Name: a modified surgical model of hind limb ischemia in apoe-/- mice using a miniature incision
Uploaded: 2021-05-13T12:30:00
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著者はヴィクトリア・スクデ、アレクサンダー・シュルンド、フェリックス・ヘルナーに優れた技術サポートをしてくれたことに感謝しています。

注:すべての実験手順はECガイドラインEC 2010/63/EUに従って行われ、現地のドイツの法律(35-9185.81/G[1]239/18)によって承認されています。体重29.6-38.0gのC57BL/6Jバックグラウンドを持つ10匹の雄のApoE-/- マウスを12時間の明暗サイクルに収容し、8週間から12週間、西洋の食事(1.25%コレステロールと21%脂肪)と水 アドリビタム を与えた。HLIは、以下に説明する20週齢マウスに対して行った。...

この研究は、必要な実験室のアップグレードなしに3〜4mmの切開を介してFAの近位および遠位領域で二重結紮を使用してApoE-/-マウスにHLIモデルを確立するための修正され、簡素化され、外科的に効率的なアプローチを報告する。この方法の主な特徴は、マウスHLIモデル8、9、10、11、12、15、20、22、23、24...

末梢動脈疾患(PAD)などの血管疾患の研究のための前臨床動物モデルのための満たされていないニーズがあります。診断と治療の発展にもかかわらず、2018年1年にはPAD患者数が2億人以上で、その数は絶えず増加しています。いくつかの新しい治療アプローチ2、3、4、5、6、7が記載されているが、臨床応用へのこれらの治療様式の翻訳の成功は困難な作業のままである。従って、ヒト疾患状態をシミュレートする生体内の実験モデルにおいて信頼性が高く、関連するが、PAD6,7を治療するためのこれらの新しい治療アプローチの潜在的なメカニズムおよび効率を調べる必要がある。
高脂血症およびアテローム性動脈硬化症(AS)は、PADの開発のための主な危険因子である。ApoE-/-マウス(高脂肪食)は異常な脂肪代謝と高脂血症を示し、その後、臨床的に関連するPADをシミュレートするための最良の選択としてApoE-/-マウスをレンダリングするアテローム硬化性プラークを開発する。前臨床HLI動物モデルは、世界中の実験室で最も広く使用されている大腿動脈(DLFA)の二重結紮によって生成される8、9、10、11、12、13、14、15急性慢性虚血をシミュレートする。しかし、このアプローチは通常、比較的大きく侵襲的な切開を必要とする。さらに、必然的に、痛み傷害や炎症の増加に苦しむ動物(特にマウス)につながり、その後の実験結果5、6、16、17にも影響を与える。この論文では、APOE-/- マウスにおける急性慢性HLIモデルについて、非常に小さな切開を用いて説明する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10x Phosphate buffer saline</td>
			<td >Roth</td>
			<td >9143.1</td>
			<td >Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30% H2O2</td>
			<td >Roth</td>
			<td >9681.2</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-0 absorbable sutures</td>
			<td>PROLENE</td>
			<td>8776H</td>
			<td>Used for stitching the skin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-0 absroable suture</td>
			<td >PROLENE</td>
			<td >EP8706</td>
			<td>Used in Surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-0 absorbable sutures</td>
			<td>PROLENE</td>
			<td >EH8021E</td>
			<td>Used for ligating the artery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-0 absroable suture</td>
			<td >PROLENE</td>
			<td >EP8755</td>
			<td>Used in Surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetic acid</td>
			<td >Roth</td>
			<td>6755.1</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Albumin Fraktion V</td>
			<td >Roth</td>
			<td >8076.2</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autoclave</td>
			<td >Systec GmbH</td>
			<td >Systec VX-150</td>
			<td>Used for the sterilisation of the surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Axio vert A1 microscope</td>
			<td >Carl Zeiss</td>
			<td >ZEISS Axio Vert.A1</td>
			<td>Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bruker BioSpec 94/20 AVIII</td>
			<td >Bruker Biospin MRI GmbH</td>
			<td >N/A</td>
			<td>Scan the femoral artery blockage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buprenovet Sine 0,3mg/ml</td>
			<td >Bayer AG</td>
			<td >2542 (WDT)</td>
			<td>Used in post operative pain-management. Dose - 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD31 antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >ab28364</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eosin Y solution 0.5 % in water</td>
			<td >Roth</td>
			<td >X883.1</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epitope Retrieval Solution pH 6</td>
			<td >Leica Biosystems</td>
			<td >6046945</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol &#8805; 99,5 %</td>
			<td >Roth</td>
			<td >5054.1</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fentanyl</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td >437-38-7</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine point forceps</td>
			<td >Medixplus</td>
			<td >93-4505S</td>
			<td>Used for separating the artery from nerve and vein</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass bead sterilisator</td>
			<td >Simon Keller</td>
			<td >Type 250</td>
			<td>Used for sterilisation of the surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Graefe iris forceps curved</td>
			<td >VUBU</td>
			<td >VUBU-02-72207</td>
			<td>Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hair Remover cream, Veet (with aloe vera)</td>
			<td >Reckitt Benckiser</td>
			<td >108972</td>
			<td>Remove hair from mice hind limbs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating plate</td>
			<td >ST&#214;RK-TRONIC</td>
			<td >7042092</td>
			<td>Keep the satble temperature of mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hematoxylin</td>
			<td >Roth</td>
			<td >T865.2</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica surgical microscope</td>
			<td >Leica</td>
			<td >M651</td>
			<td>Enlarge the field of view to facilitate the operation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Liquid DAB+Substrate Chromogen System</td>
			<td >Dako</td>
			<td >K3468</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Male ApoE-/- mice</td>
			<td >Charles River Laboratories</td>
			<td >N/A</td>
			<td>Used for establish the Peripheral artery disease mice model</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medetomidine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>128366-50-7</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro Needle Holder</td>
			<td >Black &#38; Black Surgical</td>
			<td >B3B-18-8</td>
			<td>Holding the needle</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro suture tying forceps</td>
			<td >Life Saver Surgical Industries</td>
			<td >PS-MSF-145</td>
			<td>Used to assist in knotting during surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microtome</td>
			<td >Biobase</td>
			<td >Bk-Mt268m</td>
			<td>Used for tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Midazolam</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>44856.01.00</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>N/a</td>
			<td>monitoring vital signs of animal during MRI scan</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Octeniderm farblos</td>
			<td >Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td >180212</td>
			<td>used for disinfection of the skin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ointment for the eyes and nose</td>
			<td >Bayer AG</td>
			<td >1578675</td>
			<td>Keep the eyes wet under the anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td >Roth</td>
			<td >0335.1</td>
			<td>Used for fixation of the tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pentobarbital</td>
			<td>Nembutal</td>
			<td >76-74-4</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Saline</td>
			<td>DeltaSelect</td>
			<td >1299.99.99</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spring handle scissors with fine, sharp tips</td>
			<td >Black &#38; Black Surgical</td>
			<td >B66167</td>
			<td>Used for cutting the artery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SuperCut Scissors</td>
			<td >Black &#38; Black Surgical</td>
			<td >B55992</td>
			<td>Used for cutting the skin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Roth</td>
			<td >9002-93-1</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Western diet, 1.25% Cholesterol</td>
			<td >ssniff Spezialdi&#228;ten GmbH</td>
			<td >E15723-34</td>
			<td>Diet for the mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylene</td>
			<td >Roth</td>
			<td >4436.3</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a modified surgical model of hind limb ischemia in apoe-/- mice using a miniature incision

本研究の目的は、ほとんどの動物実験で実施できるマウスに急性虚血を誘導する改変外科的アプローチを導入し、評価することにある。大腿動脈(DLFA)の二重結紮に対する従来のアプローチとは対照的に、右のインギナル領域に小さな切開部が、DLFAを行うために近位大腿動脈(FA)を露出するようになされた。次いで、7-0縫合を用いて、切開を膝領域に引きずり込んで遠位FAを露出させ、手術後にFA閉塞を検出するために両側後肢に磁気共鳴画像(MRI)を使用した。手術後0、1、3、5、および7日目に、後肢の機能的回復を目視で評価し、Tarlovスケールを用いて採点した。組織学的評価は、DLFAの7日後に動物を安楽死させた後に行った。この処置は10匹のApoE-/- マウスで右足で正常に行われ、その後の観察中に死亡したマウスはなかった。全10匹のマウスの切開サイズは5mm(4.2±0.63mm)未満であった。MRIの結果は虚血側のFA血流が明確に遮断されたことを示した。Tarlovスケールの結果は、後肢の機能が処置後に有意に低下し、次の7日間にわたってゆっくりと回復することを示した。組織学的評価は虚血性側に顕著な炎症反応を示し、虚血後肢の微小血管密度を低下させた。結論として、この研究は、DLFAを使用して後肢虚血(HLI)を行うためにミニチュア切開を使用して変更された技術を導入する。

アポエの特徴-/- マウス DLFA手術はHLIモデルを確立するために10匹のマウスで正常に行われ、処置後に死亡したマウスはいずれも死亡しなかった。体重の変化に従うために、マウスはDLFA処置(プレDLFA)の前およびDLFA手術の7日後(ポストDLFA)の後に体重を量った。プレDLFAウェイトは29.6~38.0g(平均34.74±2.47g)、DLFA後重みは26.5~34.1g(平均30.77±2.15g)の範囲で?...

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A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision

この記事は、小さな切開を有するマウスにおける急性虚血を確立するための効率的な外科的アプローチを示す。このアプローチは、ほとんどの研究グループが、実験室でのアップグレードなしで適用できます。

ApoEにおける後肢虚血の改変外科モデル-/- ミニチュア切開を用いたマウス

The purpose of this study is to introduce and evaluate a modified surgical approach to induce acute ischemia in mice that can be implemented in most ...

我々が今日導入したものは、ApoEマウスで後肢虚血を確立するための簡略化された改変および外科的に効率的な方法である。この方法は、任意の動物施設で実装することができます。滑液法の主な利点は、低侵襲性、5ミリメートル未満の切開を使用することです。この方法には学習のホフがあります。したがって、最終的な分析に含まれる動物に取り組む前に、微小外科モデルに関する練習をすることをお勧めします。この方法は、医学博士で私の研究室の学生であるKaixuan Yanによって実証されます。まず、手術に必要な器具と道具を準備します。マウスに麻酔を投与した後、その軟膏を目に当て、乾燥を防ぐ。その後、熱パッドの上にマウスを置き、コア体温を約37°Cに保ちます。綿棒と脱毛クリームを使用して、右側の後肢の皮膚から慎重に髪を取り除きます。マウスを、解剖顕微鏡の下の加熱パッドの仰向けの位置に置きます。アルコールを使用して皮膚を消毒し、切開の植物側から離れた綿で拭きます。尖った鉗子および外科用はさみを使用して、インギナル領域の真ん中に約3〜4ミリメートルの切開を行う。慎重に近位大腿神経血管束を露出する細かい尖った鉗子の助けを借りて皮下脂肪組織を除去する。生理食動物で湿らせた綿棒を使用して、大腿動脈を大腿神経と大腿静脈から慎重に移動させる。その後、7.0縫合の先端を使用して、大腿鞘の膜を慎重に貫通する。その後、近位大腿動脈を通して7-0吸収性縫合糸に渡し、スプリングハサミを使用して二重結び目を作ります。その後、2つの結びの間の大腿動脈を横断する。6-0吸収性縫合糸を切開の下端に通し、後肢の膝の右側の領域に切開を静かにドラッグして遠位大腿動脈を露出させる。慎重に神経血管束を露出させるために皮下組織を脇に移動します.大腿静脈と大腿神経から大腿動脈を解剖し、綿を使って神経を保護する。その後、7.0縫合の先端を使用して、大腿鞘の膜を突き刺す。遠位大腿動脈を通して2つの7-0吸収可能な縫合糸を渡し、2つのネクタイ間の大腿動脈をトランセクトするためにスプリングハサミを使用して二重結び目を作ります。その後、6-0吸収性縫合糸を使用して切開をステッチします。きれいなケージの暖房パッドの上にマウスを置き、回復するまでその重要なパラメータを監視し続けます。翌日MRIを介して大腿動脈またはDLFAの二重結紮の成功を決定する。DLFA処置の前に、マウスの重みは29.6から38.0グラムの範囲であった。DLFA手術の7日後、体重は26.5グラムから34.1グラムの範囲で、DLFA前の体重よりも有意に低かった。右FAの近位および遠位領域は灌流を示さなかった。タールロフスケールの結果は、手術の翌日に有意に減少した。彼らは次の日にゆっくりと増加しましたが、7日目までベースラインよりも低かった。7匹のマウスの虚血性後肢の足は、対側側と比較して自然に伸びることができなかった。また、4匹のマウスは、対側側に比べて足のわずかな変色を示した。右GM筋肉のH&E染色は、増殖する衛星細胞が壊死性筋線維を置き換え、塊または定期的な分散液で分布していた不規則な虚血性壊死を示す筋線維を明らかにした。多核化マクロファージによる炎症性浸潤を示す筋繊維は、通常の形態学的特徴を失い、再生筋繊維はほとんど存在していなかった。これらの再生された筋繊維の横断部は丸かった。細胞質を赤色に染色し、1つの小さな核または複数の核が中心に位置していた。しかし、この種の炎症パターンは左GMでは観察されなかった。CD31抗体染色は、微小血管密度を観察するために行われ、虚血後肢が非虚血側よりも有意に多くの微小血管密度を示したことを示した。最も重要なことは、大腿動脈の解剖です。オペレータは、微小外科的技術の経験を有するとともに、マウス後肢の解剖学に精通している必要がある。原則として、この方法は、脚の虚血再灌流傷害を研究するためにも使用することができる。これにより、動脈は再灌流を可能にする前に軟部容器クランプで閉塞することができる。

Research

JoVE Journal

Biology

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