Name: a modified surgical model of hind limb ischemia in apoe-/- mice using a miniature incision
Uploaded: 2021-05-13T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision at JoVE.com

Les auteurs remercient Viktoria Skude, Alexander Schlund et Felix Hörner pour l’excellent support technique.

NOTE: Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément à la directive CE 2010/63/UE et ont été approuvées par la législation allemande locale (35-9185.81/G[1]239/18). Dix souris mâles ApoE-/- avec le fond C57BL / 6J, pesant 29,6-38,0 g, ont été logées sur un cycle clair / sombre de 12 h et nourries avec un régime occidental (1,25% de cholestérol et 21% de matières grasses) et de l’eau ad libitum pendant 12 semaines à partir de l’âge de 8 semaines. HLI a ét?...

Cette étude rapporte une approche modifiée, simplifiée et chirurgicalement efficace pour établir un modèle HLI chez des souris ApoE- / - en utilisant une double ligature dans les régions proximale et distale de l’AF à travers une incision de 3-4 mm sans aucune mise à niveau de laboratoire requise. La principale caractéristique de cette méthode est la plus petite taille de l’incision par rapport aux études précédemment rapportées décrivant les modèles HLI de souris8<s...

Il existe un besoin non satisfait de modèles animaux précliniques pour la recherche sur les maladies vasculaires telles que la maladie artérielle périphérique (MAP). Malgré les développements avancés dans le diagnostic et le traitement, il y avait plus de 200 millions de patients atteints d’AOMI en2018 1, et leur nombre est en constante augmentation. Bien que plusieurs nouvelles approches thérapeutiques2,3,4,5,6,7 aient été décrites, la traduction réussie de ces modalités thérapeutiques en application clinique reste une tâche ardue. Par conséquent, des modèles expérimentaux in vivo fiables et pertinents simulant l’état de la maladie humaine sont nécessaires pour étudier le mécanisme potentiel et l’efficacité de ces nouvelles approches thérapeutiques pour traiter l’AOMI6,7.
L’hyperlipidémie et l’athérosclérose (SA) sont les principaux facteurs de risque de développement de l’AOMI. Les souris ApoE-/- (avec un régime riche en graisses) présentent un métabolisme anormal des graisses et une hyperlipidémie et développent par la suite des plaques d’athérosclérose, ce qui fait des souris ApoE-/- le meilleur choix pour simuler l’AOMI cliniquement pertinente. Les modèles animaux HLI précliniques sont générés par double ligature de l’artère fémorale (DLFA), qui est l’approche la plus largement utilisée dans les laboratoires du monde entier8,9,10,11,12,13,14,15 pour simuler l’ischémie aiguë sur chronique. Cependant, cette approche nécessite généralement une incision relativement grande et invasive. En outre, cela conduit inévitablement les animaux (en particulier les souris) à souffrir d’une douleur accrue et d’une inflammation, ce qui influence également les résultats expérimentaux ultérieurs5,6,16,17. Cet article décrit un modèle HLI aigu sur chronique chez des souris APOE-/- en utilisant une très petite incision.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10x Phosphate buffer saline</td>
			<td >Roth</td>
			<td >9143.1</td>
			<td >Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30% H2O2</td>
			<td >Roth</td>
			<td >9681.2</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-0 absorbable sutures</td>
			<td>PROLENE</td>
			<td>8776H</td>
			<td>Used for stitching the skin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-0 absroable suture</td>
			<td >PROLENE</td>
			<td >EP8706</td>
			<td>Used in Surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-0 absorbable sutures</td>
			<td>PROLENE</td>
			<td >EH8021E</td>
			<td>Used for ligating the artery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-0 absroable suture</td>
			<td >PROLENE</td>
			<td >EP8755</td>
			<td>Used in Surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetic acid</td>
			<td >Roth</td>
			<td>6755.1</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Albumin Fraktion V</td>
			<td >Roth</td>
			<td >8076.2</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autoclave</td>
			<td >Systec GmbH</td>
			<td >Systec VX-150</td>
			<td>Used for the sterilisation of the surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Axio vert A1 microscope</td>
			<td >Carl Zeiss</td>
			<td >ZEISS Axio Vert.A1</td>
			<td>Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bruker BioSpec 94/20 AVIII</td>
			<td >Bruker Biospin MRI GmbH</td>
			<td >N/A</td>
			<td>Scan the femoral artery blockage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buprenovet Sine 0,3mg/ml</td>
			<td >Bayer AG</td>
			<td >2542 (WDT)</td>
			<td>Used in post operative pain-management. Dose - 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD31 antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >ab28364</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eosin Y solution 0.5 % in water</td>
			<td >Roth</td>
			<td >X883.1</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epitope Retrieval Solution pH 6</td>
			<td >Leica Biosystems</td>
			<td >6046945</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol &#8805; 99,5 %</td>
			<td >Roth</td>
			<td >5054.1</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fentanyl</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td >437-38-7</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine point forceps</td>
			<td >Medixplus</td>
			<td >93-4505S</td>
			<td>Used for separating the artery from nerve and vein</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass bead sterilisator</td>
			<td >Simon Keller</td>
			<td >Type 250</td>
			<td>Used for sterilisation of the surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Graefe iris forceps curved</td>
			<td >VUBU</td>
			<td >VUBU-02-72207</td>
			<td>Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hair Remover cream, Veet (with aloe vera)</td>
			<td >Reckitt Benckiser</td>
			<td >108972</td>
			<td>Remove hair from mice hind limbs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating plate</td>
			<td >ST&#214;RK-TRONIC</td>
			<td >7042092</td>
			<td>Keep the satble temperature of mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hematoxylin</td>
			<td >Roth</td>
			<td >T865.2</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica surgical microscope</td>
			<td >Leica</td>
			<td >M651</td>
			<td>Enlarge the field of view to facilitate the operation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Liquid DAB+Substrate Chromogen System</td>
			<td >Dako</td>
			<td >K3468</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Male ApoE-/- mice</td>
			<td >Charles River Laboratories</td>
			<td >N/A</td>
			<td>Used for establish the Peripheral artery disease mice model</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medetomidine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>128366-50-7</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro Needle Holder</td>
			<td >Black &#38; Black Surgical</td>
			<td >B3B-18-8</td>
			<td>Holding the needle</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro suture tying forceps</td>
			<td >Life Saver Surgical Industries</td>
			<td >PS-MSF-145</td>
			<td>Used to assist in knotting during surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microtome</td>
			<td >Biobase</td>
			<td >Bk-Mt268m</td>
			<td>Used for tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Midazolam</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>44856.01.00</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>N/a</td>
			<td>monitoring vital signs of animal during MRI scan</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Octeniderm farblos</td>
			<td >Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td >180212</td>
			<td>used for disinfection of the skin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ointment for the eyes and nose</td>
			<td >Bayer AG</td>
			<td >1578675</td>
			<td>Keep the eyes wet under the anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td >Roth</td>
			<td >0335.1</td>
			<td>Used for fixation of the tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pentobarbital</td>
			<td>Nembutal</td>
			<td >76-74-4</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Saline</td>
			<td>DeltaSelect</td>
			<td >1299.99.99</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spring handle scissors with fine, sharp tips</td>
			<td >Black &#38; Black Surgical</td>
			<td >B66167</td>
			<td>Used for cutting the artery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SuperCut Scissors</td>
			<td >Black &#38; Black Surgical</td>
			<td >B55992</td>
			<td>Used for cutting the skin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Roth</td>
			<td >9002-93-1</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Western diet, 1.25% Cholesterol</td>
			<td >ssniff Spezialdi&#228;ten GmbH</td>
			<td >E15723-34</td>
			<td>Diet for the mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylene</td>
			<td >Roth</td>
			<td >4436.3</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a modified surgical model of hind limb ischemia in apoe-/- mice using a miniature incision

Le but de cette étude est d’introduire et d’évaluer une approche chirurgicale modifiée pour induire une ischémie aiguë chez la souris qui peut être mise en œuvre dans la plupart des laboratoires animaliers. Contrairement à l’approche conventionnelle pour la double ligature de l’artère fémorale (DLFA), une incision plus petite sur la région inguinale droite a été faite pour exposer l’artère fémorale proximale (AF) à effectuer DLFA. Ensuite, à l’aide d’une suture 7-0, l’incision a été traînée vers la région du genou pour exposer l’AF distale. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) sur les membres postérieurs bilatéraux a été utilisée pour détecter l’occlusion de l’AF après la chirurgie. À 0, 1, 3, 5 et 7 jours après la chirurgie, la récupération fonctionnelle des membres postérieurs a été évaluée visuellement et notée à l’aide de l’échelle de Tarlov. L’évaluation histologique a été réalisée après euthanasie des animaux 7 jours après le DLFA. Les procédures ont été effectuées avec succès sur la jambe droite chez dix souris ApoE- / - et aucune souris n’est morte lors d’une observation ultérieure. Les tailles d’incision chez les 10 souris étaient inférieures à 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). Les résultats de l’IRM ont montré que le flux sanguin d’AF du côté ischémique était clairement bloqué. Les résultats de l’échelle de Tarlov ont démontré que la fonction des membres postérieurs a considérablement diminué après la procédure et s’est lentement rétablie au cours des 7 jours suivants. L’évaluation histologique a montré une réponse inflammatoire significative du côté ischémique et une densité microvasculaire réduite dans le membre postérieur ischémique. En conclusion, cette étude introduit une technique modifiée utilisant une incision miniature pour effectuer une ischémie des membres postérieurs (HLI) en utilisant DLFA.

Caractéristiques des souris ApoE-/- Les chirurgies DLFA ont été effectuées avec succès sur 10 souris pour établir le modèle HLI, et aucune des souris n’est morte après la procédure. Pour suivre les changements de poids corporel, les souris ont été pesées avant la procédure DLFA (pré-DLFA) et 7 jours après la chirurgie DLFA (post-DLFA). Les poids pré-DLFA variaient de 29,6 à 38,0 g (moyenne de 34,74 ± 2,47 g), et les poids post-DLFA varia...

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A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision

Cet article démontre une approche chirurgicale efficace pour établir une ischémie aiguë chez la souris avec une petite incision. Cette approche peut être appliquée par la plupart des groupes de recherche sans aucune mise à niveau du laboratoire.

Un modèle chirurgical modifié de l’ischémie du membre postérieur chez des souris ApoE-/- utilisant une incision miniature

The purpose of this study is to introduce and evaluate a modified surgical approach to induce acute ischemia in mice that can be implemented in most ...

Ce que nous avons introduit aujourd’hui est une méthode simplifiée modifiée et chirurgicalement efficace, pour établir l’ischémie du membre postérieur chez les souris ApoE. Cette méthode peut être mise en œuvre dans n’importe quelle animalerie. Le principal avantage de la méthode synoviale est un faible caractère invasif, utilisant une incision de moins de cinq millimètres.La méthode a un hof d’apprentissage. Nous conseillons donc de pratiquer sur des modèles microchirurgicaux avant de travailler sur les animaux, qui vont être inclus dans l’analyse finale. La méthode sera démontrée par Kaixuan Yan, un docteur en médecine et l’étudiant de mon laboratoire.Commencez par préparer l’équipement et les outils nécessaires à la chirurgie. Après avoir administré l’anesthésie à la souris, appliquez cette pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse. Ensuite, placez la souris sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle centrale à environ 37 degrés Celsius.À l’aide d’un coton-tige et d’une crème dépilatoire, enlevez soigneusement les poils de la peau des membres postérieurs du côté droit. Posez la souris en position couchée sur le coussin chauffant sous un microscope à dissection. Utilisez de l’alcool pour désinfecter la peau et essuyez avec le coton loin du côté végétal de l’incision.En utilisant la pince pointue et les ciseaux chirurgicaux, faites une incision d’environ trois à quatre millimètres au milieu de la région inguinale. Retirez soigneusement le tissu adipeux sous-cutané à l’aide d’une pince fine pointue pour exposer le faisceau neurovasculaire fémoral proximal. À l’aide d’un coton-tige humidifié avec une solution saline, éloignez soigneusement l’artère fémorale du nerf fémoral et de la veine fémorale.Ensuite, à l’aide de la pointe d’une suture 7.0, percez soigneusement la membrane de la gaine fémorale. Ensuite, passez à 7-0 sutures résorbables à travers l’artère fémorale proximale et faites des nœuds doubles à l’aide des ciseaux à ressorts. Ensuite, transectez l’artère fémorale entre les deux liens.Passez la suture résorbable 6-0 à travers le bord inférieur de l’incision et faites glisser doucement l’incision vers la région du côté droit du genou du membre postérieur pour exposer l’artère fémorale distale. Déplacez soigneusement le tissu sous-cutané de côté pour exposer le faisceau neurovasculaire. Disséquez l’artère fémorale de la veine fémorale et du nerf fémoral et utilisez du coton pour protéger le nerf.Ensuite, à l’aide de la pointe d’une suture 7.0, percez la membrane de la gaine fémorale. Passez deux sutures résorbables 7-0 à travers l’artère fémorale distale et faites des nœuds doubles à l’aide des ciseaux à ressort pour transecter l’artère fémorale entre deux attaches. Ensuite, cousez l’incision à l’aide des sutures résorbables 6-0.Placez la souris sur un coussin chauffant dans une cage propre et continuez à surveiller ses paramètres vitaux jusqu’à la récupération. Déterminer le succès de la double ligature de l’artère fémorale ou DLFA le lendemain par IRM. Avant la procédure DLFA, le poids des souris variait de 29,6 à 38,0 grammes.Sept jours après la chirurgie DLFA, les poids variaient de 26,5 à 34,1 grammes, ce qui est nettement inférieur aux poids pré-DLFA. Les régions proximales et distales de l’AF droite n’ont montré aucune perfusion. Les résultats de l’échelle de Tarlov ont été significativement diminués un jour après la chirurgie.Bien qu’ils aient lentement augmenté au cours des jours suivants, ils étaient encore inférieurs à la ligne de base jusqu’au septième jour. Les pattes des membres postérieurs ischémiques chez sept souris étaient incapables de s’étirer naturellement par rapport au côté controlatéral. De plus, quatre des souris présentaient une légère décoloration des pattes par rapport au côté controlatéral.La coloration H & E du muscle GM droit a révélé des myofibres qui présentaient une nécrose ischémique irrégulière, où les cellules satellites proliférantes avaient remplacé les myofibres nécrotiques et étaient distribuées dans une masse ou avec une dispersion régulière. Les myofibers présentant une infiltration inflammatoire par des macrophages multinucléés avaient perdu leurs caractéristiques morphologiques normales, avec très peu de myofibres régénérés présents. Les sections transversales de ces myofibres régénérés étaient rondes.Le cytoplasme était coloré en rouge et un petit noyau ou plusieurs noyaux étaient situés au centre. Cependant, ce type de schéma inflammatoire n’a pas été observé dans le GM gauche. La coloration des anticorps CD31 effectuée pour observer la densité microvasculaire a indiqué que les membres postérieurs ischémiques présentaient une densité microvasculaire significativement plus élevée que le côté non ischémique. La chose la plus importante est la dissection de l’artère fémorale.L’opérateur doit avoir de l’expérience dans les techniques microchirurgicales et se familiariser avec l’anatomie des membres postérieurs de la souris. En principe, cette méthode pourrait également être utilisée pour étudier les lésions d’ischémie-reperfusion dans la jambe. Ainsi, l’artère peut être obstruée avec une pince à vaisseau mou avant de permettre la reperfusion.

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