Name: a modified surgical model of hind limb ischemia in apoe-/- mice using a miniature incision
Uploaded: 2021-05-13T12:30:00
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Os autores agradecem a Viktoria Skude, Alexander Schlund e Felix Hörner pelo excelente apoio técnico.

NOTA: Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com a diretriz da CE EC 2010/63/UE e foram aprovados pela legislação alemã local (35-9185.81/G[1]239/18). Dez ApoEmasculinos -/- camundongos com fundo C57BL/6J, pesando 29,6-38,0 g, foram alojados em um ciclo claro/escuro de 12 horas e alimentaram uma dieta ocidental (1,25% de colesterol e 21% de gordura) e ad libitum de água por 12 semanas a partir da idade de 8 semanas. O HLI foi realizado em camundongos de 20 semanas de idade...

Este estudo relata uma abordagem modificada, simplificada e cirurgicamente eficiente para estabelecer um modelo HLI em ApoE-/- camundongos usando ligadura dupla nas regiões proximais e distais da FA através de uma incisão de 3-4 mm sem quaisquer atualizações laboratoriais necessárias. A principal característica deste método é o tamanho menor da incisão em comparação com estudos relatados anteriormente descrevendo os modelos HLI do mouse8,9<...

Há necessidade não atendida de modelos animais pré-clínicos para pesquisas em doenças vasculares, como a doença arterial periférica (PAD). Apesar dos desenvolvimentos avançados no diagnóstico e tratamento, houve mais de 200 milhões de pacientes com PAD em2018 1, e seu número está constantemente aumentando. Embora várias novas abordagens terapêuticas2,3,4,5,6,7 tenham sido descritas, a tradução bem sucedida dessas modalidades terapêuticas para a aplicação clínica continua sendo uma tarefa assustadora. Portanto, modelos experimentais in vivo confiáveis e relevantes que simulam a condição da doença humana são necessários para investigar o mecanismo potencial e a eficiência dessas novas abordagens terapêuticas para tratar o PAD6,7.
Hiperlipidemia e aterosclerose (AS) são os principais fatores de risco para o desenvolvimento do PAD. Os camundongos apoE(em uma dieta rica em gordura) apresentam metabolismo de gordura anormal e hiperlipidemia e, posteriormente, desenvolvem placas ateroscleróticas que tornam a ApoE-/- camundongos como a melhor escolha para simular o PAD clinicamente relevante. Os modelos de animais HLI pré-clínicos são gerados por meio da dupla ligadura da artéria femoral (DLFA), que é a abordagem mais utilizada em laboratórios em todo o mundo8,9,10,11,12,13,14,15 para simular isquemia aguda-on-crônica. No entanto, essa abordagem geralmente requer uma incisão relativamente grande e invasiva. Além disso, inevitavelmente leva os animais (especialmente camundongos) a sofrer de aumento da dor e inflamação, o que também influencia os resultados experimentais subsequentes5,6,16,17. Este artigo descreve um modelo HLI agudo-on-crônico em APOE-/- camundongos usando uma incisão muito pequena.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10x Phosphate buffer saline</td>
			<td >Roth</td>
			<td >9143.1</td>
			<td >Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30% H2O2</td>
			<td >Roth</td>
			<td >9681.2</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-0 absorbable sutures</td>
			<td>PROLENE</td>
			<td>8776H</td>
			<td>Used for stitching the skin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-0 absroable suture</td>
			<td >PROLENE</td>
			<td >EP8706</td>
			<td>Used in Surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-0 absorbable sutures</td>
			<td>PROLENE</td>
			<td >EH8021E</td>
			<td>Used for ligating the artery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-0 absroable suture</td>
			<td >PROLENE</td>
			<td >EP8755</td>
			<td>Used in Surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetic acid</td>
			<td >Roth</td>
			<td>6755.1</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Albumin Fraktion V</td>
			<td >Roth</td>
			<td >8076.2</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autoclave</td>
			<td >Systec GmbH</td>
			<td >Systec VX-150</td>
			<td>Used for the sterilisation of the surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Axio vert A1 microscope</td>
			<td >Carl Zeiss</td>
			<td >ZEISS Axio Vert.A1</td>
			<td>Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bruker BioSpec 94/20 AVIII</td>
			<td >Bruker Biospin MRI GmbH</td>
			<td >N/A</td>
			<td>Scan the femoral artery blockage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buprenovet Sine 0,3mg/ml</td>
			<td >Bayer AG</td>
			<td >2542 (WDT)</td>
			<td>Used in post operative pain-management. Dose - 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD31 antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >ab28364</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eosin Y solution 0.5 % in water</td>
			<td >Roth</td>
			<td >X883.1</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epitope Retrieval Solution pH 6</td>
			<td >Leica Biosystems</td>
			<td >6046945</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol &#8805; 99,5 %</td>
			<td >Roth</td>
			<td >5054.1</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fentanyl</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td >437-38-7</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine point forceps</td>
			<td >Medixplus</td>
			<td >93-4505S</td>
			<td>Used for separating the artery from nerve and vein</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass bead sterilisator</td>
			<td >Simon Keller</td>
			<td >Type 250</td>
			<td>Used for sterilisation of the surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Graefe iris forceps curved</td>
			<td >VUBU</td>
			<td >VUBU-02-72207</td>
			<td>Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hair Remover cream, Veet (with aloe vera)</td>
			<td >Reckitt Benckiser</td>
			<td >108972</td>
			<td>Remove hair from mice hind limbs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating plate</td>
			<td >ST&#214;RK-TRONIC</td>
			<td >7042092</td>
			<td>Keep the satble temperature of mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hematoxylin</td>
			<td >Roth</td>
			<td >T865.2</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica surgical microscope</td>
			<td >Leica</td>
			<td >M651</td>
			<td>Enlarge the field of view to facilitate the operation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Liquid DAB+Substrate Chromogen System</td>
			<td >Dako</td>
			<td >K3468</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Male ApoE-/- mice</td>
			<td >Charles River Laboratories</td>
			<td >N/A</td>
			<td>Used for establish the Peripheral artery disease mice model</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medetomidine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>128366-50-7</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro Needle Holder</td>
			<td >Black &#38; Black Surgical</td>
			<td >B3B-18-8</td>
			<td>Holding the needle</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro suture tying forceps</td>
			<td >Life Saver Surgical Industries</td>
			<td >PS-MSF-145</td>
			<td>Used to assist in knotting during surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microtome</td>
			<td >Biobase</td>
			<td >Bk-Mt268m</td>
			<td>Used for tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Midazolam</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>44856.01.00</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>N/a</td>
			<td>monitoring vital signs of animal during MRI scan</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Octeniderm farblos</td>
			<td >Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td >180212</td>
			<td>used for disinfection of the skin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ointment for the eyes and nose</td>
			<td >Bayer AG</td>
			<td >1578675</td>
			<td>Keep the eyes wet under the anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td >Roth</td>
			<td >0335.1</td>
			<td>Used for fixation of the tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pentobarbital</td>
			<td>Nembutal</td>
			<td >76-74-4</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Saline</td>
			<td>DeltaSelect</td>
			<td >1299.99.99</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spring handle scissors with fine, sharp tips</td>
			<td >Black &#38; Black Surgical</td>
			<td >B66167</td>
			<td>Used for cutting the artery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SuperCut Scissors</td>
			<td >Black &#38; Black Surgical</td>
			<td >B55992</td>
			<td>Used for cutting the skin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Roth</td>
			<td >9002-93-1</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Western diet, 1.25% Cholesterol</td>
			<td >ssniff Spezialdi&#228;ten GmbH</td>
			<td >E15723-34</td>
			<td>Diet for the mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylene</td>
			<td >Roth</td>
			<td >4436.3</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a modified surgical model of hind limb ischemia in apoe-/- mice using a miniature incision

O objetivo deste estudo é introduzir e avaliar uma abordagem cirúrgica modificada para induzir isquemia aguda em camundongos que podem ser implementados na maioria dos laboratórios animais. Ao contrário da abordagem convencional para a dupla ligadura da artéria femoral (DLFA), foi feita uma incisão menor na região inguinal direita para expor a artéria femoral proximal (FA) para a realização de DLFA. Em seguida, utilizando uma sutura 7-0, a incisão foi arrastada para a região do joelho para expor a ressonância magnética distal (RM) em membros traseiros bilaterais foi usada para detectar oclusão da FA após a cirurgia. Aos 0, 1, 3, 5 e 7 dias após a cirurgia, a recuperação funcional dos membros posteriores foi avaliada visualmente e avaliada por meio da escala de Tarlov. A avaliação histológica foi realizada após eutanásia dos animais 7 dias após a DLFA. Os procedimentos foram realizados com sucesso na perna direita em dez ApoE-/- camundongos, e nenhum camundongo morreu durante observação subsequente. Os tamanhos de incisão em todos os 10 camundongos foram inferiores a 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). Os resultados da ressonância mostraram que o fluxo sanguíneo da FA no lado isquêmico estava claramente bloqueado. Os resultados da escala tarlov demonstraram que a função do membro traseiro diminuiu significativamente após o procedimento e se recuperou lentamente nos 7 dias seguintes. A avaliação histólógica mostrou uma resposta inflamatória significativa no lado isquêmico e reduziu a densidade microvascular no membro traseiro isquêmico. Em conclusão, este estudo introduz uma técnica modificada usando uma incisão em miniatura para realizar isquemia de membros traseiros (HLI) utilizando DLFA.

Características do ApoE-/- ratos As cirurgias de DLFA foram realizadas com sucesso em 10 camundongos para estabelecer o modelo HLI, e nenhum dos camundongos morreu após o procedimento. Para acompanhar as mudanças no peso corporal, os camundongos foram pesados antes do procedimento DLFA (Pré-DLFA) e 7 dias após a cirurgia de DLFA (Pós-DLFA). Os pesos pré-DLFA variaram de 29,6 a 38,0 g (média de 34,74 ± 2,47 g), e os pesos pós-DLFA variaram de 26.5...

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A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision

Este artigo demonstra uma abordagem cirúrgica eficiente para estabelecer isquemia aguda em camundongos com uma pequena incisão. Essa abordagem pode ser aplicada pela maioria dos grupos de pesquisa sem quaisquer atualizações laboratoriais.

Um modelo cirúrgico modificado de isquemia de membros traseiros em ApoE-/- Ratos usando uma incisão em miniatura

The purpose of this study is to introduce and evaluate a modified surgical approach to induce acute ischemia in mice that can be implemented in most ...

O que introduzimos hoje é um método simplificado modificado e cirurgicamente eficiente, para estabelecer isquemia de membros traseiros em camundongos ApoE. Este método pode ser implementado em qualquer instalação animal. A principal vantagem do método sinovial é uma baixa invasividade, utilizando uma incisão de menos de cinco milímetros.O método tem um aprendizado. Por isso, aconselhamos a prática em modelos microcirúrgicos antes de trabalhar nos animais, que serão incluídos na análise final. O método será demonstrado por Kaixuan Yan, um médico de medicina e o aluno do meu laboratório.Comece preparando os equipamentos e ferramentas necessários para a cirurgia. Depois de administrar a anestesia ao camundongo, aplique essa pomada nos olhos para evitar o ressecamento. Em seguida, coloque o mouse em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal do núcleo a aproximadamente 37 graus Celsius.Usando um cotonete e creme de depilação, remova cuidadosamente o cabelo da pele do membro traseiro do lado direito. Coloque o mouse na posição supina na almofada de aquecimento sob um microscópio dissecando. Use álcool para desinfetar a pele e limpar com o algodão longe do lado vegetal da incisão.O uso de fórceps pontiagudas e tesouras cirúrgicas fazem uma incisão de aproximadamente três a quatro milímetros no meio da região inguinal. Remova cuidadosamente o tecido adiposo subcutâneo com a ajuda de fórceps pontiagudas finos para expor o feixe neurovascular femoral proximal. Usando um cotonete umedecido com soro fisiológico, mova cuidadosamente a artéria femoral para longe do nervo femoral e da veia femoral.Em seguida, usando a ponta de uma sutura 7.0, fure cuidadosamente a membrana da baia femoral. Em seguida, passe para suturas absorvíveis de 7-0 através da artéria femoral proximal e faça nós duplos usando a tesoura de molas. Depois transecte a artéria femoral entre os dois laços.Passe a sutura absorvível 6-0 através da borda inferior da incisão e arraste suavemente a incisão para a região do lado direito do joelho do membro traseiro para expor a artéria femoral distal. Mova cuidadosamente o tecido subcutâneo para expor o feixe neurovascular. Disseque a artéria femoral da veia femoral e do nervo femoral, e use algodão para proteger o nervo.Em seguida, usando a ponta de uma sutura 7.0, fure a membrana da baia femoral. Passe duas suturas absorvíveis 7-0 através da artéria femoral distal e faça nós duplos usando a tesoura de mola para transstoar a artéria femoral entre dois laços. Depois, costure a incisão usando as suturas absorvíveis 6-0.Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento em uma gaiola limpa e continue monitorando seus parâmetros vitais até a recuperação. Determine o sucesso da dupla ligadura da artéria femoral ou DLFA no dia seguinte via ressonância magnética. Antes do procedimento de DLFA, os pesos dos camundongos variavam de 29,6 a 38,0 gramas.Sete dias após a cirurgia de DLFA, os pesos variaram de 26,5 a 34,1 gramas, significativamente inferiores aos pesos pré-DLFA. As regiões proximais e distais da FA direita não apresentaram perfusão. Os resultados da escala tarlov foram significativamente diminuídos um dia após a cirurgia.Embora tenham aumentado lentamente nos dias seguintes, eles ainda estavam abaixo da linha de base até o sétimo dia. As patas dos membros traseiros isquêmicos em sete camundongos não foram capazes de esticar naturalmente em comparação com o lado contralateral. Além disso, quatro dos camundongos apresentaram leve descoloração das patas em comparação com o lado contralateral.A coloração de H&E do músculo GM direito revelou miofibers que exibiam necrose isquêmica irregular, onde células satélites proliferantes haviam substituído os miofibers necrosados e foram distribuídos em massa ou com dispersão regular. Myofibers exibindo infiltração inflamatória por macrófagos multinucleados perderam suas características morfológicas normais, com muito poucos miofibers regenerados presentes. Seções transversais desses myofibers regenerados eram redondas.O citoplasma estava manchado de vermelho e um pequeno núcleo ou múltiplos núcleos estavam localizados no centro. No entanto, esse tipo de padrão inflamatório não foi observado no GM esquerdo. A coloração de anticorpos CD31 realizada para observar a densidade microvascular indicou que os membros traseiros isquêmicos apresentaram significativamente mais densidade microvascular do que o lado não isquêmico. O mais importante é a dissecção da artéria femoral.O operador precisa ser experimentado em técnicas microcirúrgicas, bem como estar familiarizado com a anatomia do javal do rato. Em princípio, este método também poderia ser usado para estudar lesão isquemia-reperfusão na perna. Por meio deste, a artéria pode ser ocluída com um grampo de vaso macio antes de permitir a reperfusão.

Research

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Biology

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Biologia

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