Name: a modified surgical model of hind limb ischemia in apoe-/- mice using a miniature incision
Uploaded: 2021-05-13T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision at JoVE.com

Gli autori ringraziano Viktoria Skude, Alexander Schlund e Felix Hörner per l'eccellente supporto tecnico.

NOTA: Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite secondo la linea guida CE CE 2010/63/UE e sono state approvate dalla legislazione locale tedesca (35-9185.81/G[1]239/18). Dieci topi ApoEmaschi -/- con fondo C57BL / 6J, del peso di 29,6-38,0 g, sono stati alloggiati su un ciclo di luce / buio di 12 ore e alimentati con una dieta occidentale (1,25% di colesterolo e 21% di grassi) e acqua ad libitum per 12 settimane dall'età di 8 settimane. HLI è stato eseguito su topi di 20 settimane come des...

Questo studio riporta un approccio modificato, semplificato e chirurgicamente efficiente per stabilire un modello HLI nei topi ApoE-/- utilizzando la doppia legatura nelle regioni prossimale e distale della FA attraverso un'incisione di 3-4 mm senza alcun aggiornamento di laboratorio richiesto. La caratteristica principale di questo metodo è la dimensione minore dell'incisione rispetto agli studi precedentemente riportati che descrivono i modelli HLI murini8,<sup ...

C'è un bisogno insoddisfatto di modelli animali preclinici per la ricerca nelle malattie vascolari come la malattia delle arterie periferiche (PAD). Nonostante gli sviluppi avanzati nella diagnosi e nel trattamento, ci sono stati più di 200 milioni di pazienti con PAD nel 20181e il loro numero è in costante aumento. Sebbene siano stati descritti diversi nuovi approcci terapeutici2,3,4,5,6,7, la traduzione di successo di queste modalità terapeutiche in applicazione clinica rimane un compito scoraggiante. Pertanto, sono necessari modelli sperimentali in vivo affidabili e pertinenti che simulino la condizione della malattia umana per studiare il potenziale meccanismo e l'efficienza di questi nuovi approcci terapeutici per il trattamento della PAD6,7.
L'iperlipidemia e l'aterosclerosi (AS) sono i principali fattori di rischio per lo sviluppo della PAD. I topi ApoE-/- (con una dieta ricca di grassi) mostrano un metabolismo anormale dei grassi e iperlipidemia e successivamente sviluppano placche aterosclerotiche che rendono i topi ApoE-/- la scelta migliore per simulare la PAD clinicamente rilevante. I modelli animali HLI preclinici sono generati attraverso la doppia legatura dell'arteria femorale (DLFA), che è l'approccio più utilizzato nei laboratori di tutto il mondo8,9,10,11,12,13,14,15 per simulare l'ischemia acuta su cronica. Tuttavia, questo approccio di solito richiede un'incisione relativamente grande e invasiva. Inoltre, porta inevitabilmente agli animali (soprattutto topi) che soffrono di aumento delle lesioni da dolore e dell'infiammazione, che influenza anche i successivi risultati sperimentali5,6,16,17. Questo articolo descrive un modello HLI acuto su cronico nei topi APOE-/- utilizzando un'incisione molto piccola.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10x Phosphate buffer saline</td>
			<td >Roth</td>
			<td >9143.1</td>
			<td >Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30% H2O2</td>
			<td >Roth</td>
			<td >9681.2</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-0 absorbable sutures</td>
			<td>PROLENE</td>
			<td>8776H</td>
			<td>Used for stitching the skin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-0 absroable suture</td>
			<td >PROLENE</td>
			<td >EP8706</td>
			<td>Used in Surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-0 absorbable sutures</td>
			<td>PROLENE</td>
			<td >EH8021E</td>
			<td>Used for ligating the artery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-0 absroable suture</td>
			<td >PROLENE</td>
			<td >EP8755</td>
			<td>Used in Surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetic acid</td>
			<td >Roth</td>
			<td>6755.1</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Albumin Fraktion V</td>
			<td >Roth</td>
			<td >8076.2</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autoclave</td>
			<td >Systec GmbH</td>
			<td >Systec VX-150</td>
			<td>Used for the sterilisation of the surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Axio vert A1 microscope</td>
			<td >Carl Zeiss</td>
			<td >ZEISS Axio Vert.A1</td>
			<td>Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bruker BioSpec 94/20 AVIII</td>
			<td >Bruker Biospin MRI GmbH</td>
			<td >N/A</td>
			<td>Scan the femoral artery blockage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buprenovet Sine 0,3mg/ml</td>
			<td >Bayer AG</td>
			<td >2542 (WDT)</td>
			<td>Used in post operative pain-management. Dose - 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD31 antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >ab28364</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eosin Y solution 0.5 % in water</td>
			<td >Roth</td>
			<td >X883.1</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epitope Retrieval Solution pH 6</td>
			<td >Leica Biosystems</td>
			<td >6046945</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol &#8805; 99,5 %</td>
			<td >Roth</td>
			<td >5054.1</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fentanyl</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td >437-38-7</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine point forceps</td>
			<td >Medixplus</td>
			<td >93-4505S</td>
			<td>Used for separating the artery from nerve and vein</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass bead sterilisator</td>
			<td >Simon Keller</td>
			<td >Type 250</td>
			<td>Used for sterilisation of the surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Graefe iris forceps curved</td>
			<td >VUBU</td>
			<td >VUBU-02-72207</td>
			<td>Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hair Remover cream, Veet (with aloe vera)</td>
			<td >Reckitt Benckiser</td>
			<td >108972</td>
			<td>Remove hair from mice hind limbs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating plate</td>
			<td >ST&#214;RK-TRONIC</td>
			<td >7042092</td>
			<td>Keep the satble temperature of mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hematoxylin</td>
			<td >Roth</td>
			<td >T865.2</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica surgical microscope</td>
			<td >Leica</td>
			<td >M651</td>
			<td>Enlarge the field of view to facilitate the operation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Liquid DAB+Substrate Chromogen System</td>
			<td >Dako</td>
			<td >K3468</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Male ApoE-/- mice</td>
			<td >Charles River Laboratories</td>
			<td >N/A</td>
			<td>Used for establish the Peripheral artery disease mice model</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medetomidine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>128366-50-7</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro Needle Holder</td>
			<td >Black &#38; Black Surgical</td>
			<td >B3B-18-8</td>
			<td>Holding the needle</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro suture tying forceps</td>
			<td >Life Saver Surgical Industries</td>
			<td >PS-MSF-145</td>
			<td>Used to assist in knotting during surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microtome</td>
			<td >Biobase</td>
			<td >Bk-Mt268m</td>
			<td>Used for tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Midazolam</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>44856.01.00</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>N/a</td>
			<td>monitoring vital signs of animal during MRI scan</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Octeniderm farblos</td>
			<td >Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td >180212</td>
			<td>used for disinfection of the skin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ointment for the eyes and nose</td>
			<td >Bayer AG</td>
			<td >1578675</td>
			<td>Keep the eyes wet under the anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td >Roth</td>
			<td >0335.1</td>
			<td>Used for fixation of the tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pentobarbital</td>
			<td>Nembutal</td>
			<td >76-74-4</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Saline</td>
			<td>DeltaSelect</td>
			<td >1299.99.99</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spring handle scissors with fine, sharp tips</td>
			<td >Black &#38; Black Surgical</td>
			<td >B66167</td>
			<td>Used for cutting the artery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SuperCut Scissors</td>
			<td >Black &#38; Black Surgical</td>
			<td >B55992</td>
			<td>Used for cutting the skin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Roth</td>
			<td >9002-93-1</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Western diet, 1.25% Cholesterol</td>
			<td >ssniff Spezialdi&#228;ten GmbH</td>
			<td >E15723-34</td>
			<td>Diet for the mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylene</td>
			<td >Roth</td>
			<td >4436.3</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a modified surgical model of hind limb ischemia in apoe-/- mice using a miniature incision

Lo scopo di questo studio è quello di introdurre e valutare un approccio chirurgico modificato per indurre ischemia acuta nei topi che può essere implementato nella maggior parte dei laboratori animali. Contrariamente all'approccio convenzionale per la doppia legatura dell'arteria femorale (DLFA), è stata praticata un'incisione più piccola sulla regione inguinale destra per esporre l'arteria femorale prossimale (FA) per eseguire DLFA. Quindi, utilizzando una sutura 7-0, l'incisione è stata trascinata nella regione del ginocchio per esporre la FA distale. La risonanza magnetica (MRI) sugli arti posteriori bilaterali è stata utilizzata per rilevare l'occlusione FA dopo l'intervento chirurgico. A 0, 1, 3, 5 e 7 giorni dopo l'intervento chirurgico, il recupero funzionale degli arti posteriori è stato valutato visivamente e classificato utilizzando la scala di Tarlov. La valutazione istologica è stata eseguita dopo l'eutanasia degli animali 7 giorni dopo il DLFA. Le procedure sono state eseguite con successo sulla gamba destra in dieci topi ApoE-/- e nessun topo è morto durante la successiva osservazione. Le dimensioni dell'incisione in tutti e 10 i topi erano inferiori a 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). I risultati della risonanza magnetica hanno mostrato che il flusso sanguigno FA nel lato ischemico era chiaramente bloccato. I risultati della scala di Tarlov hanno dimostrato che la funzione dell'arto posteriore è diminuita significativamente dopo la procedura e lentamente recuperata nei successivi 7 giorni. La valutazione istologica ha mostrato una significativa risposta infiammatoria sul lato ischemico e una ridotta densità microvascolare nell'arto posteriore ischemico. In conclusione, questo studio introduce una tecnica modificata che utilizza un'incisione in miniatura per eseguire l'ischemia degli arti posteriori (HLI) utilizzando DLFA.

Caratteristiche dei mouse ApoE-/- Gli interventi chirurgici DLFA sono stati eseguiti con successo su 10 topi per stabilire il modello HLI e nessuno dei topi è morto dopo la procedura. Per seguire i cambiamenti nel peso corporeo, i topi sono stati pesati prima della procedura DLFA (Pre-DLFA) e 7 giorni dopo l'intervento chirurgico DLFA (Post-DLFA). I pesi pre-DLFA variavano da 29,6 a 38,0 g (media 34,74 ± 2,47 g) e i pesi post-DLFA variavano da 26,5 a 34...

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A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision

Questo articolo dimostra un approccio chirurgico efficiente per stabilire l'ischemia acuta nei topi con una piccola incisione. Questo approccio può essere applicato dalla maggior parte dei gruppi di ricerca senza aggiornamenti di laboratorio.

Un modello chirurgico modificato di ischemia dell'arto posteriore in ApoE-/- Topi utilizzando un'incisione in miniatura

The purpose of this study is to introduce and evaluate a modified surgical approach to induce acute ischemia in mice that can be implemented in most ...

Quello che abbiamo introdotto oggi è un metodo semplificato modificato e chirurgicamente efficiente, per stabilire l'ischemia dell'arto posteriore nei topi ApoE. Questo metodo può essere implementato in qualsiasi struttura per animali. Il principale vantaggio del metodo sinoviale è una bassa invasività, utilizzando un'incisione inferiore a cinque millimetri.Il metodo ha un hof di apprendimento. Consigliamo quindi di esercitarsi sui modelli microchirurgici prima di lavorare sugli animali, che saranno inclusi nell'analisi finale. Il metodo sarà dimostrato da Kaixuan Yan, un dottore in medicina e lo studente del mio laboratorio.Inizia preparando le attrezzature e gli strumenti necessari per l'intervento chirurgico. Dopo aver somministrato l'anestesia al topo, applicare quell'unguento sugli occhi per prevenire la secchezza. Quindi posizionare il mouse su una piastra riscaldante per mantenere la temperatura corporea interna a circa 37 gradi Celsius.Utilizzando un batuffolo di cotone e una crema per la depilazione, rimuovere con cura i peli dalla pelle degli arti posteriori sul lato destro. Posare il mouse in posizione supina sulla piastra riscaldante sotto un microscopio di dissezione. Utilizzare l'alcol per disinfettare la pelle e pulire con il cotone lontano dal lato vegetale dell'incisione.Usando la pinza appuntita e le forbici chirurgiche fare un'incisione di circa tre o quattro millimetri nel mezzo della regione inguinale. Rimuovere con attenzione il tessuto adiposo sottocutaneo con l'aiuto di pinze appuntite per esporre il fascio neurovascolare femorale prossimale. Utilizzando un batuffolo di cotone inumidito con soluzione salina, spostare con attenzione l'arteria femorale lontano dal nervo femorale e dalla vena femorale.Quindi utilizzando la punta di una sutura 7.0, perforare attentamente la membrana della guaina femorale. Quindi passare a suture assorbibili 7-0 attraverso l'arteria femorale prossimale e fare doppi nodi usando le forbici a molla. Successivamente transettare l'arteria femorale tra i due legami.Passare la sutura assorbibile 6-0 attraverso il bordo inferiore dell'incisione e trascinare delicatamente l'incisione nella regione del lato destro del ginocchio dell'arto posteriore per esporre l'arteria femorale distale. Spostare con attenzione il tessuto sottocutaneo da parte per esporre il fascio neurovascolare. Sezionare l'arteria femorale dalla vena femorale e dal nervo femorale e utilizzare il cotone per proteggere il nervo.Quindi, utilizzando la punta di una sutura 7.0, perforare la membrana della guaina femorale. Passare due suture assorbibili 7-0 attraverso l'arteria femorale distale e fare doppi nodi usando le forbici a molla per transettare l'arteria femorale tra due legami. Successivamente, cucire l'incisione usando le suture riassorbibili 6-0.Posizionare il mouse su una piastra riscaldante in una gabbia pulita e continuare a monitorare i suoi parametri vitali fino al recupero. Determinare il successo della doppia legatura dell'arteria femorale o DLFA il giorno successivo tramite risonanza magnetica. Prima della procedura DLFA, i pesi dei topi variavano da 29,6 a 38,0 grammi.Sette giorni dopo l'intervento chirurgico DLFA, i pesi variavano da 26,5 a 34,1 grammi, significativamente inferiori ai pesi pre-DLFA. Le regioni prossimale e distale della FA destra non hanno mostrato alcuna perfusione. I risultati della scala di Tarlov sono stati significativamente ridotti un giorno dopo l'intervento chirurgico.Sebbene siano aumentati lentamente nei giorni successivi, erano ancora inferiori al basale fino al settimo giorno. Le zampe degli arti posteriori ischemici in sette topi non erano in grado di allungarsi naturalmente rispetto al lato controlaterale. Inoltre, quattro dei topi hanno mostrato un leggero scolorimento delle zampe rispetto al lato controlaterale.La colorazione H&E del muscolo GM destro ha rivelato miofibre che mostravano necrosi ischemica irregolare, in cui le cellule satelliti proliferanti avevano sostituito le miofibre necrotiche e sono state distribuite in massa o con una dispersione regolare. Le miofibre che mostravano infiltrazioni infiammatorie da parte di macrofagi multinucleati avevano perso le loro normali caratteristiche morfologiche, con pochissime miofibre rigenerate presenti. Le sezioni trasversali di queste miofibre rigenerate erano rotonde.Il citoplasma era macchiato di rosso e un piccolo nucleo o più nuclei si trovavano al centro. Tuttavia, questo tipo di modello infiammatorio non è stato osservato nel GM sinistro. La colorazione degli anticorpi CD31 eseguita per osservare la densità microvascolare, ha indicato che gli arti posteriori ischemici hanno mostrato una densità microvascolare significativamente maggiore rispetto al lato non ischemico. La cosa più importante è la dissezione dell'arteria femorale.L'operatore deve avere esperienza nelle tecniche microchirurgiche e avere familiarità con l'anatomia degli arti posteriori del topo. In linea di principio, questo metodo potrebbe anche essere utilizzato per studiare la lesione da ischemia-riperfusione nella gamba. In questo modo, l'arteria può essere occlusa con un morsetto morbido prima di consentire la riperfusione.

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