Name: a modified surgical model of hind limb ischemia in apoe-/- mice using a miniature incision
Uploaded: 2021-05-13T12:30:00
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作者感谢Viktoria Skude，Alexander Schlund和Felix Hörner的出色技术支持。

注意：所有实验程序均根据EC指南EC 2010/63 / EU进行，并已获得德国当地立法（35-9185.81 / G[1]239 / 18）的批准。10只具有C57BL / 6J背景的雄性ApoE-/- 小鼠，重29.6-38.0g，在12小时的光/暗循环中饲养，并从8周龄开始随意喂食西方饮食（1.25%胆固醇和21%脂肪）和 随意 浇水12周。如下所述，在20周龄的小鼠上进行HLI。
1.在ApoE-/- 小鼠中诱导HLI
<ol><li>准备手术所需的设?...

本研究报告了一种经过修改，简化且手术有效的方法，可在ApoE-/-小鼠中建立HLI模型，通过3-4mm切口在FA的近端和远端区域进行双连接，而无需任何实验室升级。与先前报道的小鼠HLI模型8，9，10，11，12，15，20，22，23，24的研究相比...

对于外周动脉疾病（PAD）等血管疾病的研究，临床前动物模型的需求尚未得到满足。尽管在诊断和治疗方面取得了先进的发展，但在2018年有超过2亿名PAD患者1，并且他们的人数还在不断增加。虽然已经描述了几种新的治疗方法2，3，4，5，6，7，但将这些治疗方式成功转化为临床应用仍然是一项艰巨的任务。因此，需要可靠且相关的体内实验模型来模拟人类疾病状况，以研究这些治疗PAD6，7的新治疗方法的潜在机制和效率。
高脂血症和动脉粥样硬化（AS）是PAD发展的主要危险因素。ApoE-/-小鼠（高脂肪饮食）表现出异常的脂肪代谢和高脂血症，随后发展出动脉粥样硬化斑块，使ApoE-/-小鼠成为模拟临床相关PAD的最佳选择。临床前HLI动物模型是通过股动脉双结扎（DLFA）生成的，这是世界各地实验室中应用最广泛的方法8，9，10，11，12，13，14，15，以模拟急性慢性缺血。然而，这种方法通常需要一个相对较大和侵入性的切口。此外，它不可避免地导致动物（特别是小鼠）遭受疼痛损伤和炎症的增加，这也影响了随后的实验结果5，6，16，17。本文通过使用非常小的切口描述了APOE-/-小鼠的急性慢性HLI模型。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10x Phosphate buffer saline</td>
			<td >Roth</td>
			<td >9143.1</td>
			<td >Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30% H2O2</td>
			<td >Roth</td>
			<td >9681.2</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-0 absorbable sutures</td>
			<td>PROLENE</td>
			<td>8776H</td>
			<td>Used for stitching the skin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-0 absroable suture</td>
			<td >PROLENE</td>
			<td >EP8706</td>
			<td>Used in Surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-0 absorbable sutures</td>
			<td>PROLENE</td>
			<td >EH8021E</td>
			<td>Used for ligating the artery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-0 absroable suture</td>
			<td >PROLENE</td>
			<td >EP8755</td>
			<td>Used in Surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetic acid</td>
			<td >Roth</td>
			<td>6755.1</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Albumin Fraktion V</td>
			<td >Roth</td>
			<td >8076.2</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autoclave</td>
			<td >Systec GmbH</td>
			<td >Systec VX-150</td>
			<td>Used for the sterilisation of the surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Axio vert A1 microscope</td>
			<td >Carl Zeiss</td>
			<td >ZEISS Axio Vert.A1</td>
			<td>Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bruker BioSpec 94/20 AVIII</td>
			<td >Bruker Biospin MRI GmbH</td>
			<td >N/A</td>
			<td>Scan the femoral artery blockage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buprenovet Sine 0,3mg/ml</td>
			<td >Bayer AG</td>
			<td >2542 (WDT)</td>
			<td>Used in post operative pain-management. Dose - 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD31 antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >ab28364</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eosin Y solution 0.5 % in water</td>
			<td >Roth</td>
			<td >X883.1</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epitope Retrieval Solution pH 6</td>
			<td >Leica Biosystems</td>
			<td >6046945</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol &#8805; 99,5 %</td>
			<td >Roth</td>
			<td >5054.1</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fentanyl</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td >437-38-7</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine point forceps</td>
			<td >Medixplus</td>
			<td >93-4505S</td>
			<td>Used for separating the artery from nerve and vein</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass bead sterilisator</td>
			<td >Simon Keller</td>
			<td >Type 250</td>
			<td>Used for sterilisation of the surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Graefe iris forceps curved</td>
			<td >VUBU</td>
			<td >VUBU-02-72207</td>
			<td>Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hair Remover cream, Veet (with aloe vera)</td>
			<td >Reckitt Benckiser</td>
			<td >108972</td>
			<td>Remove hair from mice hind limbs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating plate</td>
			<td >ST&#214;RK-TRONIC</td>
			<td >7042092</td>
			<td>Keep the satble temperature of mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hematoxylin</td>
			<td >Roth</td>
			<td >T865.2</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica surgical microscope</td>
			<td >Leica</td>
			<td >M651</td>
			<td>Enlarge the field of view to facilitate the operation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Liquid DAB+Substrate Chromogen System</td>
			<td >Dako</td>
			<td >K3468</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Male ApoE-/- mice</td>
			<td >Charles River Laboratories</td>
			<td >N/A</td>
			<td>Used for establish the Peripheral artery disease mice model</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medetomidine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>128366-50-7</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro Needle Holder</td>
			<td >Black &#38; Black Surgical</td>
			<td >B3B-18-8</td>
			<td>Holding the needle</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro suture tying forceps</td>
			<td >Life Saver Surgical Industries</td>
			<td >PS-MSF-145</td>
			<td>Used to assist in knotting during surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microtome</td>
			<td >Biobase</td>
			<td >Bk-Mt268m</td>
			<td>Used for tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Midazolam</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>44856.01.00</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>N/a</td>
			<td>monitoring vital signs of animal during MRI scan</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Octeniderm farblos</td>
			<td >Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td >180212</td>
			<td>used for disinfection of the skin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ointment for the eyes and nose</td>
			<td >Bayer AG</td>
			<td >1578675</td>
			<td>Keep the eyes wet under the anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td >Roth</td>
			<td >0335.1</td>
			<td>Used for fixation of the tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pentobarbital</td>
			<td>Nembutal</td>
			<td >76-74-4</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Saline</td>
			<td>DeltaSelect</td>
			<td >1299.99.99</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spring handle scissors with fine, sharp tips</td>
			<td >Black &#38; Black Surgical</td>
			<td >B66167</td>
			<td>Used for cutting the artery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SuperCut Scissors</td>
			<td >Black &#38; Black Surgical</td>
			<td >B55992</td>
			<td>Used for cutting the skin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Roth</td>
			<td >9002-93-1</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Western diet, 1.25% Cholesterol</td>
			<td >ssniff Spezialdi&#228;ten GmbH</td>
			<td >E15723-34</td>
			<td>Diet for the mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylene</td>
			<td >Roth</td>
			<td >4436.3</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a modified surgical model of hind limb ischemia in apoe-/- mice using a miniature incision

本研究的目的是介绍和评估一种改进的手术方法，以诱导小鼠急性缺血，该方法可以在大多数动物实验室中实施。与传统的股动脉双结扎（DLFA）方法相反，在右侧腹股沟区域做了一个较小的切口，以暴露股骨近端动脉（FA）以执行DLFA。然后，使用7-0缝合线，将切口拖到膝盖区域以暴露远端FA.使用双侧后肢的磁共振成像（MRI）来检测手术后的FA闭塞。在手术后0，1，3，5和7天，使用Tarlov量表对后肢的功能恢复进行视觉评估和分级。在DLFA后7天对动物实施安乐死后进行组织学评估。在十只ApoE-/- 小鼠的右腿上成功进行了手术，在随后的观察中没有小鼠死亡。所有10只小鼠的切口大小小于5毫米（4.2±0.63毫米）。MRI结果显示缺血侧的FA血流明显受阻。Tarlov量表结果显示，术后后肢功能显著下降，并在接下来的7天内缓慢恢复。组织学评估显示缺血侧有明显的炎症反应，缺血性后肢微血管密度降低。总之，本研究引入了一种使用微型切口的改良技术，以使用DLFA进行后肢缺血（HLI）。

ApoE-/-小鼠的特征 DLFA手术成功在10只小鼠身上进行，以建立HLI模型，手术后没有一只小鼠死亡。为了跟踪体重的变化，在DLFA手术（Pre-DLFA）和DLFA手术后7天（DLFA后）对小鼠进行称重。DLFA之前的权重范围为29.6至38.0克（平均34.74±2.47克），DLFA后的重量范围为26.5至34.1克（平均30.77±2.15克），明显低于DLFA之前的重量（P <0.05， 图3A）...

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A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision

本文展示了一种有效的手术方法，用于通过小切口在小鼠中建立急性缺血。大多数研究小组都可以应用这种方法，而无需任何实验室升级。

ApoE小鼠后肢缺血的改进手术模型-/- 使用微型切口

The purpose of this study is to introduce and evaluate a modified surgical approach to induce acute ischemia in mice that can be implemented in most ...

我们今天介绍的是一种简化的改良和手术有效的方法，用于在ApoE小鼠中建立后肢缺血。这种方法可以在任何动物设施中实现。滑膜方法的主要优点是侵入性低，使用小于五毫米的切口。该方法具有学习功能。因此，我们建议在对动物进行研究之前，先在显微外科模型上进行练习，这些模型将包含在最终分析中。该方法将由医学博士和我实验室的学生Kaixuan Yan演示。首先准备手术所需的设备和工具。在对小鼠进行麻醉后，将软膏涂抹在眼睛上以防止干燥。然后将鼠标放在加热垫上，将核心体温保持在约37摄氏度。使用棉签和脱毛膏，小心地从右侧的后肢皮肤上去除毛发。将鼠标置于解剖显微镜下加热垫上的仰卧位。使用酒精对皮肤进行消毒，并用棉花擦拭，远离切口的植物侧。使用尖镊子和手术剪刀在腹股沟区域中间做一个大约三到四毫米的切口。在细尖镊子的帮助下，小心地去除皮下脂肪组织，以暴露股骨近端神经血管束。使用用盐水润湿的棉签，小心地将股动脉移离股神经和股静脉。然后使用7.0缝合线的尖端，小心地刺穿股鞘的膜。然后通过股骨近端动脉进入7-0可吸收缝合线，并使用弹簧剪刀进行双结。然后横切两根领带之间的股动脉。将6-0可吸收缝合线穿过切口的下边缘，轻轻地将切口拖到后肢膝盖右侧区域，以暴露股骨远端动脉。小心地将皮下组织移到一边，露出神经血管束。从股静脉和股神经中解剖股动脉，并用棉花保护神经。然后使用7.0缝合线的尖端，刺穿股骨鞘的膜。通过两条7-0可吸收的缝合线穿过股骨远端动脉，并使用弹簧剪刀在两根领带之间横切股动脉，形成双结。之后，使用6-0可吸收缝合线缝合切口。将鼠标放在干净的笼子中的加热垫上，并继续监测其重要参数，直到恢复。第二天通过 MRI 确定股动脉双结扎或 DLFA 的成功率。在DLFA手术之前，小鼠的重量范围为29.6至38.0克。DLFA手术后七天，体重范围从26.5克到34.1克，明显低于DLFA手术前的体重。右FA的近端和远端区域没有灌注。手术后一天，塔尔洛夫量表结果显着降低。虽然它们在接下来的几天里缓慢增加，但直到第七天，它们仍然低于基线。与对侧相比，七只小鼠缺血性后肢的爪子无法自然伸展。此外，与对侧相比，其中四只小鼠的爪子表现出轻微的变色。右GM肌肉的H&E染色显示肌纤维表现出不规则缺血性坏死，其中增殖的卫星细胞取代了坏死的肌纤维，并以团块或规则的分散分布。多核巨噬细胞表现出炎症浸润的肌纤维已经失去了正常的形态特征，只有很少的再生肌纤维存在。这些再生肌纤维的横截面是圆形的。细胞质被染成红色，中心有一个小核或多个细胞核。然而，在左GM中没有观察到这种炎症模式。进行CD31抗体染色观察微血管密度，表明缺血性后肢表现出明显高于非缺血侧的微血管密度。最重要的是解剖股动脉。操作人员需要具有显微外科技术方面的经验，并熟悉小鼠后肢解剖结构。原则上，这种方法也可用于研究腿部缺血再灌注损伤。因此，在允许再灌注之前，可以用软血管钳堵住动脉。

Research

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