Den automatiserade detektion och analys av exocytos programvara gör det möjligt för användaren att automatiskt upptäcka exocytic händelser och TIRF bildsekvenser av pH-känsliga fluorforer. Det kommer också automatiskt att mata ut funktioner av exocytos såsom rumslig fördelning eller frekvensen, liksom enskilda egenskaper hos exocytiska händelser, såsom halveringstid eller förändring i fluorescens över bakgrunden. Dessutom ingår ett alternativ att klassificera exocytiska händelser i fyra lägen av exocytos, som tidigare beskrivits i litteraturen.
För att använda programvaran automatisk identifiering och analys av exocytos klickar du först på knappen hitta datauppsättning och navigerar till var dina data deponeras och du vill lägga in en mapp som heter rådata. Dina datafiler fyller automatiskt i listan här, och du kan ha valfritt antal datafiler i den här mappen. Därefter vill du välja en katalog för vilken dina analysfiler ska deponeras.
Här har jag valt en katalog som heter test. Du vill också fylla i bildhastigheten för dina bilder och pixelstorleken. Här är mina bildhastigheter hundra millisekunder per bildruta, min pixelstorlek är åtta nanometer.
Slutligen behöver du maskfiler för att köra programvaran automated detection and analysis of Exocytosis. Du kan använda knappen medföljande masktillverkare för att automatiskt generera maskfiler från dina datafiler. Körindikatorn blir gul och sedan tillbaka till grönt när masktillverkaren är klar med körningen.
Masken kommer att deponeras i en ny mapp som heter maskfiler i den valda katalogen. Och notera, maskfiler kommer automatiskt att fylla listan här. Du vill kontrollera att dina maskfiler är korrekt gjorda för dina datafiler, och du kan göra detta genom att markera någon av datafilerna i listan, liksom motsvarande maskfil.
Den första bildrutan i datafilen visas också och den valda maskfilen visas. Här. Vi kan se att våra maskfiler är lämpliga för den analys som finns till hands. Maskfiler kan också tillhandahållas av användaren separat.
När man vill göra en maskfil från en aktuell datafil rekommenderar vi att man använder Image J.In för att göra det, öppna först bilden i bild J som du vill göra en maskfil från. Du kan sedan använda polygonmarkeringsverktyget för att börja skapa en maskfil genom att klicka runt cellens kant. När du är klar med masken dubbelklickar du för att ansluta till hela polygonen.
När detta är klart kommer du att gå till redigera, välja och skapa mask. En inverterad mask skapas. Du vill spara den här maskfilen med samma namn som datafilen följt av _mask_file.
Om du tillhandahåller dina egna anpassade maskfiler är det viktigt att låta den automatiska detekteringsprogramvaran veta var dessa maskfiler finns. För att göra det klickar du på knappen hitta maskfiler och navigerar till katalogen med maskfilerna i. De nya maskfilerna fyller sedan i listan här.
Det är viktigt att du har en mask för varje enskild datafil innan analysen kan köras. När du har läst in datauppsättningen, maskfilerna, bildhastigheten och pixelstorleken korrekt och en vald katalog kan du äntligen bestämma om du vill inkludera klassificering som en del av analysen. Om du växlar klassificeringsknappen, förutom att upptäcka exocytiska händelser, kommer varje exocytisk händelse att klassificeras i en av fyra klasser.
När du har bestämt hur din analys ska köras kan du sedan börja analysen genom att klicka på analysknappen. Körningsindikatorn blir gul för att indikera att analysen pågår och återgår till grönt när analysen är klar. När analysen är klar, vilket indikeras av att körningsindikatorn ändras från gult till grönt, kommer du att märka att en ny datafilmapp har dykt upp i din valda katalog.
I datafilsmappen hittar du analysfiler som motsvarar varje bilduppsättning i analyskörningen. Dessutom finns en cellstatistikfil som innehåller sammanfattande information, till exempel frekvensen av exocytos för var och en av bilduppsättningarna. För varje bilduppsättning har du en fluorescerande spårfil som innehåller information om X-position, Y-position och ramnummer för var de exocytiska händelser inträffar.
Dessutom presenteras den genomsnittliga fluorescensen i en region av intresse runt varje exocytic händelse både före, under och efter exocytos. Dessutom finns det också en spårningsfil, som innehåller liknande information om X-, Y- och temporalpositionerna. Men om klassificerings kryssrutan är markerad kommer det dessutom att finnas fyra extra kolumner, som anger sannolikheten för den exocytiska händelsen som tillhör en av fyra klasser.
Antingen full vesicle fusion ögonblicklig, full vesikel fusion försenad, kyss-och-kör ögonblicklig eller kyss-och-kör försenad. En exocytisk händelse tillhör en av de fyra klasserna om den är större än 0,5 och är den högsta sannolikheten inom de fyra styrda klasserna. I det här fallet tillhör den första exocytiska händelsen här hela vesikelfusions omedelbar klass, eftersom det är det högsta antalet över de fyra klasserna och det är större än 0,5.
Dessutom finns det ett antal andra funktionsfiler för varje bilduppsättning, som används under klassificeringen av exocytos och kan vara av intresse för vidare analys. Slutligen, om vi vill använda Ripleys K-analys för att upptäcka den rumsliga-temporala organisationen av exocytos, kommer vi först att börja med att dela upp vår maskfil i en neuritmaskfil och en somamaskfil. Vi gör detta genom att först öppna vår mask i bild J.Vi vill använda färgväljaren för att välja en bakgrundspixel.
Och på så sätt, när vi fyller i maskfilen, är det rätt värde. Därefter använder vi polygonvalsverktyget och beskriver den somatiska regionen. Nu kräver detta lite subjektivt, manuellt beslutsfattande.
Vi föreslår en grov ellipsoid. När du är klar med att du sedan ska gå till redigera, välja och skapa mask. Slutligen kommer du tillbaka till vår ursprungliga maskfil och använder redigera och fyll i för att fylla i soma, och nu har vi en separat neurit- och somamaskfil, som du sedan sparar.
När du har sparat din separata neurit- och somamaskfil, här, har jag den som maskfilsstrykning neur för neurit och understryker soma, vi kommer över till MATLAB och öppnar neurit 2D-nätverket MATLAB fil. Här navigerar vi den aktuella mappen till vår katalog där vi deponerade alla våra analysdata. När vi har gjort det kommer vi då att ha ändrat masknamnsvägen till vår nya maskfil som är neuriten.
Så i det här fallet har jag min neuritmaskfil under maskfilsmappen. Vi kommer sedan att ändra CSV-filnamnet till var vår fluorescerande spårfil finns. I det här fallet finns den fortfarande i datafilsmappen, så datafilerna snedstreckar och namnet på fluorescerande spårar CSV-filen.
När det är klart kan du sedan slå körning. Detta kommer sedan att skapa en skelettiserad version av neuritmaskfilen och deponera den som en CSV-fil under maskfilsmappen, som vi kan se här. Därefter genererar vi en CSV-fil för soma också.
Det gör du genom att öppna CSV-maskskaparfilen. Du vill lägga in sökvägen för din soma-mask och ett namn på CSV-filen som ska skapas. Här gick jag bara vidare och använde samma exakta filnamn, bara med prick CSV bifogad.
Hit run, och du kommer att se att en ny soma CSV-fil har skapats tillsammans med neuriten. När vi har skapat CSV-filerna för både neuritmasken och somamasken kan vi köra Ripleys K-analys. För att göra det navigerar vi över till R Studio och öppnar Ripleys K-analys R-fil.
Det finns två huvudvariabler här att uppmärksamma, neuronmask och neurondatapunkter. Neuronmasken pekar på vilka maskfiler du vill köra. I det här fallet kör jag soma maskfilerna.
Du vill köra alla dina soma maskfiler separat från alla dina neuritmaskfiler. Här har jag två nervceller, som jag kommer att använda för den här analysen. Du kan dock använda så många du vill för Ripleys K-analys, du vill bara kopiera och klistra in den här koden för neuronmask och ändra variabeln till tre och framåt.
Den andra variabeln är neurondatapunkter. Här vill du peka den på filen som genererades av dina funktioner alla extraherade R-filen. Nu fick min namnet fusionsstatistik, så det är vad den läser här inne.
Som nämnts har jag en andra soma mask fil och neuron, som analyseras tillsammans så att vi kan aggregera Ripleys K tillsammans. När du har ändrat dessa sökvägar till rätt sökväg använder du sedan kod, kör region och kör alla. När körningen är klar kommer flera tomter att genereras, inklusive de grupperade Ripleys K-värden, liksom densitetsdiagram.
Dessa kan sparas genom att gå till export, spara bild som och välja lämpligt bildformat, katalogen, filnamnet och slutligen slå spara. Här ser vi representativa resultat från 12 murin när nervceller uttrycker ventilation till fluor avbildas vid två dagar in vitro med TIRF mikroskopi. I A ser vi frekvensen av exocytos dividerat med klass.
Här kan vi se att full vesikelfusion omedelbart förekommer oftare än de andra klasserna. I B kan vi se lägesfördelningen, vilket bekräftar att full vesikelfusion omedelbart utgör mer än hälften av alla händelser. I C bestämmer vi den rumsliga fördelningen av exocytos som en värmekarta.
Vi kan se att majoriteten av exocytiska händelser är grupperade i en hotspot nära soma, liksom i neuriternas distala ändar. I D kan vi fastställa att exocytiska händelser är statistiskt signifikant grupperade och att storleken på dessa kluster varierar från en halv mikron till en mikron i storlek. Användningen av ett automatiserat analysprogram för att korrekt identifiera och analysera exocytiska händelser på ett opartiskt sätt ökar analyseffektiviteten och förbättrar reproducerbarhet och stringens.
För att säkerställa att detektionen är korrekt är det viktigt att upprätthålla en hög signal till brus under avbildningen. Att fånga exocytiska händelser eller andra pH-känsliga övergående händelser kräver en bildfrekvens som är tillräckligt snabb för att fånga alla händelser och förbättra uppskattningar som halveringstid eller toppförändring i fluorescens. Vi har visat att detta program inte bara fungerar för att noggrant fånga pH-känslig fluorescens i att utveckla nervceller, men även andra celltyper.
Men om du använder en annan celltyp är det viktigt att kontrollera om det finns skillnader i noggrannhet, på grund av de distinkta beteendena hos tillfälliga händelser i andra celltyper. Denna klassificering har endast använts för att utveckla nervceller hittills. Och vi vet faktiskt inte att dessa processer finns i andra celltyper eller vid senare utvecklingsmässiga tidpunkter i nervceller.
