Name: immunofluorescent staining for visualization of heterochromatin associated proteins in drosophila salivary glands
Uploaded: 2021-08-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands at JoVE.com

نشكر ماركو أنطونيو روزاليس فيغا وهابيل سيغورا على التقاط بعض الصور الكونفوكوكال، وكارمن مونيوز لإعداد وسائل الإعلام، والدكتور أرتورو بيمنتل، .C أندريس ساراليغوي، والدكتور كريس وود من LMNA للحصول على المشورة بشأن استخدام المجاهر.

1. زراعة يرقات النجوم الثالثة
<ol><li>إعداد 1 لتر من وسائل الإعلام القياسية بإضافة 100 غرام من الخميرة، 100 غرام من السكر قصب كامل غير المكرر، 16 غرام من أجار، 10 مل من حمض البروبيونيك و 14 غرام من الجيلاتين. حل جميع المكونات باستثناء الخميرة في 800 مل من ماء الصنبور ومن ثم حل الخميرة. الأوتوكلاف على ال...

<ol>
	<li>Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emil+Heitz,+a+true+epigenetics+pioneer.">Emil Heitz, a true epigenetics pioneer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572 (2019).</li><li>Irick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+function+for+heterochromatin.">A new function for heterochromatin.</a> Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).</li><li>Kasinathan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovation+of+heterochromatin+functions+drives+rapid+evolution+of+essential+ZAD-ZNF+genes+in+Drosophila.">Innovation of heterochromatin functions drives rapid evolution of essential ZAD-ZNF genes in Drosophila.</a> Elife. , 1-31 (2020).</li><li>Lifschytz, E., Hareven, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+markers:+Arrangement+of+obligatory+heterochromatin,+histone+genes+and+multisite+gene+families+in+the+interphase+nucleus+of+D.+melanogaster.">Heterochromatin markers: Arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster.</a> Chromosoma. 86 (4), 443-455 (1982).</li><li>Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1a:+A+structural+chromosomal+protein+regulating+transcription.">HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription.</a> Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).</li><li>Lee, Y. C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericentromeric+heterochromatin+is+hierarchically+organized+and+spatially+contacts+H3K9me2+islands+in+euchromatin.">Pericentromeric heterochromatin is hierarchically organized and spatially contacts H3K9me2 islands in euchromatin.</a> PLoS Genetics. 16 (3), 1-27 (2020).</li><li>Koryakov, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUUR+protein+is+involved+in+binding+of+SU+(VAR)3-9+and+methylation+of+H3K9+and+H3K27+in+chromosomes+of+Drosophila+melanogaster.">The SUUR protein is involved in binding of SU (VAR)3-9 and methylation of H3K9 and H3K27 in chromosomes of Drosophila melanogaster.</a> Chromosome Research. 19 (2), 235-249 (2011).</li><li>Cao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Histone+H3+Lysine+27+Methylation+in+Polycomb-Group+Silencing.">Role of Histone H3 Lysine 27 Methylation in Polycomb-Group Silencing.</a> Science. 298 (5595), 1039 (2002).</li><li>Hines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domains+of+heterochromatin+protein+1+required+for+Drosophila+melanogaster+heterochromatin+spreading.">Domains of heterochromatin protein 1 required for Drosophila melanogaster heterochromatin spreading.</a> Genetics. 182 (4), 967-977 (2009).</li><li>Elgin, S. C. R., Reuter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position-effect+variegation,+heterochromatin+formation,+and+gene+silencing+in+Drosophila.">Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (8), 1-26 (2013).</li><li>Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1a:+A+structural+chromosomal+protein+regulating+transcription.">HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription.</a> Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).</li><li>Meyer-Nava, S., Torres, A., Zurita, M., Valadez-graham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+effects+of+dADD1+misexpression+in+chromatin+organization+and+transcription.">Molecular effects of dADD1 misexpression in chromatin organization and transcription.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 2, 1-17 (2020).</li><li>Tennessen, J. M., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+growth+and+maturation+-+Insights+from+drosophila.">Coordinating growth and maturation - Insights from drosophila.</a> Current Biology. 21 (18), 750-757 (2011).</li><li>Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+drosophila+polytene+chromosome+squashes+for+antibody+labeling.">Preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), 1-4 (2010).</li><li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66 (1967), 57-80 (1981).</li><li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+droplet+formation+by+HP1&#945;+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin.">Liquid droplet formation by HP1&#945; suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).</li><li>Larson, A. G., Narlikar, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Phase+Separation+in+Heterochromatin+Formation,+Function,+and+Regulation.">The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation.</a> Biochemistry. 57 (17), 2540-2548 (2018).</li><li>Keenen, M. M., Larson, A. G., Narlikar, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+Quantitation+of+Phase-Separated+Droplet+Formation+by+Human+HP1&#945;.">Visualization and Quantitation of Phase-Separated Droplet Formation by Human HP1&#945;.</a> Methods in Enzymology. , (2018).</li><li>Lu, B. Y., Emtage, P. C., Duyf, B. J., Hilliker, a. J., Eissenberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+protein+1+is+required+for+the+normal+expression+of+two+heterochromatin+genes+in+Drosophila.">Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila.</a> Genetics. 155 (2), 699-708 (2000).</li><li>Marsano, R. M., Giordano, E., Messina, G., Dimitri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Portrait+of+Constitutive+Heterochromatin:+Lessons+from+Drosophila+melanogaster.">A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster.</a> Trends in Genetics. , (2019).</li><li>Strom, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+drives+heterochromatin+domain+formation.">Phase separation drives heterochromatin domain formation.</a> Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).</li><li>Sanulli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1+reshapes+nucleosome+core+to+promote+phase+separation+of+heterochromatin.">HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin.</a> Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).</li><li>Dialynas, G., Delabaere, L., Chiolo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+and+Unc45+maintain+heterochromatin+stability+in+Drosophila+polytene+chromosomes.">Arp2/3 and Unc45 maintain heterochromatin stability in Drosophila polytene chromosomes.</a> Experimental Biology and Medicine. 244 (15), 1362-1371 (2019).</li><li>Kolesnikova, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+decondensation+of+heterochromatin+in+drosophila+melanogaster+polytene+chromosomes+under+condition+of+ectopic+expression+of+the+supressor+of+underreplication+gene.">Induced decondensation of heterochromatin in drosophila melanogaster polytene chromosomes under condition of ectopic expression of the supressor of underreplication gene.</a> Fly. 5 (3), 181-190 (2011).</li><li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122 (8), 2517-2527 (1996).</li><li>Messina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeti,+an+essential+Drosophila+melanogaster+gene,+encodes+a+protein+required+for+chromatin+organization.">Yeti, an essential Drosophila melanogaster gene, encodes a protein required for chromatin organization.</a> Journal of Cell Science. 127 (11), 2577-2588 (2014).</li><li>Aguilar-Fuentes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p8/TTDA+overexpression+enhances+UV-irradiation+resistance+and+suppresses+TFIIH+mutations+in+a+Drosophila+trichothiodystrophy+model.">p8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model.</a> PLOS Genetics. 4 (11), 1-9 (2008).</li><li>Reynaud, E., Lomeli, H., Vazquez, M., Zurita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+Homologue+of+the+Xeroderma+Pigmentosum+D+Gene+Product+Is+Located+in+Euchromatic+Regions+and+Has+a+Dynamic+Response+to+UV+Light-induced+Lesions+in+Polytene+Chromosomes.">The Drosophila melanogaster Homologue of the Xeroderma Pigmentosum D Gene Product Is Located in Euchromatic Regions and Has a Dynamic Response to UV Light-induced Lesions in Polytene Chromosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 10 (4), 1191-1203 (1999).</li><li>Farka&#353;, R., Mechler, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+timing+of+Drosophila+salivary+gland+apoptosis+displays+an+I+(2)gl-dose+response.">The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays an I (2)gl-dose response.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 7 (1), 89-101 (2000).</li><li>Zhang, P., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+salivary+gland+chromocenter+contains+highly+polytenized+subdomains+of+mitotic+heterochromatin.">The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin.</a> Genetics. 139 (2), 659-670 (1995).</li><li>Stormo, B. M., Fox, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyteny:+still+a+giant+player+in+chromosome+research.">Polyteny: still a giant player in chromosome research.</a> Chromosome Research. 25 (3-4), 201-214 (2017).</li></ol>

يمكن للوظيفة الخلوية للكائنات الحية النواة تحديد الهيكل ثلاثي الأبعاد داخل النواة ، والذي تدعمه التفاعلات بين البروتينات المختلفة مع الكروماتين والجزيئات المختلفة بما في ذلك الحمض النووي الريبي. في السنوات الثلاث الماضية، والمكثفات البيولوجية التي لها أهمية، بما في ذلك هيتيركروماتين،...

منذ الدراسات المبكرة لإميل هيتز1، يعتبر هيتيركروماتين منظما مهما للعمليات الخلوية مثل التعبير الجيني ، والفصل الميوتي والميتوتيك للكروموسومات ، والحفاظ على استقرار الجينوم2و3و4.
وينقسم الهتيروماتين أساسا إلى نوعين: هيتيركروماتين التأسيسية التي تحدد بشكل مميز تسلسل المتكررة، والعناصر القابلة للانتقال التي توجد في مواقع كروموسوم محددة مثل التيلوميرات والقنطورات. هذا النوع من heterochromatin هو تعريف أساسا اللاجينية من قبل علامات الهستون محددة مثل دي أو ثلاثي ميثيل ليسين 9 من الهستون H3 (H3K9me3) وربط بروتين هيتيروكروماتين 1a (HP1a)5,6. من ناحية أخرى، لغات heterochromatin الكلية من خلال ذراعي الكروموسوم ويتكون أساسا من الجينات صامتة تنمويا7،8. وقد كشف عن التئاس المناعة من كتل heterochromatin في خلايا ميتافيزي، أو مراقبة المجاميع heterochromatin في الخلايا بين المراحل، الكثير من الضوء في فهم تشكيل ووظيفة المناطق غير لوني9.
وقد سمح استخدام Drosophila كنظام نموذجي لتطوير الأدوات الأساسية لدراسة الهتيروماتين دون استخدام المجهر الإلكتروني10. منذ وصف تأثير الموقف المتنوع واكتشاف البروتينات المرتبطة بالهيتوكروماتين ، مثل HP1a ، وتعديلات ما بعد الهستون بعد الترجمية ، طورت العديد من المجموعات العديد من التقنيات الكيميائية المناعية التي تسمح بتصور هذه المناطق غير اللونية10،11.
وتستند هذه التقنيات على استخدام أجسام مضادة محددة تتعرف على البروتينات المرتبطة بالهتيروماتين أو علامات الهستون. لكل نوع الخلية والأجسام المضادة، يجب تحديد شروط التثبيت والتهيئة تجريبيا. أيضا، قد تختلف الظروف إذا تم استخدام عمليات ميكانيكية إضافية مثل تقنيات السحق. في هذا البروتوكول، ونحن نصف استخدام الغدد اللعابية Drosophila لدراسة بؤر غير لونية. الغدد اللعابية لديها خلايا متعددة الأضلاع تحتوي على أكثر من 1000 نسخة من الجينوم ، مما يوفر رؤية مكبرة لمعظم ميزات الكروماتين ، باستثناء الحمض النووي للأقمار الصناعية وبعض المناطق غير اللونية التي تخضع للتكفير. ومع ذلك ، يتم تصور مناطق heterochromatin بسهولة في مستحضرات كروموسوم البوليتين ، ولكن تقنيات السحق قد تعطل في بعض الأحيان المجمعات المميزة المرتبطة بالكروماتين أو بنية الكروماتين. لذلك ، يمكن أن يتجاوز تحديد موقع المناعة للبروتينات في أنسجة الغدة اللعابية الكاملة هذه الآثار غير المرغوب فيها. لقد استخدمنا هذا البروتوكول للكشف عن العديد من البروتينات المقيدة بالكروماتين ، وأثبتنا أن هذا البروتوكول جنبا إلى جنب مع مخزونات Drosophila المتحولة يمكن استخدامه لدراسة اضطراب الهتيروماتين12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen MCT-150-C</td>
			<td>11351904</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF1 Citifluor</td>
			<td>Ted pella</td>
			<td>19470</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735078001</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free 
			protease inhibitors</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5892953001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS285022-200EA</td>
			<td>22x22, brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>d9779</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Gold seal</td>
			<td>3011</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>Baker</td>
			<td>0084-01</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K9me3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>8889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP1a</td>
			<td>Hybridoma Bank</td>
			<td>C1A9</td>
			<td>Product Form&#160;Concentrate 0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Baker</td>
			<td>3040-01</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Baker</td>
			<td>9070-03</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-687-12Q</td>
			<td>&#160;Labquake Tube Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Mixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13527550</td>
			<td>SmartBlock 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>648311</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>100 mL, brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610710</td>
			<td>25 mL, brand not critical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescent staining for visualization of heterochromatin associated proteins in drosophila salivary glands

يمكن أن يكون تصور مجاميع الهتيروماتين عن طريق التصبغ المناعي أمرا صعبا. يتم الحفاظ على العديد من مكونات الثدييات من الكروماتين في Drosophila melanogaster. لذلك، وهو نموذج ممتاز لدراسة تشكيل heterochromatin والصيانة. الخلايا المتعددة، مثل تلك الموجودة في الغدد اللعابية من يرقات نجمة النستار الثالثة D. melanogaster، توفر أداة ممتازة لمراقبة الكروماتين تضخيم ما يقرب من ألف مرة، وسمحت للباحثين لدراسة التغيرات في توزيع التركروماتين في النواة. على الرغم من أن مراقبة مكونات هيتيركروماتين يمكن أن تتم مباشرة في مستحضرات كروموسوم البوليتين ، يمكن تغيير توطين بعض البروتينات من خلال شدة العلاج. لذلك ، فإن التصور المباشر للتركروماتين في الخلايا يكمل هذا النوع من الدراسة. في هذا البروتوكول، نقوم بوصف تقنيات التصبغ المناعي المستخدمة لهذا النسيج، واستخدام الأجسام المضادة الفلورية الثانوية، والمجهر البؤري لمراقبة هذه المجاميع الهتيروماتين بمزيد من الدقة والتفاصيل.

تظهر النتائج التمثيلية ل HP1a المناعية في الغدد اللعابية Drosophila في الشكل 1. والنتيجة الإيجابية هي ملاحظة نقطة محورية واحدة(الشكل 1a)(تجميع أو مكثفات غير لونية). والنتيجة السلبية هي عدم وجود إشارة أو إشارة مشتتة. في بعض الأحيان يمكن ملاحظة إشارة مزدوجة ، أي ب...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands at JoVE.com

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

يهدف هذا البروتوكول إلى تصور مجاميع الهتيروماتين في خلايا البوليتين Drosophila.

تلطيخ immunofluorescent لتصور البروتينات المرتبطة Heterochromatin في الغدد اللعابية Drosophila

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...

والهدف من هذا البروتوكول هو تصور المجاميع heterochromatin في خلايا Drosophila. لتحقيق ذلك ، نستخدم خلايا البوليتين الموجودة في الغدد اللعابية ليرقات النجمة الثالثة يتم تضخيم جينوم هذه الخلايا ما يقرب من ألف مرة ، وتحافظ الكروموسومات على ميزات خلايا الواجهة. لديهم التيلوميرات محددة جيدا، والجسور تسمى chromocenter التي تجمع جميع centromeres، وانها أساسا غير لوني.باستخدام أنسجة يرقات النجوم الثالثة ، اسمح لنا أيضا بتقييم التغيير في المجاميع غير اللونية في خلفية المسوخ الجينية المختلفة. لتحسين ثقافة يرقات النجوم الثالثة ، ستحتاج أولا إلى جمع البالغين من العمر 5 إلى 10 أيام ، ووضع حوالي 50 في زجاجة عنق واسعة من الوسائط القياسية. 25 ذكر و 25 أنثى.ضع الزجاجة في حاضنة درجة حرارة خاضعة للرقابة عند 25 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. بعد انتهاء فترة الحضانة، قم بإزالة البالغين ونقلهم إلى زجاجة جديدة لتكرار الإجراء. دع الأجنة تنمو عند 18 درجة مئوية لمدة 22 ساعة.لجمع اليرقات ، تأكد من اختيار اليرقات الهائمة ، والتي ليس لديها كروية علنية. تشريح 15 زوجا من الغدد اللعابية، أو بقدر ما تستطيع في فترة 30 دقيقة في برنامج تلفزيوني الباردة مع مثبطات الاحتجاج تحت المجهر. نقل الغدد اللعابية إلى أنبوب آخر مع الجليد البارد PBS.غسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني الباردة بالإضافة إلى مثبطات الاحتجاجات. تذكر، انتظر دائما حتى يصل النسيج إلى أسفل الأنبوب. بعد إزالة برنامج تلفزيوني من الخطوة الأخيرة، إضافة مباشرة 0.5 ملليلتر من واحد X مجموعة تثبيت اللثة العازلة و 50٪ الميثانول بالإضافة إلى 2٪ الفورمالديهايد.احتضان لمدة ساعتين في درجة مئوية أربع مع تناوب معتدل. نفذ غسيل دوران لمدة خمس دقائق مع مخزن Tris-Triton المؤقت ، مع إضافة ملليلتر واحد. انتظر دائما حتى يصل النسيج إلى أسفل الأنبوب.ملاحظة: انتظر حتى يصل النسيج إلى أسفل الأنبوب. احتضان الغدد اللعابية مع تريس تريتون، نفس أعلاه، بالإضافة إلى 1٪ من بيتا ميركابتوثانول لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية مع اهتزاز خفيف. اغسل مع مخزن BO3 العازل، واحتضن مع BO3 بالإضافة إلى 10 ملليمولار DTT في 37 درجة مئوية مع اهتزاز خفيف لمدة 15 دقيقة.في نهاية فترة الحضانة، قم بإجراء غسلة مع ملليلتر واحد من العازلة BO3 وحدها. احتضان الغدد اللعابية في ملليلتر واحد من العازلة B لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع التناوب. إزالة كافة المخزن المؤقت B وإضافة المخزن المؤقت A زائد الأجسام المضادة ذات الفائدة.في هذه الحالة، نستخدم HP واحد، A C 1 8 9 من بنك إيريديوم. 1 في 3، 000 أكثر من ليلة في أربع درجات مع التناوب. عند هذه النقطة من المهم أن الهز لا يثير فقاعات، والتي قد تضر الأجسام المضادة.إعطاء علاج من قبل 15 دقيقة يغسل مع العازلة B، تحت اثارة في درجة حرارة الغرفة باستخدام ملليمتر واحد في كل مرة. يتم نقل الغدد إلى العازلة B جنبا إلى جنب مع الزوجين المضادات الحيوية الثانوية إلى الكلمة الرجوع لمدة ساعتين، تحت التناوب في أربع درجات. في هذه الخطوة، من المهم تغطية الأنبوب بورق الألومنيوم لحماية الجسم المضاد الثانوي من الضوء.قم بإجراء غسالات 2x15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، في حين أن الدوران مع ملليلتر واحد من B.Incubate العازلة مع علامة الحمض النووي مثل Sydox أو OH ، ويذوب في ملليلتر واحد من العازلة B لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الدوران. قم بإجراء غسل واحد مع العازلة B ومرة واحدة مع PBS، كل غسل يدوم 10 دقائق، في حين تدور في درجة حرارة الغرفة. وأخيرا، جبل الغدد اللعابية على الشريحة، مما يجعل بركة مع زلة غطاء.وضع الغدد اللعابية في منتصف حمام السباحة وتغطي مع Sidiflor. لتجنب تشوه الفقاعة ، وتوسيع السائل اللزج في كل مكان. ثم ختم جميع الشرائح مع طلاء الأظافر واضحة.مراقبة تحت المجهر مضان أو confocal. إذا كانت العينة لن يتم ملاحظتها في نفس اليوم ، فقم بتخزينها من الضوء عند أربع درجات. تظهر النتائج التمثيلية لداء أحادي الكبد 1 في الغدد اللعابية Drosophila في الشكل الأول.والنتيجة الإيجابية هي ملاحظة نقطة محورية واحدة كما هو الحال في A، أو تجميع لوني أثيري أو مكثفات. والنتيجة السلبية هي عدم وجود إشارة أو إشارة مشتتة. في بعض الأحيان ، يمكن ملاحظة إشارة مزدوجة مثل نقطة مزدوجة في C ، ولكن عادة ما تحدث بكميات أصغر.لتحليل البيانات التي يمكن أن تمثل كرسم بياني شريطي ، مقارنة توزيع HP1 مع خلفيات متحولة مختلفة. على سبيل المثال، في الشكل الثاني، يمكننا أن نرى أن 98٪ من النوى تقدم توزيع نقطة واحدة. و2٪ من بؤرتين في النوع البري.في متحولة، تغيرت النسبة، ووجود اثنين من بؤر زادت إلى 40٪الشكل الثالث يظهر ممثل تريميثيليشن ليسين 9H3 في أحادية. يؤدي إلى الغدد اللعابية Drosophila مراقبة نقطة محورية واحدة في B، انها نتيجة مواتية في المجموع اللوني أو المكثفات، يمكن أن ينظر إلى إشارة مزدوجة أو ثلاثية في C في مناسبة نادرة، ولكن بكميات صغيرة. في نهاية هذا البروتوكول، سوف تكون قادرة على رؤية المكثفات diachromatic من بروتين HP1 على الرغم من القيود المفروضة على الدولة، وسوف يكون النهج الأول جيدة.

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

تشريح الغدد اللعابية والمعي المتوسط ​​من AE. بعوض البعوض

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Staining Proteins in Gels

تلطيخ البروتينات في الهلام

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

مراسل RFP رواية للمساعدة في التصور من القرص في العين تخيلي ذبابة الفاكهة</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAÃƒÅ½Ã¢â‚¬Â41

تنقية م. magneticum سلالة AMB - 1 بروتين المرتبطين Magnetosome MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

تشريح وتلون ذبابة الفاكهة اليرقات المبايض

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

يعيش التصوير من البروتينات التي تحمل علامات GFP في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; البويضات

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

في الموقع تلطيخ إمونوفلورزنت من البلعمة الذاتية في الخلايا الجذعية العضلات

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

تحديد التقسيم غشاء البلازما للبروتينات المرتبطة محيطيا

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

تصور لهيكل ثلاثي الأبعاد من الأنسجة الدهنية البيضاء باستخدام تلطيخ كل جبل

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

التشريح وتلطيخ الدهون القطرة من البويضات في يرقات دروفيا

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...