Name: generation of human kidney tubuloids from tissue and urine
Uploaded: 2021-04-16T13:30:00
Duration: 8 min 34 s
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Ringraziamo tutti i pazienti e le loro famiglie per aver partecipato allo studio. Ringraziamo il team clinico che ha facilitato la nostra ricerca. Siamo grati per il sostegno del Consiglio europeo della ricerca (CER) 850571 (J.D.), della Dutch Cancer Society (KWF) / Alpe d'HuZes Bas Mulder Award (n. 10218, J.D.), dell'Oncode Institute e della Foundation Children Cancer Free (KiKa n. 292, C.C.)

NOTA: Gli esperimenti qui descritti sono stati approvati dal comitato etico medico dell'Erasmus Medical Center (Rotterdam, Paesi Bassi) e dal Princess Máxima Center for Pediatric Oncology (Utrecht, Paesi Bassi).
1. Generazione di tubuloidi renali umani dal tessuto
<ol><li>Materiali<ol>
<li>Piastre di coltura tissutale multiwell prebelliche (6, 12 e 24 pozzi) durante la notte a 37 °C.</li>
		<li>Preparare il mezzo basale (AdDF + ++) aggiungendo 1x integratore di L-alanina / L-glutammina, 1% p / v 4-(2-idrossietil)-1-piperazina acido etansolfonico (HEPES, 10 mM) e 1% di antibiotici penicillina / streptomicina a DMEM / F12 avanzato.</li>
		<li>Preparare il terreno di coltura aggiungendo l'1,5% di integratore B27, il 10% di terreno condizionato da R-spondina, il fattore di crescita epidermico (50 ng / mL), il fattore di crescita dei fibroblasti-10 (100 ng / mL), N-acetilcisteina (1,25 mM), l'inibitore della rho-chinasi Y-27632 (10 μM), antibiotici ad ampio spettro (0,1 mg / mL) e A83-01 (5 μM) ad AdDF + ++. Riscaldare a 37 °C prima dell'uso.</li>
		<li>Preparare l'estratto di membrana basale (BME) scongelando un'aliquota durante la notte a 4 °C. Mantenere il BME sul ghiaccio durante la procedura.</li>
		<li>Preparare la soluzione di collagenasi diluendo la collagenasi ad una concentrazione finale di 1 mg/mL in AdDF+++, con l'aggiunta di 10 μM Y-27632. Riscaldare fino a 37 °C.</li>
		<li>Preparare piatti di Petri da 10 cm, bisturi e pinzette. Disinfettare gli utensili applicando una lampada a raggi ultravioletti per 20 minuti, seguita da lavaggi con disinfettante, acqua demi ed etanolo al 70% v / v. Asciugare all'aria gli utensili.</li>
		<li>Prima del riscaldamento uno shaker orizzontale a 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Procedimento<ol>
<li>Raccogliere il tessuto renale in un tubo da 50 ml riempito con 30-40 mL di mezzo AdDF+++. Posizionare il pezzo di tessuto in ~ 1 mL di mezzo in una capsula di Petri di 10 cm. Tritare il tessuto in pezzi di ~ 1 mm3 usando bisturi (Figura 1A).</li>
		<li>Trasferire il tessuto tritato in un tubo da 15 ml usando pinci e bisturi. Aggiungere 5 ml di AdDF+++ alla capsula di Petri, lavare e raccogliere il mezzo con una pipetta sterile da 10 mL. Trasferire tutti questi contenuti sullo stesso tubo.</li>
		<li>Centrifugare a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante. Aggiungere 3-4 mL di soluzione di collagenasi al tubo da 15 mL. Spostare il tubo su uno shaker orizzontale impostato a 37 °C e una velocità di 250 giri/min.</li>
		<li>Dopo i primi 15 minuti di incubazione, controllare il campione e agitare vigorosamente il tubo. Ripetere fino a quando la sospensione è omogenea e la maggior parte dei pezzi di tessuto sono scomparsi, con un tempo massimo di incubazione di 45-60 min. (Figura 1B).</li>
		<li>Riempire il tubo con AdDF+++ e mescolare invertendo il tubo 5-10x. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Se il pellet è rosso, procedere con il passaggio 1.2.6. In caso contrario, andare al passaggio 1.2.8.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di tampone di lisi dei globuli rossi (vedere la tabella dei materiali)sopra il pellet cellulare. Picchiettare delicatamente il tubo per risesose il pellet (non risospendare con la punta della pipetta). Incubare a temperatura ambiente per 5 min.</li>
		<li>Riempi il tubo con AdDF+++. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Se le cellule del sangue sono ancora visibili, ripetere la procedura ancora una volta, a partire dal passaggio 1.2.6. In caso contrario, procedere con il passaggio 1.2.8.</li>
		<li>Se a questo punto del protocollo sono visibili pezzi di tessuto, procedere con il passaggio 1.2.8. In caso contrario, procedere con la misurazione del volume del pellet al punto 1.2.9. Aggiungere 5 mL di AdDF+++ al tubo e ricaricare con una pipetta sterile da 10 mL. Filtrare la sospensione attraverso un filtro a celle di nylon da 100 μm posto su un tubo da 50 ml.</li>
		<li>Trasferire la sospensione filtrata in un nuovo tubo da 15 ml. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Misurare il volume del pellet di cella utilizzando una pipetta p1000 impostata su un volume noto. Pipettare con cura su e giù per ricandidare senza creare bolle d'aria. Trasferire il tubo sul ghiaccio per 1 min.</li>
		<li>Aggiungere il 70-75% di volume di BME al pellet. Ripresa utilizzando una pipetta p1000 o p200 e piastre da 15 μL di goccioline in una piastra di coltura cellulare multiwell preriscaldata (6, 12 o 24 pozzetti, in base al volume totale di placcatura (<100 μL, 24 pozzetti; 100-200 μL, 12 pozzetti; >200 μL, 6 pozzetti)).</li>
		<li>Capovolgere la piastra e lasciare riposare la piastra nell'incubatrice per 15-20 minuti a 37 °C (Figura 1C). Aggiungere il terreno di coltura prebellico e ispezionare le colture (Figura 1C,D).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Generazione di tubuloidi renali umani dalle urine
NOTA: L'urina è un ambiente ostile per le cellule. È importante per una corretta esecuzione di questo protocollo che i campioni di urina vengano elaborati il prima possibile, preferibilmente entro 4 ore dall'escrezione. Nel frattempo, i campioni di urina devono essere conservati a 4 °C.
<ol><li>Materiali<ol>
<li>Piastre di coltura tissutale multiwell prebelliche (6, 12 e 24 pozzi) durante la notte a 37 °C.</li>
		<li>Preparare il mezzo di lavaggio: AdDF+++ integrato con antibiotici ad ampio spettro (0,1 mg/ml) e 10 μM Y-27632.</li>
		<li>Preparare il terreno di coltura come descritto sopra. Riscaldare a 37 °C prima dell'uso.</li>
		<li>Preparare la matrice BME. Tenere sul ghiaccio durante la procedura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Procedimento<ol>
<li>Raccogliere un campione di urina e dividerlo equamente in provette da 50 ml (Figura 2A-I). Aggiungere 10-20 ml di mezzo di lavaggio a ciascuno dei tubi. Centrifugare a 300 × g per 5 min a 4 °C (Figura 2A-II), e rimuovere accuratamente il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 10 ml di mezzo di lavaggio a ciascuno dei tubi. Rispenare con cura il pellet utilizzando una pipetta sterile da 10 ml. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C (Figura 2A-III), e rimuovere accuratamente il surnatante.</li>
		<li>Risuspendare i pellet e trasferire il contenuto di tutti i tubi in un tubo da 15 ml. Riempire il tubo con il mezzo di lavaggio. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C (Figura 2A-IV), e rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Misurare il volume del pellet di cella utilizzando una pipetta p1000 impostata su un volume noto. Pipettare con cura su e giù per ricandidare senza creare bolle d'aria. Trasferire il tubo sul ghiaccio per 1 min.</li>
		<li>Aggiungere il 70-75% di volume del BME al pellet. Ripresa utilizzando una pipetta p1000 o p200 e piastre da 15 μL di goccioline in una piastra di coltura cellulare multiwell preriscaldata (6, 12 o 24 pozzetti, in base al volume totale di placcatura (<100 μL, 24 pozzetti; 100-200 μL, 12 pozzetti; >200 μL, 6 pozzetti)).</li>
		<li>Capovolgere le piastre nell'incubatrice per 15-20 minuti a 37 °C. Aggiungere il terreno di coltura prebellico e ispezionare le colture (Figura 2B).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Espansione delle colture tubuloidi
NOTA: le colture tubuloidi possono essere attraversate approssimativamente ogni 1-2 settimane con un rapporto di divisione di 1: 2-1: 3. Possono essere tipicamente espansi per circa 15 passaggi, con variazioni specifiche della linea.
<ol><li>Materiali<ol>
<li>Piastre di coltura tissutale multiwell prebelliche (6, 12 e 24 pozzi) durante la notte a 37 °C.</li>
		<li>Preparare il mezzo basale (AdDF+++) e tenerlo sul ghiaccio durante la procedura.</li>
		<li>Preparare il terreno di coltura come descritto in precedenza. Riscaldare fino a 37 °C prima dell'uso.</li>
		<li>Preparare la matrice BME e mantenere il ghiaccio durante la procedura.</li>
		<li>Preparare l'agente sostitutivo della tripsina con l'aggiunta di Y-27632 ad una concentrazione di 10 μM. Riscaldare fino a 37 °C prima dell'uso.</li>
		<li>Punte p10 non filtrate in autoclave.</li>
		<li>Raffreddare la centrifuga a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Procedimento<ol>
<li>Interrompere le goccioline contenenti i tubuloidi pipettando su e giù con una pipetta p1000 usando il mezzo presente nel pozzo. Usa la punta per raschiare il fondo del pozzo, assicurandoti di raccogliere tutte le cellule attaccate al fondo.</li>
		<li>Raccogliere il contenuto in un tubo da 15 ml. Aggiungi 10 ml di AdDF+++. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante.</li>
		<li>In base alle dimensioni del pellet, aggiungere l'agente sostitutivo della tripsina integrato con 10 μM Y-27632. Utilizzare 1 mL di agente sostitutivo della tripsina per 200 μL di goccioline BME contenenti tubuloidi. Incubare a 37 °C per 5 min.</li>
		<li>Utilizzare una pipetta p1000 con punta e inserire una punta p10 sterile non filtrata sopra la punta da 1000 μL. Pipetta su e giù per 20-30x per interrompere meccanicamente gli organoidi.</li>
		<li>Controllare al microscopio se molti organoidi intatti sono ancora presenti nel tubo (Figura 3A). Se a questo punto è presente più del 10% di organoidi intatti, ripetere ancora una volta dall'incubazione di 5 minuti nel passaggio 3.2.3 all'osservazione microscopica per gli organoidi intatti nel passaggio 3.2.5. In caso contrario, procedere con il passaggio 3.2.6.</li>
		<li>Riempi il tubo con AdDF+++. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Misurare il volume del pellet di cella utilizzando una pipetta p1000 impostata su un volume noto. Pipettare con cura su e giù per ricandidare senza creare bolle d'aria. Trasferire il tubo sul ghiaccio per 1 min.</li>
		<li>Aggiungere il 70-75% di volume di BME al pellet. Ripresa utilizzando una pipetta p1000 o p200 e piastre da 15 μL di goccioline in una piastra di coltura cellulare multiwell preriscaldata (6, 12 o 24 pozzetti, in base al volume totale di placcatura (<100 μL, 24 pozzetti; 100-200 μL, 12 pozzetti; >200 μL, 6 pozzetti)).</li>
		<li>Capovolgere le piastre e lasciare riposare la piastra nell'incubatrice per 15-20 minuti a 37 °C. Aggiungere il terreno di coltura prebellico e ispezionare le colture (Figura 3B).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Romagnani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+kidney+disease.">Chronic kidney disease.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 3, 17088 (2017).</li><li>Ooms, A. H., Calandrini, C., de Krijger, R. R., Drost, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+childhood+kidney+tumours.">Organoid models of childhood kidney tumours.</a> Nature Reviews. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+can+predict+response+to+chemotherapy+in+metastatic+colorectal+cancer+patients.">Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients.</a> Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).</li><li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+profiling+identifies+common+responders+to+chemotherapy+in+pancreatic+cancer.">Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer.</a> Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).</li><li>Morales-Alvarez, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephrotoxicity+of+antimicrobials+and+antibiotics.">Nephrotoxicity of antimicrobials and antibiotics.</a> Advances in Chronic Kidney Disease. 27 (1), 31-37 (2020).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+cancer+mutations+in+cultured+human+intestinal+stem+cells.">Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells.</a> Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).</li><li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+surrogate+Wnts+support+organoid+growth+and+deconvolute+Frizzled+pleiotropy+in+vivo.">Next-generation surrogate Wnts support organoid growth and deconvolute Frizzled pleiotropy in vivo.</a> Cell Stem Cell. 27 (5), 840-851 (2020).</li><li>D&#246;rrenhaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultures+of+exfoliated+epithelial+cells+from+different+locations+of+the+human+urinary+tract+and+the+renal+tubular+system.">Cultures of exfoliated epithelial cells from different locations of the human urinary tract and the renal tubular system.</a> Archives of Toxicology. 74 (10), 618-626 (2000).</li></ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Gli organoidi sono considerati avatar del tessuto da cui derivano. Consentono una rapida espansione del materiale del paziente pur mantenendo le caratteristiche genotipiche e fenotipiche del tessuto di origine15. La tecnologia organoide ha recentemente aperto le porte allo sviluppo di modelli preclinici più rappresentativi, che possono essere utilizzati come strumenti importanti per tradurre i risultati dal banco al capezzale. I tubuloidi renali sono promettenti modelli in vitro per testare la nefrotossicità indotta da farmaci, un effetto collaterale comune di molti farmaci chemioterapici2,8,12. Pertanto, le colture organoidi tumorali derivate dal paziente hanno dimostrato di essere predittive per la risposta del paziente al trattamento16,17,18. Testare i farmaci in modo ad alto rendimento sui tubuloidi consente quindi potenzialmente una migliore definizione delle finestre terapeutiche e riduce il rischio di nefrotossicità indotta da farmaci nei pazienti.
Gli antibiotici comunemente usati sono stati descritti per esercitare un effetto tossico sui reni19. Sebbene la presenza di antibiotici ad ampio spettro sia necessaria per il successo della creazione delle colture prevenendo la contaminazione, è importante considerare la loro potenziale nefrotossicità. Sebbene non siano stati osservati effetti negativi degli antibiotici sulla creazione di colture tubuloidi, sono necessarie ulteriori indagini per valutare a fondo i loro effetti. I tubuloidi possono essere sfruttati per studiare e modellare le malattie8. Le ciliopatie (disfunzione patologica delle ciglia) e altre sindromi genetiche che colpiscono il rene potrebbero essere studiate generando linee tubuloidi direttamente dai soggetti affetti o utilizzando colture sane in cui le mutazioni driver specifiche della malattia possono essere introdotte tramite l'editing del genoma CRISPR / Cas920.
Sebbene i tubuloidi siano colture renali multicellulari, mancano di diversi tipi di cellule renali, inclusi podociti e cellule endoteliali8. Inoltre, a differenza di altri modelli organoidi derivati dall'ASC, i tubuloidi hanno un potenziale replicativo limitato in quanto possono essere coltivati per circa 15 passaggi. Questa durata limitata può, tuttavia, essere significativamente estesa dall'aggiunta di Wnt al terreno dicoltura 21. È necessaria un'ulteriore ottimizzazione del protocollo di coltura tubuloide per renderli ancora più rappresentativi del rene, compresi i tipi di cellule più differenziati. Sebbene l'efficienza dell'insediamento di tubuloidi da campioni di tessuto sia molto elevata (>95%), può, in rari casi, fallire. Ci possono essere diverse cause tra cui: 1) scarsa qualità del materiale di partenza(ad esempio,tessuto necrotico come conseguenza del trattamento farmacologico), 2) sovradigestione del campione di tessuto o 3) contaminazione del campione primario.
Per assicurarsi che la qualità dei campioni di tessuto ricevuti sia sufficiente per procedere con il protocollo, è importante mantenere uno stretto contatto con il personale di patologia che esegue la valutazione del tessuto al momento dell'intervento chirurgico. Se è disponibile materiale sufficiente, la sua vitalità deve essere confermata da un esame istologico(ad esempio,colorazione di ematossilina ed eosina). Inoltre, per prevenire la lisi cellulare durante la digestione enzimatica, è importante che la procedura di incubazione non sia più lunga di 1 ora. Infine, per prevenire la contaminazione, antibiotici e agenti antifungini dovrebbero essere aggiunti ai mezzi di lavaggio e di coltura.
L'urina può contenere cellule epiteliali esfoliate che non derivano dal rene22, che possono contaminare le colture tubuloidi. Questi includono, ad esempio, le cellule di uterio che sono, a differenza delle cellule tubulari renali, positive per la proteina tumorale P63 e negative per PAX88. Si raccomanda pertanto di testare le colture per la positività a PAX8 per confermare la purezza delle linee tubuloidi renali stabilite prima di procedere con esperimenti di follow-up (Figura 4B).
L'urina rappresenta un ambiente ostile per le cellule a causa dell'alta pressione osmotica e del basso pH. È quindi fondamentale per il successo del protocollo che i campioni vengano elaborati il prima possibile al momento della raccolta delle urine. Pertanto, l'urina raccolta deve essere diluita e ampiamente lavata con soluzione tamponata il prima possibile per garantire la presenza di cellule vitali al momento della semina. Il tasso di successo dello stabilimento tubuloide diminuirà significativamente se l'urina viene conservata per diverse ore prima dell'elaborazione. Infine, sebbene sterile, l'urina ha un alto rischio di contaminazione associato al processo di raccolta. È quindi importante integrare il mezzo di lavaggio e di crescita con antibiotici e agenti antifungini. Tenendo conto di tutto quanto sopra, è possibile ottenere un tasso di successo di circa il 50%.

I reni svolgono la funzione di controllare sistemicamente l'equilibrio dei fluidi corporei. La compromissione della loro funzione fisiologica può essere causata da diversi fattori, tra cui diabete, ipertensione e tossicità indotta da farmaci1. Per una migliore comprensione della normale fisiologia renale e dello sviluppo di malattie renali, l'uso di modelli preclinici rappresentativi è cruciale. Negli ultimi anni, sono stati generati diversi modelli renali in vitro basati sulla cosiddetta tecnologia organoide2. Gli organoidi sono strutture tridimensionali e multicellulari che assomigliano alla morfologia e alla fisiologia del tessuto (normale o malato) da cui provengono. Possono essere generati da cellule staminali pluripotenti (PSC) o adulte (ASC), ognuna con le proprie caratteristiche e applicazioni.
Gli organoidi renali derivati dalla PSC imitano la nefrogenesi3,4,5. Possono anche essere stabiliti da cellule impegnate derivate dal paziente mediante dedifferenziazione forzata (pluripotenza indotta o iPSC). Le iPSC possono successivamente essere differenziate nei diversi tipi di cellule del nefrone, l'unità funzionale del rene, mediante esposizione tempestiva a specifici cocktail di fattori di crescita. Durante la creazione di un mini-organo piuttosto completo in un piatto, la loro istituzione rimane dispendiosa in termini di tempo e, a causa del protocollo di riprogrammazione, le iPSC possono essere suscettibili di instabilità genetica indesiderata6. Inoltre, gli organoidi iPSC non sono in grado di maturare completamente in cellule renali adulte, rivelando un profilo del trascrittoma che assomiglia al rene fetale in una fase iniziale di sviluppo7.
I tubuloidi renali umani derivati dall'ASC hanno dimostrato di ricapitolare il rinnovamento dell'epitelio renale adulto. Rappresentano principalmente il tubulo prossimale, l'ansa di Henle, i tubuli distali e il dotto di raccolta, come confermato dall'espressione di diverse proteine trasportatere8,9,10. Il protocollo di coltura tubuloide consente la rapida espansione del tessuto renale derivato dal paziente, pur mantenendo un genoma stabile. Le applicazioni di ricerca includono lo studio della normale fisiologia renale, nefrotossicità, test antidroga e modelli di malattia8,10,11,12. Una potenziale limitazione della creazione di colture organoidi derivate dal paziente, compresi i tubuloidi, è la disponibilità di tessuto fresco. Tuttavia, diversi rapporti hanno dimostrato che l'urina può servire come fonte per le cellule epiteliali renali, fornendo così una strategia molto più semplice e meno invasiva per ottenere materiale paziente per colture tubuloidi8,13,14. In effetti, è stato recentemente dimostrato che i tubuloidi possono essere coltivati dall'urina8. Questo articolo descrive la creazione e il mantenimento di colture tubuloidi dal tessuto renale e dalle urine.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939/10</td>
			<td>Stock of 5 mM, final concentration of 5 &#181;M, activin receptor-like kinase 5 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antiPAX8 antibody</td>
			<td>LSBio</td>
			<td>LS-B13466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Stock of 50x, final concentration of&#160; 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BME</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;C9407</td>
			<td>Stock of 10 mg/mL, final concentration of 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Stock of 0.5 mg/mL, final concentration of 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Stock of 0.1 mg/mL, final concentration of 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX - L-alanine/L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Stock of 100x, final concentration of 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630106</td>
			<td>Stock of 1 M, final concentration of 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell tissue culture plates 12 wells</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell tissue culture plates 24 wells</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell tissue culture plates 6 wells</td>
			<td>CELLSTAR</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock of 500 mM, final concentration of 1.25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140163</td>
			<td>Stock of 10.000 U/mL, final concentration of&#160; 100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin - broad-range antibiotics</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Stock of 50 mg/mL, final concentration of 0.1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cells lysis buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814389001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RhoKinase inhibitor Y-27632</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>M1817</td>
			<td>Stock of 100 mM, final concentration of 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Produced in house with the use of stable cell lines generated by Calvin Kuo lab. Final concentration is 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLe Express/ trypsin replacement agent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human kidney tubuloids from tissue and urine

Gli organoidi epiteliali renali umani derivati dalle cellule staminali adulte (ASC), o tubuloidi, possono essere stabiliti da epitelio renale sano e malato con alta efficienza. I normali tubuloidi renali ricapitolano molti aspetti del loro tessuto di origine. Rappresentano segmenti di nefroni distinti - in particolare del tubulo prossimale, dell'ansa di Henle, dei tubuli distali e del dotto di raccolta - e possono essere utilizzati per studiare la normale fisiologia renale. Inoltre, la tecnologia tubuloide facilita la modellazione delle malattie, ad esempioper le malattie infettive e per il cancro. L'ottenimento di cellule epiteliali renali per la generazione di tubuloidi dipende, tuttavia, dal materiale chirurgico avanzato (come le nefrectomie parziali) o dalle biopsie con ago. La capacità di far crescere tubuloidi dalle urine fornirebbe una fonte alternativa e meno invasiva di cellule epiteliali renali sane. È stato precedentemente dimostrato che le colture tubuloidi possono essere generate con successo solo da pochi millilitri di urina appena raccolta. Questo articolo descrive i protocolli per generare e propagare colture tubuloidi renali umane derivate da ASC da campioni di tessuto e urina.

Per il tessuto renale, le strutture tubuloidi compaiono in genere entro 7 giorni dall'insediamento (Figura 1D). La mancanza di crescita apparente entro i primi 7 giorni indica un esito negativo del protocollo. Generalmente, le colture tubuloidi devono essere superate entro 1-2 settimane dalla prima placcatura. Per l'urina, la crescita cellulare diventa evidente circa 14-21 giorni dopo la costituzione, con la comparsa di strutture tubuloidi compatte e / o cellule aderenti sul fondo della piastra (Figura 2B). L'istituzione della cultura molto probabilmente ha fallito se nessuna crescita può essere rilevata con un microscopio a campo luminoso entro 4 settimane dalla placcatura. Per le colture derivate dalle urine, il primo passaggio avviene generalmente tra le 3 e le 4 settimane. Mentre nei primi passaggi le colture tubuloidi renali sono costituite principalmente da strutture compatte, la presenza di tubuloidi epiteliali cistici aumenta con l'aumento del numero di passaggi (Figura 1D e Figura 2B). Il successo della generazione di colture tubuloidi renali umane può essere valutato eseguendo la colorazione immunoistochimica per i marcatori espressi nell'epitelio renale tubulare, come la proteina 8 del gene 8 accoppiato (PAX8) (Figura 4A,B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62404/62404fig01.jpg"> Figura 1: Colture tubuloidi renali derivate da tessuti. (A) Panoramica della procedura per tritare il tessuto renale. Il tessuto viene tritato a una dimensione di ~ 1 mm3 usando bisturi. (B) Esempio di corretta digestione enzimatica del tessuto renale sano. Il tessuto viene mostrato prima (a sinistra) e dopo (a destra) 45 minuti di digestione enzimatica con collagenasi. Pochi pezzi di tessuto sono ancora visibili nella parte inferiore del tubo e la soluzione dovrebbe diventare torbia, indicando la presenza di cellule nella sospensione. (C) Immagine rappresentativa delle piastre di coltura cellulare dopo placcatura di goccioline di BME contenenti il tessuto renale trasformato. Dopo aver placcato le goccioline, le piastre di coltura vengono capovolte (a sinistra) e poste nell'incubatrice a 37 °C. Dopo 15-20 minuti, il terreno di coltura prebellico viene aggiunto al pozzo (a destra). (D) Immagini rappresentative in campo luminoso di colture tubuloidi derivate da tessuti. Le prime strutture tubuloidi diventano visibili 2-3 giorni dopo la prima semina. Con l'aumentare del numero di passaggi, i tubuloidi in genere cambiano morfologia in un fenotipo più cistico. Barre di scala = 300 μm. Abbreviazioni: BME = estratto di membrana basale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62404/62404fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62404/62404fig02.jpg"> Figura 2: Colture di tubuloidi renali di origine urinaria. (A) Panoramica dell'elaborazione dei campioni di urina. Non appena possibile dopo la raccolta ( I ),icampioni di urina vengono suddivisi in tubi da 50 ml e diluiti in mezzo di lavaggio (II). Dopo una seconda fase di lavaggio (III), il contenuto dei tubi viene raggruppato e una terza e ultima fase di lavaggio (IV) viene eseguita prima della placcatura. (B) Immagini rappresentative in campo luminoso di colture tubuloidi derivate dalle urine. Le prime strutture tubuloidi e le cellule aderenti dovrebbero essere visibili entro 21 giorni dalla prima placcatura. Barre di scala = 300 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62404/62404fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62404/62404fig03.jpg"> Figura 3: Passaggio di colture tubuloidi renali. (A) Immagine rappresentativa di colture tubuloidi renali dopo digestione enzimatica. Dopo aver completato la digestione, non dovrebbe rimanere più del 10% delle strutture tubuloidi intatte. Barra di scala = 300μm. (B) Immagine rappresentativa delle colture tubuloidi renali dopo placcatura. L'ispezione delle colture conferma che la maggior parte dei tubuloidi sono stati interrotti. Barra della scala = 300 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62404/62404fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62404/62404fig04.jpg"> Figura 4: Caratterizzazione istologica di colture tubuloidi. (A) Colorazione H&E di tessuto renale sano e tubuloidi. Barre di scala = 100 μm. (B) Immunoistochimica di PAX8 nel tessuto renale normale, tubuloidi, tessuto MRTK e organoidi MRTK. La positività PAX8 delle strutture organoidi conferma la loro origine epiteliale renale. Il tessuto renale sano mostra sia strutture positive (tubuli) che negative (glomeruli). Il tessuto MRTK e gli organoidi sono stati inclusi come controllo negativo. Barre di scala = 100 μm. Abbreviazioni: H&E = ematossilina ed eosina; PAX8 = gene scatolato accoppiato 8; MRTK = tumore rabdoide maligno del rene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62404/62404fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Generation of Human Kidney Tubuloids from Tissue and Urine

Le colture tubuloidi renali umane rappresentano un prezioso modello in vitro per studiare la fisiologia e la malattia renale. I tubuloidi possono essere stabiliti dal tessuto renale (sano e malato) e dall'urina, quest'ultima rappresenta una fonte facilmente ottenibile e meno invasiva di materiale di ricerca.

Generazione di tubuloidi renali umani da tessuti e urine

Adult stem cell (ASC)-derived human kidney epithelial organoids, or tubuloids, can be established from healthy and diseased kidney epithelium with high ...

Le colture tubuloidi renali possono essere stabilite dal tessuto renale sano e dall'urina consentendo la generazione di modelli rappresentativi per studiare la malattia e la fisiologia renale. Questo protocollo consente la generazione di tubuloidi renali sani da tessuti e urine, quest'ultimo è un modo non invasivo e a misura di paziente per ottenere materiale per la generazione di colture. Le colture tubuloidi possono essere utilizzate per studiare la fisiologia renale e per la modellazione delle malattie, come le malattie renali infettive, maligne ed ereditarie.Per generare tubuloidi renali umani dal tessuto, posizionare il campione di tessuto renale in un millilitro di DMEM avanzato più più più mezzo in una capsula di Petri di 10 centimetri e utilizzare bisturi per tritare il tessuto in pezzi di circa un millimetro cubo. Utilizzare pinci e bisturi per trasferire i pezzi di tessuto in un tubo da 15 millilitri e lavare il piatto con cinque millilitri di mezzo fresco. Utilizzare una pipetta sterile da 10 millilitro per trasferire il mezzo al tubo.Sedimentare i pezzi di tessuto mediante centrifugazione e risusciere il pellet in tre o quattro millilitri di soluzione di collagenasi. Incubare i tessuti su uno shaker orizzontale a 37 gradi Celsius e 250 giri al minuto per 45-60 minuti con un vigoroso scuotimento ogni 15 minuti. Quando la sospensione è omogenea e la maggior parte dei pezzi di tessuto sono stati digeriti, riempire il tubo con il mezzo e mescolare da cinque a 10 volte per inversione.Centrifugare la sospensione. Se il pellet è rosso, aggiungere un millilitro di tampone di lisi dei globuli rossi al tubo per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, lavare il tubo con mezzo fresco.Se i pezzi di tessuto sono ancora visibili, risusciendi il pellet con cinque millilitri di mezzo fresco e filtra la sospensione attraverso un filtro cellulare da 100 micron in un tubo da 50 millilitri. Trasferire la sospensione filtrata in un nuovo tubo da 15 millilitro per la centrifugazione e utilizzare una pipetta P1000 impostata su un volume noto per misurare il volume del pellet cellulare. Risusediare con cura il pellet senza creare bolle d'aria e incubare le cellule per un minuto sul ghiaccio.Alla fine dell'incubazione, risusedere il pellet in un volume dal 70 al 75% di estratto di membrana basale e in una piastra di 15 goccioline di microlitro della sospensione risultante in una piastra di coltura cellulare multi-pozzo riscaldata a 37 gradi. Quando tutte le goccioline sono state placcate, incubare la piastra a testa in giù a 37 gradi Celsius per 15-20 minuti, quindi aggiungere il volume appropriato di 37 gradi Celsius di terreno di coltura riscaldato e ispezionare le colture al microscopio a campo luminoso. Per generare tubuloidi renali umani dall'urina, dividere equamente il campione di urina tra 50 tubi da 50 millilitri e lavare i campioni due volte con 10-20 millilitri di mezzo di lavaggio fresco per lavaggio.Dopo il secondo lavaggio, risospenare i pellet nei loro supernatanti residui e mettere insieme i campioni in un unico tubo da 15 millilitri per una terza centrifugazione. Misurare il volume del pellet della cella come dimostrato e risusediare attentamente il pellet senza creare bolle d'aria. Dopo un minuto di incubazione nel ghiaccio, risuscidere il pellet in un volume dal 70 al 75% di estratto di membrana basale e placcare 15 goccioline di microlitro della sospensione risultante in piastre di coltura cellulare multi-pozzo riscaldate a 37 gradi Celsius come dimostrato, quindi incubare le goccioline capovolte per 15-20 minuti prima di aggiungere terreno fresco e visualizzare le colture al microscopio ottico.Dopo una o due settimane di entrambi i tipi di coltura, utilizzare una pipetta P1000 per interrompere le goccioline tubuloidi in ciascun pozzetto usando la punta per raschiare il fondo dei pozzetti per raccogliere le cellule attaccate. Tirare il contenuto del pozzo in un singolo tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di DMEM avanzato più più più mezzo e raccogliere i tubuloidi per centrifugazione. In base alle dimensioni del pellet, aggiungere l'agente sostitutivo della tripsina integrato con 10 micromolari Y27632 per un'incubazione di cinque minuti a 37 gradi Celsius.Alla fine dell'incubazione, utilizzare una punta di pipetta da 1.000 microlitteri con una punta di pipetta da 10 microlitter posta sopra la punta per pipettare la sospensione tubuloide da 20 a 30 volte. Controllare al microscopio per vedere se ci sono ancora tubuloidi intatti all'interno del tubo. Sono presenti meno del 10% di tubuloidi intatti, riempire il tubo con DMEM plus plus plus fresco avanzato e raccogliere i tubuloidi mediante centrifugazione per consentire di misurare il volume del pellet come dimostrato.Spese di sospensione del pellet in un volume dal 70 al 75% di estratto di membrana basale e di goccioline di microlitro da 15 microlitri in una piastra di coltura cellulare multi-pozzo riscaldata a 37 gradi Celsius. Dopo un'incubazione capovolta di 15-20 minuti a 37 gradi Celsius, aggiungere un terreno di coltura preriscaldato alle goccioline e ispezionare la coltura al microscopio ottico. I tubuloidi generati da campioni di tessuto renale compaiono in genere entro sette giorni dall'istituzione della coltura e devono essere passaggi entro una o due settimane dalla placcatura.Nelle colture di urina, le strutture tubuloidi compatte e le cellule aderenti compaiono circa 14-21 giorni dopo la placcatura e il primo passaggio si verifica generalmente tra tre e quattro settimane. La presenza di tubuloidi epiteliali cistici aumenta ad ogni passaggio. La generazione di successo di colture tubuloidi renali umane può essere valutata mediante colorazione immunoistochimica per marcatori espressi nell'epitelio renale tubulare, come la proteina 8 del gene box accoppiato.Una corretta tempistica della digestione enzimatica del materiale tissutale e una rapida elaborazione dei campioni di urina sono passaggi cruciali per il buon esito di questi protocolli. L'elevata efficienza della creazione di colture tubuloidi renali può aprire la strada a test specifici per il paziente della nefrotossicità indotta da farmaci, un effetto collaterale comune di molti chemioterapici.

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