2 transpoze elementinin, zebra balığı 9,10, kurbağalar11, civcivler 12 ve fareler 13 dahil olmak üzere farklı omurgalı türlerinde gen transpozisyonunu çok verimli bir şekilde indükleyebildiği ve bu nedenle yararlı bir transgenez ve insersiyonel mutajenez yöntemi olduğu gösterilmiştir. Tol2 transpozon sistemi, uzun çift sarmallı RNA14'ten işlenen siRNA'nın genomik entegrasyonu ile bir hedef genin koşullu yıkımı için başarıyla kullanılmıştır.
Bu protokol, civciv embriyosunda Tol2 transpozon sistemi15,16 tarafından yapay mikroRNA'ların (miRNA'lar) eklenmesini içeren bir fonksiyon kaybı yaklaşımını açıklar. Bu yaklaşımda, EmGFP (zümrüt yeşili floresan protein) belirteci ve bir hedef gene karşı yapay miRNA'lar için bir ekspresyon kaseti, bir Tol2 transpozon vektörüne klonlanır. Tol2 transpozon yapısı daha sonra in ovo elektroporasyon ile bir Tol2 transpozaz ekspresyon yapısı ile embriyonik civciv retinasına sokulur. Transfekte retinal hücrelerde, transpozaz, transpozon vektöründen ekspresyon kasetinin eksizyonunu ve konakçı kromozomlara entegrasyonunu katalize ederek miRNA'ların ve EmGFP proteininin kararlı ekspresyonuna yol açar. Önceki çalışmalarımızda, gelişmekte olan civciv retinasında, ağırlıklı olarak sinir sisteminde eksprese edilen hücre dışı bir glikoprotein olan Nel'in ekspresyonunu başarıyla düşürdük (bkz. Sonuçlarımız, bu teknikle ovoda stabil ve etkili gen baskılanmasının sağlanabileceğini göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 G needle, 2&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89219-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AP-TAG kit A and AP-TAG kit B</td>
			<td>GenHunter Corp</td>
			<td>Q201 and Q202</td>
			<td>Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Block-iT RNAi Designer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA 10 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C115CB cables</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>C115CB</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;254</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C117 cables</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>C117</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;252</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles)</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td>1 mm O.D. 0.75 mm I.D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUY21 square wave electroporator</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethanolamine (pH 9.8)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>Kurl</td>
			<td>B-Lab-600-110</td>
			<td>https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>CUY580</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrodes</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY611P3-1</td>
			<td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&#188;94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromax DH10B</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18290-015</td>
			<td>Electrocompetent E. coli cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)</td>
			<td>Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gooseneck fiber light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGene 6 transfection reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (50 &#956;L)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>20715</td>
			<td>Hamilton Cat No&#160; 80901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heavy mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>330760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Homoarginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H10007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige (Japan)</td>
			<td>MM3</td>
			<td>http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Shutter Instrument</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Nitrophenylphosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>20-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS-T2TP vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F566S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer (Optional)</td>
			<td>Parker</td>
			<td></td>
			<td>Pressure microinjection system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid maxi kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12163</td>
			<td>Plasmid maxiprep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pT2K-CAGGS vector</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC tubing</td>
			<td>VWR (UK)</td>
			<td>228-3830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9007-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K493600</td>
			<td>Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

loss-of-function approach in the embryonic chick retina by using tol2 transposon-mediated transgenic expression of artificial micrornas

Civciv retinası, büyük boyutu, hızlı gelişimi ve görselleştirme ve deneysel manipülasyonlar için erişilebilirliği gibi avantajları ile gelişimsel nörobiyolojide uzun zamandır önemli bir model sistem olmuştur. Bununla birlikte, en büyük teknik sınırlaması, gen fonksiyon analizleri için sağlam fonksiyon kaybı yaklaşımlarının olmamasıydı. Bu protokol, Tol2 transpozon sistemini kullanarak yapay mikroRNA'ların (miRNA'lar) transgenik ekspresyonunu içeren, gelişmekte olan civciv retinasında bir gen susturma metodolojisini açıklar. Bu yaklaşımda, EmGFP (zümrüt yeşili floresan protein) markörü için bir ekspresyon kaseti ve bir hedef gene karşı yapay pre-miRNA dizileri içeren bir Tol2 transpozon plazmidi, in ovo elektroporasyon ile bir Tol2 transpozaz ekspresyon yapısı ile embriyonik civciv retinasına sokulur. Transfekte retinal hücrelerde, transpozaz, transpozon vektöründen ekspresyon kasetinin eksizyonunu ve konakçı kromozomlara entegrasyonunu katalize ederek miRNA'ların ve EmGFP proteininin kararlı ekspresyonuna yol açar. Daha önceki çalışmamızda, nöral gelişimde birden fazla işlevi yerine getiren bir glikoprotein olan Nel'in ekspresyonunun bu tekniği kullanarak gelişmekte olan civciv retinasında önemli ölçüde baskılanabileceğini göstermiştik. Sonuçlarımız, bu metodolojinin gen ekspresyonunun kararlı ve sağlam bir şekilde baskılanmasına neden olduğunu ve böylece retina gelişimi çalışmaları için etkili bir fonksiyon kaybı yaklaşımı sağladığını göstermektedir.

Nel'e karşı yapay miRNA'ların ekspresyonu için Tol2 transpozon yapılarının yapımı Nel (Neural Epidermal büyüme faktörü (EGF)-Like; Nell2 olarak da bilinir) hücre dışı bir glikoproteindir. Trombospondin-1 ile yapısal benzerlikleri vardır ve ağırlıklı olarak sinir sistemindeeksprese edilir 20,21. Nel'in retinal ganglion hücrelerinin15 farklılaşmasını ve sağkalımını düz...

Watch this Scientific Journal Video about Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs at JoVE.com

Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs

İn ovo elektroporasyon ve Tol2 transpozon sistemini kullanarak yapay mikro-RNA dizilerinin civciv embriyolarına sokulmasını ve genomik entegrasyonunu içeren yeni bir fonksiyon kaybı yaklaşımı geliştirdik. Bu teknik, geliştirme sırasında gen fonksiyonu çalışmaları için sağlam ve kararlı bir gen yıkım metodolojisi sağlar.

Yapay mikroRNA'ların Tol2 Transpozon Aracılı Transgenik Ekspresyonu Kullanılarak Embriyonik Civciv Retinasında Fonksiyon Kaybı Yaklaşımı

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and ...

Bu metodoloji, civcivde retina gelişimi çalışmaları için bir fonksiyon kaybı yaklaşımı sağlar. Bu teknik, retinanın belirli bir bölgesindeki hedef genlerin hızlı ve kalıcı olarak baskılanmasını destekler. Bu yaklaşım, hem nöral hem de nöral olmayan dokular dahil olmak üzere civciv embriyosunun diğer kısımlarına da uygulanabilir.Ovo elektroporasyon için, 25 miligram Fast Green FCF (Hızlı Yeşil FCF) 10 mililitre PBS içinde çözerek %0,25'lik bir Fast Green solüsyonu hazırlayın, ardından solüsyonu 0,2 mikronluk bir şırınga filtresi kullanarak süzün. Ardından, mikroRNA zümrüt GFP plazmidini Tol2 transpozaz ekspresyon plazmidi ile ikiye bir oranında karıştırarak DNA kokteyli enjeksiyon çözeltisini hazırlayın. Daha sonra enjekte edilen alanın görselleştirilmesi için hazırlanan Fast Green solüsyonunu DNA kokteyline bire 10 oranında ekleyin.Ardından, mikroenjeksiyon aparatını kurun. Aparat, bir Hamilton şırıngası, 18 gauge iki inçlik bir iğne, iki santimetre uzunluğunda bir polivinil klorür borusu ve bir mikropipet iğnesinden oluşur. Hamilton şırıngasını ağır mineral yağ ile doldurun, ardından 18 gauge iğneyi şırıngaya takın ve şırınga pistonuna bastırarak iğnenin iç boşluğunu yağla doldurun.Ardından, polivinil klorür borusunu iğnenin ucuna takın ve boruyu yağla doldurun. Çekilen mikropipet iğnesini boruya takın. Daha sonra ince forseps kullanarak diseksiyon mikroskobu altında, küçük bir açıklık yapmak için iğnenin ucunu 10 ila 20 mikrometre çapında kırın.İğnenin tamamını yağ ile doldurun. Daha sonra, bir Petri kabına beş mikrolitre renkli DNA kokteyli koyun. Diseksiyon mikroskobu altında, mikropipet iğnesinin ucunu Petri kabındaki DNA çözeltisine yerleştirin ve çözeltiyi yavaşça iğneye çekin.İğnenin içindeki ve dışındaki basınç dengelendikten sonra, iğnenin ucunu DNA çözeltisinden çıkarın ve enjeksiyona kadar küçük bir beherde steril PBS'ye batırılmış halde tutun. Daha sonra elektroporasyon aparatını kurmak için, bir mikromanipülatör üzerinde bir elektrot tutucu ile bir çift platin elektrotu sıkıca ayarlayın. Elektrotların ucu arasındaki boşluğu iki milimetreye ayarlayın ve elektrotları kablolarla kare dalga darbe üretecine bağlayın.Daha sonra, DNA mikroenjeksiyonu için, döllenmiş bir White Leghorn yumurtasını inkübatörden çıkarın ve yumurtanın yüzeyini %70 etanole batırılmış kağıt mendille silin. Daha sonra 10 mililitrelik bir şırıngaya 18 gauge iğne takın ve yumurta sarısına zarar vermemek için iğneyi yumurtanın kör ucundan aşağı doğru açılı olarak geçirin. Yumurtadan iki ila üç mililitre albümin çektikten sonra, deliği bir parça bantla kapatın ve embriyo ve vitellin zarının kabuktan ayrıldığından emin olmak için yumurtayı ışıkla mumlayın.Daha sonra, forseps kullanarak, embriyoyu açığa çıkararak yumurtanın üstünden bir parça yumurta kabuğu çıkarın. Elektroporasyon sırasında embriyoların kurumasını önlemek için herhangi bir zamanda beşten fazla yumurtayı pencereye koymayın. İğnenin ucunu optik vezikülün içine proksimal tarafından 45 derecelik bir açıyla sokun ve mavi renkli çözelti lümeni doldurana kadar pistona yavaşça bastırarak DNA kokteylini enjekte edin.İğneyi geri çekin ve ucunu tekrar PBS'ye yerleştirin. Elektroporasyon için darbe voltajını 15 volta, darbe uzunluğunu 15 milisaniyeye, darbe aralığını 915 milisaniyeye ve darbe sayısını beşe ayarlayın. Embriyo üzerindeki vitellin membranına birkaç damla HBSS ekledikten sonra, elektrotları embriyonun ön-arka eksenine dik olarak HBSS'ye indirmek için mikromanipülatörü kullanın.Elektrotları optik vezikülün her iki tarafına yerleştirin, elektrotların embriyoya veya kan damarlarına temas etmemesini sağlayın, ardından darbeli elektrik alanları uygulayın. Elektroporasyon tamamlandıktan sonra elektrotları çıkarın ve albümin birikimini önlemek için elektrotları suya batırılmış steril bir pamuklu çubukla nazikçe temizleyin. Pencereyi bantla kapatın ve embriyoyu istenen gelişim aşamasına kadar yeniden inkübe edin.Bireysel pre-mikroRNA dizilerinin HEK293T hücrelerini eksprese eden Nel AP'ye transfeksiyonu, 482 ila 502, 910 ila 930 ve 2461 ila 2481 nükleotidlerine karşı yapılar tarafından Nel ekspresyonunun önemli ölçüde baskılanmasına neden oldu. İki mikroRNA dizisinin zincirlenmesi, yıkım verimliliğini önemli ölçüde artırdı. Her üç kombinasyon da, zincirlenmemiş bireysel mikroRNA öncesi dizilere kıyasla gelişmiş baskılama aktiviteleri gösterdi.Transfeksiyondan en az 13 gün sonra sağlam supresyon gözlendi. 482 ila 502 ve 2461 ila 2481 nükleotidlerini hedefleyen bir Nel pre-mikroRNA yapısı, transpozaz ekspresyon vektörü ile civciv retinasına birlikte transfekte edildiğinde, retinal pigment epitelindeki Nel ekspresyonu, embriyonik gün 4.5'te zümrüt GFP eksprese eden hücrelerde önemli ölçüde azaldı. Sekiz günlük embriyolarda, retinal ganglion hücrelerinde Nel ekspresyonu da azaldı.Buna karşılık, retinadaki Nel ekspresyonu, kontrol mikroRNA'sının girişinden etkilenmedi. Bu işlemi takiben, hücre proliferasyonu ve farklılaşması, hücre ölümü, hücre ve akson takibi gibi çeşitli yöntemler kullanılarak hedef gen baskılanması üzerindeki etkiler incelenebilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Omurilik Elektrofizyoloji II: Ekstrasellüler Emiş Elektrot İmalatı

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Aktivitesi miktarının Cis</emEksplant Elektroporasyon Fare Retina> Düzenleme Elemanları

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ventral Chick orta beyin içinde MikroRNA ovo İfade

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Civciv Embriyo aksonal Yörüngeler ve Synaptic Hedefler Trace için Beyin elektroporasyon

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Topikal Transgenik Rats nesil tarafından<em&gt; Utero</em&gt; Elektroporasyon ve<em&gt; In vivo</em&gt; Biyoparlaklık Eleme

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

Fare Retina kullanma CNS&#39;deki Vasküler Rejenerasyon Değerlendirilmesi

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

Electroporated Chick Embriyonik Omurilik Diferansiyel Gen İfade RNA Sıra Analizi

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning

Kemirgen Retina ve Uzaktan Ekstremite İskemik Önkoşullamanın Koruyucu Etkileri Fonksiyonu Değerlendirmek Üzere elektroretinogram kullanma

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Optogenetics gen nakavt etkileri olduğu gibi nöronal devreler içinde Presynaptic işlevi karakterize etmek için yapay mikroRNA'lar birleştirme

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...