Name: immunofluorescent staining for visualization of heterochromatin associated proteins in drosophila salivary glands
Uploaded: 2021-08-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands at JoVE.com

We danken Marco Antonio Rosales Vega en Abel Segura voor het maken van enkele confocale beelden, Carmen Muñoz voor mediavoorbereiding en Dr. Arturo Pimentel, M.C. Andrés Saralegui en Dr. Chris Wood van het LMNA voor advies over het gebruik van de microscopen.

1. Derde instar larvencultuur
<ol><li>Bereid 1 liter standaard media door toevoeging van 100 g gist, 100 g ongeraffineerde hele rietsuiker, 16 g agar, 10 ml propionzuur en 14 g gelatine. Los alle ingrediënten behalve de gist op in 800 ml leidingwater en los vervolgens de gist op. Autoclaaf onmiddellijk gedurende 30 minuten.<ol>
<li>Laat de media daarna afkoelen tot 60 °C en voeg propionzuur toe aan een eindconcentratie van 0,01%. Laat de fles staan tot de gelatine gevormd is.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Om de 3o instar la...

<ol>
	<li>Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emil+Heitz,+a+true+epigenetics+pioneer.">Emil Heitz, a true epigenetics pioneer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572 (2019).</li><li>Irick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+function+for+heterochromatin.">A new function for heterochromatin.</a> Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).</li><li>Kasinathan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovation+of+heterochromatin+functions+drives+rapid+evolution+of+essential+ZAD-ZNF+genes+in+Drosophila.">Innovation of heterochromatin functions drives rapid evolution of essential ZAD-ZNF genes in Drosophila.</a> Elife. , 1-31 (2020).</li><li>Lifschytz, E., Hareven, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+markers:+Arrangement+of+obligatory+heterochromatin,+histone+genes+and+multisite+gene+families+in+the+interphase+nucleus+of+D.+melanogaster.">Heterochromatin markers: Arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster.</a> Chromosoma. 86 (4), 443-455 (1982).</li><li>Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1a:+A+structural+chromosomal+protein+regulating+transcription.">HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription.</a> Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).</li><li>Lee, Y. C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericentromeric+heterochromatin+is+hierarchically+organized+and+spatially+contacts+H3K9me2+islands+in+euchromatin.">Pericentromeric heterochromatin is hierarchically organized and spatially contacts H3K9me2 islands in euchromatin.</a> PLoS Genetics. 16 (3), 1-27 (2020).</li><li>Koryakov, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUUR+protein+is+involved+in+binding+of+SU+(VAR)3-9+and+methylation+of+H3K9+and+H3K27+in+chromosomes+of+Drosophila+melanogaster.">The SUUR protein is involved in binding of SU (VAR)3-9 and methylation of H3K9 and H3K27 in chromosomes of Drosophila melanogaster.</a> Chromosome Research. 19 (2), 235-249 (2011).</li><li>Cao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Histone+H3+Lysine+27+Methylation+in+Polycomb-Group+Silencing.">Role of Histone H3 Lysine 27 Methylation in Polycomb-Group Silencing.</a> Science. 298 (5595), 1039 (2002).</li><li>Hines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domains+of+heterochromatin+protein+1+required+for+Drosophila+melanogaster+heterochromatin+spreading.">Domains of heterochromatin protein 1 required for Drosophila melanogaster heterochromatin spreading.</a> Genetics. 182 (4), 967-977 (2009).</li><li>Elgin, S. C. R., Reuter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position-effect+variegation,+heterochromatin+formation,+and+gene+silencing+in+Drosophila.">Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (8), 1-26 (2013).</li><li>Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1a:+A+structural+chromosomal+protein+regulating+transcription.">HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription.</a> Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).</li><li>Meyer-Nava, S., Torres, A., Zurita, M., Valadez-graham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+effects+of+dADD1+misexpression+in+chromatin+organization+and+transcription.">Molecular effects of dADD1 misexpression in chromatin organization and transcription.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 2, 1-17 (2020).</li><li>Tennessen, J. M., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+growth+and+maturation+-+Insights+from+drosophila.">Coordinating growth and maturation - Insights from drosophila.</a> Current Biology. 21 (18), 750-757 (2011).</li><li>Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+drosophila+polytene+chromosome+squashes+for+antibody+labeling.">Preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), 1-4 (2010).</li><li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66 (1967), 57-80 (1981).</li><li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+droplet+formation+by+HP1&#945;+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin.">Liquid droplet formation by HP1&#945; suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).</li><li>Larson, A. G., Narlikar, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Phase+Separation+in+Heterochromatin+Formation,+Function,+and+Regulation.">The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation.</a> Biochemistry. 57 (17), 2540-2548 (2018).</li><li>Keenen, M. M., Larson, A. G., Narlikar, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+Quantitation+of+Phase-Separated+Droplet+Formation+by+Human+HP1&#945;.">Visualization and Quantitation of Phase-Separated Droplet Formation by Human HP1&#945;.</a> Methods in Enzymology. , (2018).</li><li>Lu, B. Y., Emtage, P. C., Duyf, B. J., Hilliker, a. J., Eissenberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+protein+1+is+required+for+the+normal+expression+of+two+heterochromatin+genes+in+Drosophila.">Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila.</a> Genetics. 155 (2), 699-708 (2000).</li><li>Marsano, R. M., Giordano, E., Messina, G., Dimitri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Portrait+of+Constitutive+Heterochromatin:+Lessons+from+Drosophila+melanogaster.">A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster.</a> Trends in Genetics. , (2019).</li><li>Strom, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+drives+heterochromatin+domain+formation.">Phase separation drives heterochromatin domain formation.</a> Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).</li><li>Sanulli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1+reshapes+nucleosome+core+to+promote+phase+separation+of+heterochromatin.">HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin.</a> Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).</li><li>Dialynas, G., Delabaere, L., Chiolo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+and+Unc45+maintain+heterochromatin+stability+in+Drosophila+polytene+chromosomes.">Arp2/3 and Unc45 maintain heterochromatin stability in Drosophila polytene chromosomes.</a> Experimental Biology and Medicine. 244 (15), 1362-1371 (2019).</li><li>Kolesnikova, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+decondensation+of+heterochromatin+in+drosophila+melanogaster+polytene+chromosomes+under+condition+of+ectopic+expression+of+the+supressor+of+underreplication+gene.">Induced decondensation of heterochromatin in drosophila melanogaster polytene chromosomes under condition of ectopic expression of the supressor of underreplication gene.</a> Fly. 5 (3), 181-190 (2011).</li><li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122 (8), 2517-2527 (1996).</li><li>Messina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeti,+an+essential+Drosophila+melanogaster+gene,+encodes+a+protein+required+for+chromatin+organization.">Yeti, an essential Drosophila melanogaster gene, encodes a protein required for chromatin organization.</a> Journal of Cell Science. 127 (11), 2577-2588 (2014).</li><li>Aguilar-Fuentes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p8/TTDA+overexpression+enhances+UV-irradiation+resistance+and+suppresses+TFIIH+mutations+in+a+Drosophila+trichothiodystrophy+model.">p8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model.</a> PLOS Genetics. 4 (11), 1-9 (2008).</li><li>Reynaud, E., Lomeli, H., Vazquez, M., Zurita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+Homologue+of+the+Xeroderma+Pigmentosum+D+Gene+Product+Is+Located+in+Euchromatic+Regions+and+Has+a+Dynamic+Response+to+UV+Light-induced+Lesions+in+Polytene+Chromosomes.">The Drosophila melanogaster Homologue of the Xeroderma Pigmentosum D Gene Product Is Located in Euchromatic Regions and Has a Dynamic Response to UV Light-induced Lesions in Polytene Chromosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 10 (4), 1191-1203 (1999).</li><li>Farka&#353;, R., Mechler, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+timing+of+Drosophila+salivary+gland+apoptosis+displays+an+I+(2)gl-dose+response.">The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays an I (2)gl-dose response.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 7 (1), 89-101 (2000).</li><li>Zhang, P., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+salivary+gland+chromocenter+contains+highly+polytenized+subdomains+of+mitotic+heterochromatin.">The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin.</a> Genetics. 139 (2), 659-670 (1995).</li><li>Stormo, B. M., Fox, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyteny:+still+a+giant+player+in+chromosome+research.">Polyteny: still a giant player in chromosome research.</a> Chromosome Research. 25 (3-4), 201-214 (2017).</li></ol>

De cellulaire functie van eukaryotische organismen kan de 3D-structuur in de kern definiëren, die wordt ondersteund door interacties tussen verschillende eiwitten met chromatine en verschillende moleculen, waaronder RNA. In de afgelopen drie jaar hebben de biologische condensaten die relevant zijn geweest, waaronder heterochromatine, een fundamentele rol gespeeld bij de bepaling van de fasescheiding ter bevordering van de afzonderlijke nucleaire ruimtelijke organisatie van actief en repressief chromatine <sup class="xre...

Sinds de vroege studies van Emil Heitz1wordt heterochromatine beschouwd als een belangrijke regulator van cellulaire processen zoals genexpressie, meiotische en mitotische scheiding van chromosomen en het behoud van genoomstabiliteit2,3,4.
Heterochromatine is voornamelijk onderverdeeld in twee soorten: constitutieve heterochromatine die kenmerkend repetitieve sequenties definieert, en transponeerbare elementen die aanwezig zijn op specifieke chromosoomplaatsen zoals de telomeren en centromeren. Dit type heterochromatine wordt voornamelijk epigenetisch gedefinieerd door specifieke histontekens zoals de di- of trimethylatie van lysine 9 van histon H3 (H3K9me3) en de binding van het Heterochromatine-eiwit 1a (HP1a)5,6. Aan de andere kant lokaliseert facultatieve heterochromatine zich via de armen van het chromosoom en bestaat het voornamelijk uit ontwikkelingsstiltegenen7,8. Immunostaining van heterochromatineblokken in metafasecellen, of de observatie van heterochromatineaggregaten in interfasecellen, heeft veel licht onthuld in het begrip van de vorming en functie van heterochromatische gebieden9.
Het gebruik van Drosophila als modelsysteem heeft de ontwikkeling van essentiële instrumenten mogelijk maken om heterochromatine te bestuderen zonder het gebruik van elektronenmicroscopie10. Sinds de beschrijving van positie-effectvariëtatie en de ontdekking van heterochromatine-geassocieerde eiwitten, zoals HP1a, en histon post-translationele modificaties, hebben veel groepen verschillende immunohistochemische technieken ontwikkeld die visualisatie van deze heterochromatische gebieden10,11mogelijk maken .
Deze technieken zijn gebaseerd op het gebruik van specifieke antilichamen die heterochromatine-geassocieerde eiwitten of histonen herkennen. Voor elk celtype en antilichaam moeten de fixatie- en permeabilisatieomstandigheden empirisch worden bepaald. Ook kunnen de omstandigheden variëren als aanvullende mechanische processen zoals squashtechnieken worden gebruikt. In dit protocol beschrijven we het gebruik van Drosophila speekselklieren om heterochromatische foci te bestuderen. Speekselklieren hebben gepolyteniseerde cellen die meer dan 1.000 kopieën van het genoom bevatten, waardoor een versterkt beeld wordt verkregen van de meeste chromatinekenmerken, met uitzondering van satelliet-DNA en sommige heterochromatische gebieden die worden gerepliceerd. Niettemin worden heterochromatinegebieden gemakkelijk gevisualiseerd in polytene-chromosoompreparaten, maar de squashtechnieken kunnen soms karakteristieke chromatinegebonden complexen of de chromatinearchitectuur verstoren. Daarom kan immunolokalisatie van eiwitten in het hele speekselklierweefsel deze ongewenste effecten overtreffen. We hebben dit protocol gebruikt om verschillende chromatine gebonden eiwitten te detecteren, en we hebben aangetoond dat dit protocol in combinatie met mutante Drosophila-voorraden kan worden gebruikt om heterochromatineverstoring te bestuderen12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen MCT-150-C</td>
			<td>11351904</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF1 Citifluor</td>
			<td>Ted pella</td>
			<td>19470</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735078001</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free 
			protease inhibitors</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5892953001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS285022-200EA</td>
			<td>22x22, brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>d9779</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Gold seal</td>
			<td>3011</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>Baker</td>
			<td>0084-01</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K9me3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>8889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP1a</td>
			<td>Hybridoma Bank</td>
			<td>C1A9</td>
			<td>Product Form&#160;Concentrate 0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Baker</td>
			<td>3040-01</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Baker</td>
			<td>9070-03</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-687-12Q</td>
			<td>&#160;Labquake Tube Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Mixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13527550</td>
			<td>SmartBlock 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>648311</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>100 mL, brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610710</td>
			<td>25 mL, brand not critical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescent staining for visualization of heterochromatin associated proteins in drosophila salivary glands

Visualisatie van heterochromatineaggregaten door immunostaining kan een uitdaging zijn. Veel zoogdiercomponenten van chromatine worden bewaard in Drosophila melanogaster. Daarom is het een uitstekend model om de vorming en het onderhoud van heterochromatine tebestuderen. Gepolyteniseerde cellen, zoals die gevonden in speekselklieren van derde instar D. melanogaster larven, bieden een uitstekend hulpmiddel om de chromatine versterkt bijna duizend keer te observeren en hebben onderzoekers in staat gesteld om veranderingen in de verdeling van heterochromatine in de kern te bestuderen. Hoewel de observatie van heterochromatinecomponenten direct in polytene-chromosoompreparaten kan worden uitgevoerd, kan de lokalisatie van sommige eiwitten worden gewijzigd door de ernst van de behandeling. Daarom is de directe visualisatie van heterochromatine in cellen een aanvulling op dit type studie. In dit protocol beschrijven we de immunostainingtechnieken die voor dit weefsel worden gebruikt, het gebruik van secundaire fluorescerende antilichamen en confocale microscopie om deze heterochromatineaggregaten nauwkeuriger en gedetailleerder te observeren.

Representatieve resultaten van HP1a immunostaining in drosophila speekselklieren zijn weergegeven in figuur 1. Een positief resultaat is het waarnemen van één brandpunt (figuur 1a) (heterochromatisch aggregaat of condensaat). Een negatief resultaat is geen signaal of een verspreid signaal. Soms kan een dubbel signaal worden waargenomen, dat wil zeggen met een dubbel punt(figuur 1c),maar het komt meestal in kleinere hoevee...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands at JoVE.com

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Dit protocol is bedoeld om heterochromatine aggregaten in Drosophila polytene cellen te visualiseren.

Immunofluorescente kleuring voor visualisatie van heterochromatine geassocieerde eiwitten in drosophila speekselklieren

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...

Het doel van dit protocol is om heterochromatine aggregaten in Drosophila cellen te visualiseren. Om dit te bereiken, gebruiken we polytenecellen die worden gevonden in de speekselklieren van derde instar larven Het genoom van deze cellen wordt bijna duizend keer versterkt en de chromosomen behouden de kenmerken van interfacecellen. Ze hebben goed gedefinieerde telomeren en bruggen genaamd chromocenter waarin alle centromeren zich verzamelen, en het is voornamelijk heterochromatisch.Met behulp van het derde instar larvenweefsel, kunnen we ook verandering in de heterochromatische aggregaten in de achtergrond van verschillende genetische mutanten evalueren. Om de derde instar-larvencultuur te optimaliseren, moet je eerst 5 tot 10 dagen oude volwassenen verzamelen en ongeveer 50 in een brede nekfles van een standaardmedium doen. 25 mannen en 25 vrouwen.Plaats de fles gedurende 12 uur in een incubator met gecontroleerde temperatuur op 25 Graden Celsius. Nadat de incubatietijd voorbij is, verwijdert u de volwassenen en zet u ze over in een nieuwe fles om de procedure te herhalen. Laat de embryo's 22 uur lang groeien bij 18 graden Celsius.Voor larvenverzameling, zorg ervoor dat u de zwervende larven kiest, die geen openlijke bolvormige kenmerken hebben. Ontleed 15 paar speekselklieren, of zoveel als je kunt in 30 minuten periode in koude PBS met protestremmers onder de microscoop. Breng de speekselklieren over naar een andere buis met ijskoud PBS.Was één keer met koude PBS plus protestremmers. Vergeet niet, wacht altijd tot het weefsel de bodem van de buis bereikt. Nadat u de PBS van de laatste stap hebt verwijderd, voegt u direct 0,5 milliliter van één X-groep gomfixatiebuffer en 50% methanol plus 2% formaldehyde toe.Incubeer gedurende twee uur bij vier Graden Celsius met milde rotatie. Voer een rotatiewas van vijf minuten uit met tris-tritonbuffer en voeg één milliliter toe. Wacht altijd tot het weefsel de bodem van de buis bereikt.Opmerking: wacht tot het weefsel de bodem van de buis bereikt. Incubeer de speekselklieren met Tris-Triton, hetzelfde als hierboven, plus 1% bèta mercaptoethanol gedurende twee uur bij 37 graden Celsius met licht schudden. Wassen met BO3 buffer, en incuberen met BO3 plus 10 millimolar DTT op 37 graden Celsius met mild schudden gedurende 15 minuten.Voer aan het einde van de incubatieperiode alleen een wasbeurt uit met één milliliter BO3-buffer. Incubeer de speekselklieren gedurende twee uur bij kamertemperatuur bij kamertemperatuur met rotatie in één milliliter buffer B. Verwijder alle buffer B en voeg buffer A plus antilichaam van belang toe.In dit geval gebruiken we HP één, A C 18 9 van Iridium bank. 1 op 3.000 's nachts bij vier graden met rotatie. Op dit punt is het belangrijk dat het schudden geen bubbels opwekt, wat het antilichaam kan beschadigen.Geef traktatie door 15 minuten wasbeurten met buffer B, onder roeren bij kamertemperatuur met elke keer een millimeter. De klieren worden overgebracht naar buffer B samen met het secundaire antibioticumpaar naar een vloer verwijzen gedurende twee uur, onder rotatie bij vier graden. Bij deze stap is het belangrijk om de buis te bedekken met aluminiumpapierfolie om het secundaire antilichaam tegen het licht te beschermen.Voer wasmachines van 2x15 minuten uit bij kamertemperatuur, terwijl u draait met een milliliter buffer B.Incubeer met een DNA-marker zoals Sydox of OH, en los op in één milliliter buffer B gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met rotatie. Voer één wasbeurt uit met buffer B en eenmaal met PBS, elke was duurt 10 minuten, terwijl u op kamertemperatuur draait. Monteer ten slotte de speekselklieren op een glijbaan en maak een zwembad met een afdekstrook.Leg de speekselklieren in het midden van het zwembad en bedek met Sidiflor. Om vervorming van de bel te voorkomen, breidt u de stropende vloeistof overal uit. Sluit vervolgens alle dia's af met duidelijke nagellak.Observeer onder een fluorescentie- of confocale microscoop. Als het monster niet op dezelfde dag wordt waargenomen, bewaar het dan bij vier graden uit het licht. Representatieve resultaten van HB1 monostaining in Drosophila speekselklieren worden getoond in figuur één.Een positief resultaat is het observeren van één brandpunt zoals in A, athero chromatisch aggregaat of condensaat. Een negatief resultaat is geen signaal of een verspreid signaal. Soms kan een dubbel signaal worden waargenomen als een dubbel punt in C, maar komt meestal in kleinere hoeveelheden voor.Om de gegevens te analyseren die ze kunnen weergeven als een staafdiagram, waarbij de verdeling van HP1 wordt vergeleken met verschillende mutante achtergronden. In figuur twee zien we bijvoorbeeld dat 98% van de kernen een verdeling van één punt vertoont. En 2% van twee foci in wild type.In de mutant veranderde het aandeel en de aanwezigheid van twee foci steeg tot 40%Figuur drie toont representatief trimethylatielysine 9H3 in monostaining. Resultaat in Drosophila speekselklieren observeren van een brandpunt in B, het is een gunstig resultaat op het chromatische aggregaat of condensaat, een dubbel of drievoudig signaal in C kan worden gezien in zeldzame gevallen, maar in een kleine hoeveelheden. Aan het einde van dit protocol kunt u ondanks staatsbeperkingen een diachromatisch condensaat van HP1-eiwit zien, het zal een goede eerste benadering zijn.

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

Ontleding van Midgut en speekselklieren van de Ae. aegypti Muggen

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Staining Proteins in Gels

Kleuring Eiwitten in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

A Novel RFP Reporter Steun in de visualisatie van het oog denkbeeldige Disc in Drosophila</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAÃƒÅ½Ã¢â‚¬Â41

Zuivering van het M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome geassocieerd eiwit MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissectie en kleuring van de Drosophila Larvale Eierstokken

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Imaging leven van GFP-gemerkte eiwitten in<em&gt; Drosophila</em&gt; Eicellen

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

In situ Immunofluorescente Staining of Autophagy in Spier Stamcellen

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Bepaling van het plasmamembraan partitioneren voor zijdelings-geassocieerde eiwitten

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualisatie van 3D witte adipeus weefsel structuur met behulp van geheel-mount kleuring

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissectie en lipide druppel kleuring van Oenocyten in Drosophila larven

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...