Name: a modified surgical model of hind limb ischemia in apoe-/- mice using a miniature incision
Uploaded: 2021-05-13T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision at JoVE.com

Forfattere takker Viktoria Skude, Alexander Schlund og Felix Hörner for utmerket teknisk støtte.

MERK: Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i henhold til EF-retningslinjen EF 2010/63/EU og er godkjent av den lokale tyske lovgivningen (35-9185.81/G[1]239/18). Ti mannlige ApoE-/- mus med C57BL /6J bakgrunn, veier 29,6-38,0 g, ble plassert på en 12 timers lys / mørk syklus og matet et vestlig kosthold (1,25% kolesterol og 21% fett) og vann ad libitum i 12 uker fra en alder av 8 uker. HLI ble utført på 20 uker gamle mus som beskrevet nedenfor.
1. Induksjon av HLI ...

Denne studien rapporterer en modifisert, forenklet og kirurgisk effektiv tilnærming for å etablere en HLI-modell i ApoE-/- mus ved hjelp av dobbel ligation i de proksimale og distale områdene i FA gjennom et 3-4 mm snitt uten nødvendige laboratorieoppgraderinger. Hovedkarakteristikken for denne metoden er den mindre størrelsen på snittet sammenlignet med tidligere rapporterte studier som beskriver mus HLI-modeller8,9,...

Det er et udekket behov for prekliniske dyremodeller for forskning på vaskulære sykdommer som perifer arteriesykdom (PAD). Til tross for den avanserte utviklingen i diagnose og behandling, var det mer enn 200 millioner pasienter med PAD i 20181, og antallet øker stadig. Selv om flere nye terapeutiske tilnærminger2,3,4,5,6,7 har blitt beskrevet, er vellykket oversettelse av disse terapeutiske modalitetene til klinisk anvendelse fortsatt en skremmende oppgave. Derfor er pålitelige og relevante in vivo eksperimentelle modeller som simulerer den menneskelige sykdomstilstanden nødvendig for å undersøke den potensielle mekanismen og effektiviteten til disse nye terapeutiske tilnærmingene for å behandle PAD6,7.
Hyperlipidemi og aterosklerose (AS) er de viktigste risikofaktorene for utvikling av PAD. ApoE-/- mus (på et fettrikt kosthold) viser unormal fettmetabolisme og hyperlipidemi og utvikler deretter aterosklerotiske plakk som gjør ApoE-/- mus som det beste valget for å simulere den klinisk relevante PAD. Prekliniske HLI dyremodeller genereres gjennom dobbel ligasjon av lårarterien (DLFA), som er den mest brukte tilnærmingen i laboratorier over hele verden8,9,10,11,12,13,14,15 for å simulere akutt-på-kronisk iskemi. Imidlertid krever denne tilnærmingen vanligvis et relativt stort og invasivt snitt. Videre fører det uunngåelig til at dyrene (spesielt musene) lider av økt smerteskade og betennelse, noe som også påvirker de påfølgende eksperimentelle resultatene5,6,16,17. Dette dokumentet beskriver en akutt-på-kronisk HLI-modell i APOE-/- mus ved hjelp av et svært lite snitt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10x Phosphate buffer saline</td>
			<td >Roth</td>
			<td >9143.1</td>
			<td >Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30% H2O2</td>
			<td >Roth</td>
			<td >9681.2</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-0 absorbable sutures</td>
			<td>PROLENE</td>
			<td>8776H</td>
			<td>Used for stitching the skin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-0 absroable suture</td>
			<td >PROLENE</td>
			<td >EP8706</td>
			<td>Used in Surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-0 absorbable sutures</td>
			<td>PROLENE</td>
			<td >EH8021E</td>
			<td>Used for ligating the artery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-0 absroable suture</td>
			<td >PROLENE</td>
			<td >EP8755</td>
			<td>Used in Surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetic acid</td>
			<td >Roth</td>
			<td>6755.1</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Albumin Fraktion V</td>
			<td >Roth</td>
			<td >8076.2</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autoclave</td>
			<td >Systec GmbH</td>
			<td >Systec VX-150</td>
			<td>Used for the sterilisation of the surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Axio vert A1 microscope</td>
			<td >Carl Zeiss</td>
			<td >ZEISS Axio Vert.A1</td>
			<td>Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bruker BioSpec 94/20 AVIII</td>
			<td >Bruker Biospin MRI GmbH</td>
			<td >N/A</td>
			<td>Scan the femoral artery blockage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buprenovet Sine 0,3mg/ml</td>
			<td >Bayer AG</td>
			<td >2542 (WDT)</td>
			<td>Used in post operative pain-management. Dose - 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD31 antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >ab28364</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eosin Y solution 0.5 % in water</td>
			<td >Roth</td>
			<td >X883.1</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epitope Retrieval Solution pH 6</td>
			<td >Leica Biosystems</td>
			<td >6046945</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol &#8805; 99,5 %</td>
			<td >Roth</td>
			<td >5054.1</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fentanyl</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td >437-38-7</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine point forceps</td>
			<td >Medixplus</td>
			<td >93-4505S</td>
			<td>Used for separating the artery from nerve and vein</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass bead sterilisator</td>
			<td >Simon Keller</td>
			<td >Type 250</td>
			<td>Used for sterilisation of the surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Graefe iris forceps curved</td>
			<td >VUBU</td>
			<td >VUBU-02-72207</td>
			<td>Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hair Remover cream, Veet (with aloe vera)</td>
			<td >Reckitt Benckiser</td>
			<td >108972</td>
			<td>Remove hair from mice hind limbs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating plate</td>
			<td >ST&#214;RK-TRONIC</td>
			<td >7042092</td>
			<td>Keep the satble temperature of mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hematoxylin</td>
			<td >Roth</td>
			<td >T865.2</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica surgical microscope</td>
			<td >Leica</td>
			<td >M651</td>
			<td>Enlarge the field of view to facilitate the operation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Liquid DAB+Substrate Chromogen System</td>
			<td >Dako</td>
			<td >K3468</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Male ApoE-/- mice</td>
			<td >Charles River Laboratories</td>
			<td >N/A</td>
			<td>Used for establish the Peripheral artery disease mice model</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medetomidine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>128366-50-7</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro Needle Holder</td>
			<td >Black &#38; Black Surgical</td>
			<td >B3B-18-8</td>
			<td>Holding the needle</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro suture tying forceps</td>
			<td >Life Saver Surgical Industries</td>
			<td >PS-MSF-145</td>
			<td>Used to assist in knotting during surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microtome</td>
			<td >Biobase</td>
			<td >Bk-Mt268m</td>
			<td>Used for tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Midazolam</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>44856.01.00</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>N/a</td>
			<td>monitoring vital signs of animal during MRI scan</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Octeniderm farblos</td>
			<td >Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td >180212</td>
			<td>used for disinfection of the skin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ointment for the eyes and nose</td>
			<td >Bayer AG</td>
			<td >1578675</td>
			<td>Keep the eyes wet under the anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td >Roth</td>
			<td >0335.1</td>
			<td>Used for fixation of the tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pentobarbital</td>
			<td>Nembutal</td>
			<td >76-74-4</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Saline</td>
			<td>DeltaSelect</td>
			<td >1299.99.99</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spring handle scissors with fine, sharp tips</td>
			<td >Black &#38; Black Surgical</td>
			<td >B66167</td>
			<td>Used for cutting the artery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SuperCut Scissors</td>
			<td >Black &#38; Black Surgical</td>
			<td >B55992</td>
			<td>Used for cutting the skin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Roth</td>
			<td >9002-93-1</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Western diet, 1.25% Cholesterol</td>
			<td >ssniff Spezialdi&#228;ten GmbH</td>
			<td >E15723-34</td>
			<td>Diet for the mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylene</td>
			<td >Roth</td>
			<td >4436.3</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a modified surgical model of hind limb ischemia in apoe-/- mice using a miniature incision

Hensikten med denne studien er å introdusere og evaluere en modifisert kirurgisk tilnærming for å indusere akutt iskemi hos mus som kan implementeres i de fleste dyrelaboratorier. I motsetning til den konvensjonelle tilnærmingen for dobbel ligasjon av lårarterien (DLFA), ble det gjort et mindre snitt på høyre inguinal region for å utsette den proksimale lårarterien (FA) for å utføre DLFA. Deretter, ved hjelp av en 7-0 sutur, ble snittet dratt til kneområdet for å avsløre den distale FA. Magnetisk resonansavbildning (MR) på bilaterale bakre lemmer ble brukt til å oppdage FA-okklusjon etter operasjonen. Ved 0, 1, 3, 5 og 7 dager etter operasjonen ble funksjonell gjenoppretting av bakre lemmer visuelt vurdert og gradert ved hjelp av Tarlov-skalaen. Histologisk evaluering ble utført etter euthanizing dyrene 7 dager etter DLFA. Prosedyrene ble utført på høyre ben i ti ApoE-/- mus, og ingen mus døde under etterfølgende observasjon. Snittstørrelsene i alle de 10 musene var mindre enn 5 mm( 4,2 ± 0,63 mm). MR-resultater viste at FA-blodstrømmen i den iskemiske siden var tydelig blokkert. Tarlov-skalaresultatene viste at bakre lemfunksjon ble betydelig redusert etter prosedyren og sakte gjenopprettet i løpet av de neste 7 dagene. Histolog evaluering viste en betydelig inflammatorisk respons på den iskemiske siden og redusert mikrovaskulær tetthet i den iskemiske bakre lemmen. Til slutt introduserer denne studien en modifisert teknikk ved hjelp av et miniatyr snitt for å utføre bakre lem iskemi (HLI) ved hjelp av DLFA.

Kjennetegn på ApoE-/- mus DLFA-operasjoner ble utført på 10 mus for å etablere HLI-modellen, og ingen av musene døde etter prosedyren. For å følge endringer i kroppsvekt ble mus veid før DLFA-prosedyren (Pre-DLFA) og 7 dager etter DLFA-operasjonen (Post-DLFA). Pre-DLFA-vekter varierte fra 29,6 til 38,0 g (gjennomsnittlig 34,74 ± 2,47 g), og post-DLFA-vekter varierte fra 2 6,5 til 34,1 g (gjennomsnittlig 30,77 ± 2,15 g), som var signifikant lavere...

Watch this Scientific Journal Video about A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision at JoVE.com

A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision

Denne artikkelen demonstrerer en effektiv kirurgisk tilnærming for å etablere akutt iskemi hos mus med et lite snitt. Denne tilnærmingen kan brukes av de fleste forskningsgrupper uten laboratorieoppgraderinger.

En modifisert kirurgisk modell av hind lem iskemi i ApoE- / - Mus ved hjelp av et miniatyr snitt

The purpose of this study is to introduce and evaluate a modified surgical approach to induce acute ischemia in mice that can be implemented in most ...

Det vi introduserte i dag er en forenklet modifisert og kirurgisk effektiv metode for å etablere bakre lem Iskemi hos ApoE-mus. Denne metoden kan implementeres i ethvert dyreanlegg. Den største fordelen med synovial metode er en lav invasivitet, ved hjelp av et snitt på mindre enn fem millimeter.Metoden har en lærings hof. Vi anbefaler derfor å øve på mikrokirurgiske modeller før du arbeider med dyrene, som skal inkluderes i den endelige analysen. Metoden vil bli demonstrert av Kaixuan Yan, en lege i medisin og studenten fra laboratoriet mitt.Begynn med å forberede nødvendig utstyr og verktøy for operasjonen. Etter å ha administrert anestesi til musen, bruk den salven på øynene for å forhindre tørrhet. Plasser deretter musen på en varmepute for å holde kroppstemperaturen på ca. 37 grader Celsius.Bruk en bomullspinne og hårfjerningskrem, fjern forsiktig håret fra bakre lemhud på høyre side. Legg musen i liggende stilling på varmeputen under et dissekeringsmikroskop. Bruk alkohol til å desinfisere huden og tørk med bomullen bort fra plantesiden av snittet.Ved hjelp av spisse tang og kirurgisk saks gjør et snitt omtrent tre til fire millimeter midt i inngangsregionen. Fjern forsiktig det subkutane fettvevet ved hjelp av fine spisse tang for å eksponere den proksimale femorale nevrovaskulære bunten. Bruk en bomullspinne fuktet med saltvann, flytt forsiktig lårarterien bort fra lårnerven og lårbenet.Deretter bruker spissen av en 7,0 sutur, forsiktig gjennomsyre membranen på lårhylsen. Pass deretter til 7-0 absorberbare suturer gjennom den proksimale lårarterien og lag doble knuter ved hjelp av fjærene saks. Deretter transekterer lårarterien mellom de to båndene.Før den 6-0 absorberbare suturen gjennom den nedre kanten av snittet og dra forsiktig snittet til regionen på høyre side av kneet på bakre lem for å eksponere den distale lårarterien. Beveg forsiktig det subkutane vevet til side for å eksponere nevrovaskulær bunt. Disseker lårarterien fra lårbenet og lårnerven, og bruk bomull for å beskytte nerven.Deretter bruker spissen av en 7,0 sutur, pierce membranen på lårhylsen. Send to 7-0 absorberbare suturer gjennom den distale lårarterien og lag doble knuter ved hjelp av vårsaksen for å transektere lårarterien mellom to bånd. Etterpå kan du sy snittet ved hjelp av de 6-0 absorberbare suturene.Plasser musen på en varmepute i et rent bur og fortsett å overvåke vitale parametere til gjenoppretting. Bestem suksessen til dobbel ligasjon av lårarterien eller DLFA neste dag via MR. Før DLFA-prosedyren varierte vekten av mus fra 29,6 til 38,0 gram.Syv dager etter DLFA-operasjonen varierte vektene fra 26,5 til 34,1 gram, betydelig lavere enn pre-DLFA-vektene. De proksimale og distale regionene i høyre FA viste ingen perfusjon. Tarlov skala resultatene ble betydelig redusert en dag etter operasjonen.Selv om de sakte økte de neste dagene, var de fortsatt lavere enn baseline til dag syv. Potene til de iskemiske bakre lemmer i syv mus klarte ikke å strekke seg naturlig sammenlignet med den kontralaterale siden. I tillegg viste fire av musene liten misfarging av potene sammenlignet med den kontralaterale siden.H&E farging av høyre GM muskel avslørte myofibers som viste uregelmessig iskemisk nekrose, hvor spredning satellittceller hadde erstattet nekrotiske myofibers og ble distribuert i en masse eller med en vanlig dispersjon. Myofibers som viste inflammatorisk infiltrasjon av multinukleerte makrofager hadde mistet sine normale morfologiske egenskaper, med svært få regenererte myofibers til stede. Tverrgående deler av disse regenererte myofiberne var runde.Cytoplasmaet var farget rødt og en liten kjerne eller flere kjerner var plassert i sentrum. Denne typen inflammatorisk mønster ble imidlertid ikke observert i venstre GM. CD31 antistofffarging utført for å observere mikrovaskulær tetthet, indikerte at iskemiske bakre lemmer viste betydelig mer mikrovaskulær tetthet enn den ikke-iskemiske siden. Det viktigste er disseksjon av lårarterie.Operatøren må oppleves i mikrokirurgiske teknikker, samt være kjent med musens bakre anatomi. I prinsippet kan denne metoden også brukes til å studere Iskemi-reperfusjonsskade i beinet. Herved kan arterien okkluderes med en myk karklemme før reperfusjon tillates.

Research

JoVE Journal

Biology

A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Murine Model of Hindlimb Ischemia 

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide.  Medical therapies for ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

En Anoksi-sult Modell for iskemi / Reperfusjon i<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

MikroRNA uttrykk profiler av menneskelige iPS celler, retinal pigment epitelet avledet fra iPS, og Fetal Netthinne Pigment Epitel

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Validering av en musemodell for å forstyrre LINC Komplekser i en celle-spesifikk Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

Massespektrometrianalyse for å identifisere Ubiquitylation av EYFP-merket CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

Utvikling av en celle co-kultur modell for å etterligne hjerte iskemi / reperfusjon in vitro

Ischemic heart disease is the leading cause of death and disability worldwide. Reperfusion causes additional injury beyond ischemia. Endothelial cells ...

Tail Vein Transection Bleeding Model in Fully Anesthetized Hemophilia A Mice

Hale Vene Transeksjon Blødning Modell i Fullt Bedøvet Hemofili En Mus

Tail bleeding models are important tools in hemophilia research, specifically for the assessment of procoagulant effects. The tail vein transection (TVT) ...

Generation of Hook Ischemia-Reperfusion Model using a Three-Day Developing Chick Embryo

Generasjon av Hook Ischemia-Reperfusion Model ved hjelp av en tre-dagers utviklende chick embryo

Ischemia and reperfusion (I/R) disorders, such as myocardial infarction, stroke, and peripheral vascular disease, are a few of the leading causes of ...