Name: a modified surgical model of hind limb ischemia in apoe-/- mice using a miniature incision
Uploaded: 2021-05-13T12:30:00
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Los autores agradecen a Viktoria Skude, Alexander Schlund y Felix Hörner por el excelente soporte técnico.

NOTA: Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con la directriz CE 2010/63/EU y han sido aprobados por la legislación local alemana (35-9185.81/G[1]239/18). Diez ratones machos ApoE-/- con el fondo C57BL /6J, con un peso de 29.6-38.0 g, fueron alojados en un ciclo de luz / oscuridad de 12 h y alimentados con una dieta occidental (1.25% de colesterol y 21% de grasa) y agua ad libitum durante 12 semanas a partir de la edad de 8 semanas. HLI se realizó en ratones de 20 semanas d...

Este estudio informa un enfoque modificado, simplificado y quirúrgicamente eficiente para establecer un modelo de HLI en ratones ApoE-/- utilizando doble ligadura en las regiones proximal y distal de la FA a través de una incisión de 3-4 mm sin ninguna actualización de laboratorio requerida. La principal característica de este método es el menor tamaño de la incisión en comparación con los estudios previamente informados que describen modelos de HLI deratón 8,<...

Existe una necesidad insatisfecha de modelos animales preclínicos para la investigación en enfermedades vasculares como la enfermedad arterial periférica (EAP). A pesar de los avances avanzados en el diagnóstico y el tratamiento, hubo más de 200 millones de pacientes con EAP en 20181, y su número aumenta constantemente. Aunque se han descrito varios enfoques terapéuticos novedosos2,3,4,5,6,7, la traducción exitosa de estas modalidades terapéuticas en la aplicación clínica sigue siendo una tarea desalentadora. Por lo tanto, se requieren modelos experimentales in vivo confiables y relevantes que simulen la condición de la enfermedad humana para investigar el mecanismo potencial y la eficiencia de estos nuevos enfoques terapéuticos para tratar la EAP6,7.
La hiperlipidemia y la aterosclerosis (EA) son los principales factores de riesgo para el desarrollo de la EAP. Los ratones ApoE-/- (con una dieta alta en grasas) muestran un metabolismo anormal de las grasas e hiperlipidemia y posteriormente desarrollan placas ateroscleróticas que convierten a los ratones en ApoE-/- como la mejor opción para simular la EAP clínicamente relevante. Los modelos animales preclínicos de HLI se generan a través de la doble ligadura de la arteria femoral (DLFA), que es el enfoque más utilizado en laboratorios de todo el mundo8,9,10,11, 12,13, 14,15 para simular isquemia aguda sobre crónica. Sin embargo, este enfoque generalmente requiere una incisión relativamente grande e invasiva. Además, conduce inevitablemente a que los animales (especialmente los ratones) sufran un aumento de la lesión por dolor y la inflamación, lo que también influye en los resultados experimentales posteriores5,6,16,17. Este artículo describe un modelo de HLI agudo sobre crónico en ratones APOE-/- mediante el uso de una incisión muy pequeña.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10x Phosphate buffer saline</td>
			<td >Roth</td>
			<td >9143.1</td>
			<td >Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30% H2O2</td>
			<td >Roth</td>
			<td >9681.2</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-0 absorbable sutures</td>
			<td>PROLENE</td>
			<td>8776H</td>
			<td>Used for stitching the skin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-0 absroable suture</td>
			<td >PROLENE</td>
			<td >EP8706</td>
			<td>Used in Surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-0 absorbable sutures</td>
			<td>PROLENE</td>
			<td >EH8021E</td>
			<td>Used for ligating the artery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-0 absroable suture</td>
			<td >PROLENE</td>
			<td >EP8755</td>
			<td>Used in Surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetic acid</td>
			<td >Roth</td>
			<td>6755.1</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Albumin Fraktion V</td>
			<td >Roth</td>
			<td >8076.2</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Autoclave</td>
			<td >Systec GmbH</td>
			<td >Systec VX-150</td>
			<td>Used for the sterilisation of the surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Axio vert A1 microscope</td>
			<td >Carl Zeiss</td>
			<td >ZEISS Axio Vert.A1</td>
			<td>Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bruker BioSpec 94/20 AVIII</td>
			<td >Bruker Biospin MRI GmbH</td>
			<td >N/A</td>
			<td>Scan the femoral artery blockage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buprenovet Sine 0,3mg/ml</td>
			<td >Bayer AG</td>
			<td >2542 (WDT)</td>
			<td>Used in post operative pain-management. Dose - 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD31 antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >ab28364</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eosin Y solution 0.5 % in water</td>
			<td >Roth</td>
			<td >X883.1</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Epitope Retrieval Solution pH 6</td>
			<td >Leica Biosystems</td>
			<td >6046945</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol &#8805; 99,5 %</td>
			<td >Roth</td>
			<td >5054.1</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fentanyl</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td >437-38-7</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine point forceps</td>
			<td >Medixplus</td>
			<td >93-4505S</td>
			<td>Used for separating the artery from nerve and vein</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass bead sterilisator</td>
			<td >Simon Keller</td>
			<td >Type 250</td>
			<td>Used for sterilisation of the surgical instruments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Graefe iris forceps curved</td>
			<td >VUBU</td>
			<td >VUBU-02-72207</td>
			<td>Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hair Remover cream, Veet (with aloe vera)</td>
			<td >Reckitt Benckiser</td>
			<td >108972</td>
			<td>Remove hair from mice hind limbs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating plate</td>
			<td >ST&#214;RK-TRONIC</td>
			<td >7042092</td>
			<td>Keep the satble temperature of mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hematoxylin</td>
			<td >Roth</td>
			<td >T865.2</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica surgical microscope</td>
			<td >Leica</td>
			<td >M651</td>
			<td>Enlarge the field of view to facilitate the operation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Liquid DAB+Substrate Chromogen System</td>
			<td >Dako</td>
			<td >K3468</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Male ApoE-/- mice</td>
			<td >Charles River Laboratories</td>
			<td >N/A</td>
			<td>Used for establish the Peripheral artery disease mice model</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medetomidine</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>128366-50-7</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro Needle Holder</td>
			<td >Black &#38; Black Surgical</td>
			<td >B3B-18-8</td>
			<td>Holding the needle</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro suture tying forceps</td>
			<td >Life Saver Surgical Industries</td>
			<td >PS-MSF-145</td>
			<td>Used to assist in knotting during surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microtome</td>
			<td >Biobase</td>
			<td >Bk-Mt268m</td>
			<td>Used for tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Midazolam</td>
			<td>Ratiopharm</td>
			<td>44856.01.00</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025</td>
			<td>SA Instruments</td>
			<td>N/a</td>
			<td>monitoring vital signs of animal during MRI scan</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Octeniderm farblos</td>
			<td >Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH</td>
			<td >180212</td>
			<td>used for disinfection of the skin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ointment for the eyes and nose</td>
			<td >Bayer AG</td>
			<td >1578675</td>
			<td>Keep the eyes wet under the anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td >Roth</td>
			<td >0335.1</td>
			<td>Used for fixation of the tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pentobarbital</td>
			<td>Nembutal</td>
			<td >76-74-4</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Saline</td>
			<td>DeltaSelect</td>
			<td >1299.99.99</td>
			<td>Used for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spring handle scissors with fine, sharp tips</td>
			<td >Black &#38; Black Surgical</td>
			<td >B66167</td>
			<td>Used for cutting the artery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SuperCut Scissors</td>
			<td >Black &#38; Black Surgical</td>
			<td >B55992</td>
			<td>Used for cutting the skin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Roth</td>
			<td >9002-93-1</td>
			<td>Used for immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Western diet, 1.25% Cholesterol</td>
			<td >ssniff Spezialdi&#228;ten GmbH</td>
			<td >E15723-34</td>
			<td>Diet for the mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylene</td>
			<td >Roth</td>
			<td >4436.3</td>
			<td>Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a modified surgical model of hind limb ischemia in apoe-/- mice using a miniature incision

El propósito de este estudio es introducir y evaluar un enfoque quirúrgico modificado para inducir isquemia aguda en ratones que se puede implementar en la mayoría de los laboratorios de animales. Contrariamente al enfoque convencional para la doble ligadura de la arteria femoral (DLFA), se realizó una incisión más pequeña en la región inguinal derecha para exponer la arteria femoral proximal (FA) para realizar DLFA. Luego, usando una sutura de 7-0, la incisión se arrastró a la región de la rodilla para exponer la FA distal. Se utilizó una resonancia magnética (MRI) en las extremidades posteriores bilaterales para detectar la oclusión de FA después de la cirugía. A los 0, 1, 3, 5 y 7 días después de la cirugía, la recuperación funcional de las extremidades posteriores se evaluó visualmente y se calificó utilizando la escala de Tarlov. La evaluación histológica se realizó después de la eutanasia de los animales 7 días después de DLFA. Los procedimientos se realizaron con éxito en la pierna derecha en diez ratones ApoE-/-, y ningún ratón murió durante la observación posterior. Los tamaños de la incisión en los 10 ratones fueron inferiores a 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). Los resultados de la resonancia magnética mostraron que el flujo sanguíneo de FA en el lado isquémico estaba claramente bloqueado. Los resultados de la escala de Tarlov demostraron que la función de la extremidad posterior disminuyó significativamente después del procedimiento y se recuperó lentamente durante los siguientes 7 días. La evaluación histológica mostró una respuesta inflamatoria significativa en el lado isquémico y una densidad microvascular reducida en la extremidad posterior isquémica. En conclusión, este estudio introduce una técnica modificada utilizando una incisión en miniatura para realizar isquemia de las extremidades posteriores (HLI) utilizando DLFA.

Características de los ratones ApoE-/- Las cirugías DLFA se realizaron con éxito en 10 ratones para establecer el modelo HLI, y ninguno de los ratones murió después del procedimiento. Para seguir los cambios en el peso corporal, los ratones fueron pesados antes del procedimiento DLFA (Pre-DLFA) y 7 días después de la cirugía DLFA (Post-DLFA). Los pesos pre-DLFA variaron de 29,6 a 38,0 g (media 34,74 ± 2,47 g), y los pesos post-DLFA variaron de 26...

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A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision

Este artículo demuestra un enfoque quirúrgico eficiente para establecer la isquemia aguda en ratones con una pequeña incisión. Este enfoque puede ser aplicado por la mayoría de los grupos de investigación sin ninguna actualización de laboratorio.

Un modelo quirúrgico modificado de isquemia de la extremidad posterior en ApoE-/- Ratones que usan una incisión en miniatura

The purpose of this study is to introduce and evaluate a modified surgical approach to induce acute ischemia in mice that can be implemented in most ...

Lo que presentamos hoy es un método simplificado modificado y quirúrgicamente eficiente, para establecer la isquemia de las extremidades posteriores en ratones ApoE. Este método se puede implementar en cualquier instalación de animales. La principal ventaja del método sinovial es una baja invasividad, utilizando una incisión de menos de cinco milímetros.El método tiene un hof de aprendizaje. Por lo tanto, aconsejamos practicar en modelos microquirúrgicos antes de trabajar en los animales, que se incluirán en el análisis final. El método será demostrado por Kaixuan Yan, un doctor en medicina y el estudiante de mi laboratorio.Comience por preparar el equipo y las herramientas necesarias para la cirugía. Después de administrar la anestesia al ratón, aplique ese ungüento en los ojos para prevenir la sequedad. Luego coloque el mouse en una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal central a aproximadamente 37 grados centígrados.Usando un hisopo de algodón y una crema depilatoria, elimine cuidadosamente el vello de la piel de la extremidad posterior en el lado derecho. Coloque el ratón en posición supina sobre la almohadilla térmica bajo un microscopio de disección. Use alcohol para desinfectar la piel y limpie con el algodón lejos del lado de la planta de la incisión.Usando las pinzas puntiagudas y las tijeras quirúrgicas se realiza una incisión de aproximadamente tres a cuatro milímetros en el centro de la región inguinal. Retire cuidadosamente el tejido graso subcutáneo con la ayuda de fórceps puntiagudos finos para exponer el haz neurovascular femoral proximal. Usando un hisopo de algodón humedecido con solución salina, mueva cuidadosamente la arteria femoral lejos del nervio femoral y la vena femoral.Luego, usando la punta de una sutura 7.0, perfore cuidadosamente la membrana de la vaina femoral. Luego pase a 7-0 suturas absorbibles a través de la arteria femoral proximal y haga nudos dobles usando las tijeras de resortes. Posteriormente transecta la arteria femoral entre los dos lazos.Pase la sutura absorbible 6-0 a través del borde inferior de la incisión y arrastre suavemente la incisión a la región del lado derecho de la rodilla de la extremidad posterior para exponer la arteria femoral distal. Mueva con cuidado el tejido subcutáneo a un lado para exponer el haz neurovascular. Diseccionar la arteria femoral de la vena femoral y el nervio femoral, y usar algodón para proteger el nervio.Luego, usando la punta de una sutura 7.0, perfore la membrana de la vaina femoral. Pase dos suturas absorbibles 7-0 a través de la arteria femoral distal y haga nudos dobles usando las tijeras de resorte para transectar la arteria femoral entre dos lazos. Después, sutura la incisión con las suturas absorbibles 6-0.Coloque el ratón en una almohadilla térmica en una jaula limpia y continúe monitoreando sus parámetros vitales hasta la recuperación. Determinar el éxito de la doble ligadura de la arteria femoral o DLFA al día siguiente a través de una resonancia magnética. Antes del procedimiento DLFA, los pesos de los ratones oscilaban entre 29,6 y 38,0 gramos.Siete días después de la cirugía DLFA, los pesos variaron de 26.5 a 34.1 gramos, significativamente más bajos que los pesos pre-DLFA. Las regiones proximal y distal de la AF derecha no mostraron perfusión. Los resultados de la escala de Tarlov disminuyeron significativamente un día después de la cirugía.Aunque aumentaron lentamente durante los días siguientes, todavía fueron más bajos que la línea de base hasta el día siete. Las patas de las extremidades posteriores isquémicas en siete ratones no pudieron estirarse naturalmente en comparación con el lado contralateral. Además, cuatro de los ratones exhibieron una ligera decoloración de las patas en comparación con el lado contralateral.La tinción H&E del músculo GM derecho reveló miofibras que exhibían necrosis isquémica irregular, donde las células satélite proliferantes habían reemplazado a las miofibras necróticas y se distribuían en una masa o con una dispersión regular. Las miofiberes que exhibían infiltración inflamatoria por macrófagos multinucleados habían perdido sus características morfológicas normales, con muy pocas miofibras regeneradas presentes. Las secciones transversales de estos miofibras regeneradas eran redondas.El citoplasma se tiñó de rojo y un núcleo pequeño o múltiples núcleos se localizaron en el centro. Sin embargo, este tipo de patrón inflamatorio no se observó en el GM izquierdo. La tinción de anticuerpos CD31 realizada para observar la densidad microvascular, indicó que las extremidades posteriores isquémicas exhibieron significativamente más densidad microvascular que el lado no isquémico. Lo más importante es la disección de la arteria femoral.El operador debe tener experiencia en técnicas microquirúrgicas, así como estar familiarizado con la anatomía de las extremidades posteriores del ratón. En principio, este método también podría utilizarse para estudiar la lesión por isquemia-reperfusión en la pierna. Por lo tanto, la arteria se puede ocluir con una abrazadera de vaso blando antes de permitir la reperfusión.

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