Name: immunofluorescent staining for visualization of heterochromatin associated proteins in drosophila salivary glands
Uploaded: 2021-08-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands at JoVE.com

אנו מודים למרקו אנטוניו רוסאלס וגה ואייבל סגורה על שלקחו חלק מהתמונות הקונפוקליות, כרמן מוניוז על ההכנה לתקשורת וד"ר ארתורו פימנטל, מ.C ארנס סרלגי וד"ר כריס ווד מה- LMNA לקבלת ייעוץ על השימוש במיקרוסקופים.

1. תרבות הזחלים השלישית
<ol><li>הכן 1 ליטר של מדיה סטנדרטית על ידי הוספת 100 גרם של שמרים, 100 גרם של סוכר קנים שלם מזוקק, 16 גרם אגר, 10 מ"ל של חומצה פרופיונית ו 14 גרם של ג'לטין. ממיסים את כל החומרים למעט השמרים ב 800 מ"ל של מי ברז ולאחר מכן להמיס את השמרים. יש לאלתר למשך 30 דקות.<ol>
<li>לאחר מכן, לתת את התקשורת ...

<ol>
	<li>Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emil+Heitz,+a+true+epigenetics+pioneer.">Emil Heitz, a true epigenetics pioneer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572 (2019).</li><li>Irick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+function+for+heterochromatin.">A new function for heterochromatin.</a> Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).</li><li>Kasinathan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovation+of+heterochromatin+functions+drives+rapid+evolution+of+essential+ZAD-ZNF+genes+in+Drosophila.">Innovation of heterochromatin functions drives rapid evolution of essential ZAD-ZNF genes in Drosophila.</a> Elife. , 1-31 (2020).</li><li>Lifschytz, E., Hareven, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+markers:+Arrangement+of+obligatory+heterochromatin,+histone+genes+and+multisite+gene+families+in+the+interphase+nucleus+of+D.+melanogaster.">Heterochromatin markers: Arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster.</a> Chromosoma. 86 (4), 443-455 (1982).</li><li>Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1a:+A+structural+chromosomal+protein+regulating+transcription.">HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription.</a> Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).</li><li>Lee, Y. C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericentromeric+heterochromatin+is+hierarchically+organized+and+spatially+contacts+H3K9me2+islands+in+euchromatin.">Pericentromeric heterochromatin is hierarchically organized and spatially contacts H3K9me2 islands in euchromatin.</a> PLoS Genetics. 16 (3), 1-27 (2020).</li><li>Koryakov, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUUR+protein+is+involved+in+binding+of+SU+(VAR)3-9+and+methylation+of+H3K9+and+H3K27+in+chromosomes+of+Drosophila+melanogaster.">The SUUR protein is involved in binding of SU (VAR)3-9 and methylation of H3K9 and H3K27 in chromosomes of Drosophila melanogaster.</a> Chromosome Research. 19 (2), 235-249 (2011).</li><li>Cao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Histone+H3+Lysine+27+Methylation+in+Polycomb-Group+Silencing.">Role of Histone H3 Lysine 27 Methylation in Polycomb-Group Silencing.</a> Science. 298 (5595), 1039 (2002).</li><li>Hines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domains+of+heterochromatin+protein+1+required+for+Drosophila+melanogaster+heterochromatin+spreading.">Domains of heterochromatin protein 1 required for Drosophila melanogaster heterochromatin spreading.</a> Genetics. 182 (4), 967-977 (2009).</li><li>Elgin, S. C. R., Reuter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position-effect+variegation,+heterochromatin+formation,+and+gene+silencing+in+Drosophila.">Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (8), 1-26 (2013).</li><li>Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1a:+A+structural+chromosomal+protein+regulating+transcription.">HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription.</a> Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).</li><li>Meyer-Nava, S., Torres, A., Zurita, M., Valadez-graham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+effects+of+dADD1+misexpression+in+chromatin+organization+and+transcription.">Molecular effects of dADD1 misexpression in chromatin organization and transcription.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 2, 1-17 (2020).</li><li>Tennessen, J. M., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+growth+and+maturation+-+Insights+from+drosophila.">Coordinating growth and maturation - Insights from drosophila.</a> Current Biology. 21 (18), 750-757 (2011).</li><li>Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+drosophila+polytene+chromosome+squashes+for+antibody+labeling.">Preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), 1-4 (2010).</li><li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66 (1967), 57-80 (1981).</li><li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+droplet+formation+by+HP1&#945;+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin.">Liquid droplet formation by HP1&#945; suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).</li><li>Larson, A. G., Narlikar, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Phase+Separation+in+Heterochromatin+Formation,+Function,+and+Regulation.">The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation.</a> Biochemistry. 57 (17), 2540-2548 (2018).</li><li>Keenen, M. M., Larson, A. G., Narlikar, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+Quantitation+of+Phase-Separated+Droplet+Formation+by+Human+HP1&#945;.">Visualization and Quantitation of Phase-Separated Droplet Formation by Human HP1&#945;.</a> Methods in Enzymology. , (2018).</li><li>Lu, B. Y., Emtage, P. C., Duyf, B. J., Hilliker, a. J., Eissenberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+protein+1+is+required+for+the+normal+expression+of+two+heterochromatin+genes+in+Drosophila.">Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila.</a> Genetics. 155 (2), 699-708 (2000).</li><li>Marsano, R. M., Giordano, E., Messina, G., Dimitri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Portrait+of+Constitutive+Heterochromatin:+Lessons+from+Drosophila+melanogaster.">A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster.</a> Trends in Genetics. , (2019).</li><li>Strom, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+drives+heterochromatin+domain+formation.">Phase separation drives heterochromatin domain formation.</a> Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).</li><li>Sanulli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1+reshapes+nucleosome+core+to+promote+phase+separation+of+heterochromatin.">HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin.</a> Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).</li><li>Dialynas, G., Delabaere, L., Chiolo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+and+Unc45+maintain+heterochromatin+stability+in+Drosophila+polytene+chromosomes.">Arp2/3 and Unc45 maintain heterochromatin stability in Drosophila polytene chromosomes.</a> Experimental Biology and Medicine. 244 (15), 1362-1371 (2019).</li><li>Kolesnikova, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+decondensation+of+heterochromatin+in+drosophila+melanogaster+polytene+chromosomes+under+condition+of+ectopic+expression+of+the+supressor+of+underreplication+gene.">Induced decondensation of heterochromatin in drosophila melanogaster polytene chromosomes under condition of ectopic expression of the supressor of underreplication gene.</a> Fly. 5 (3), 181-190 (2011).</li><li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122 (8), 2517-2527 (1996).</li><li>Messina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeti,+an+essential+Drosophila+melanogaster+gene,+encodes+a+protein+required+for+chromatin+organization.">Yeti, an essential Drosophila melanogaster gene, encodes a protein required for chromatin organization.</a> Journal of Cell Science. 127 (11), 2577-2588 (2014).</li><li>Aguilar-Fuentes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p8/TTDA+overexpression+enhances+UV-irradiation+resistance+and+suppresses+TFIIH+mutations+in+a+Drosophila+trichothiodystrophy+model.">p8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model.</a> PLOS Genetics. 4 (11), 1-9 (2008).</li><li>Reynaud, E., Lomeli, H., Vazquez, M., Zurita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+Homologue+of+the+Xeroderma+Pigmentosum+D+Gene+Product+Is+Located+in+Euchromatic+Regions+and+Has+a+Dynamic+Response+to+UV+Light-induced+Lesions+in+Polytene+Chromosomes.">The Drosophila melanogaster Homologue of the Xeroderma Pigmentosum D Gene Product Is Located in Euchromatic Regions and Has a Dynamic Response to UV Light-induced Lesions in Polytene Chromosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 10 (4), 1191-1203 (1999).</li><li>Farka&#353;, R., Mechler, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+timing+of+Drosophila+salivary+gland+apoptosis+displays+an+I+(2)gl-dose+response.">The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays an I (2)gl-dose response.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 7 (1), 89-101 (2000).</li><li>Zhang, P., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+salivary+gland+chromocenter+contains+highly+polytenized+subdomains+of+mitotic+heterochromatin.">The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin.</a> Genetics. 139 (2), 659-670 (1995).</li><li>Stormo, B. M., Fox, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyteny:+still+a+giant+player+in+chromosome+research.">Polyteny: still a giant player in chromosome research.</a> Chromosome Research. 25 (3-4), 201-214 (2017).</li></ol>

הפונקציה התאית של אורגניזמים אאוקריוטים יכולה להגדיר את המבנה התלת-ממדי בתוך הגרעין, הנתמך על ידי אינטראקציות בין חלבונים שונים עם כרומטין ומולקולות שונות כולל RNA. בשלוש השנים האחרונות, העיבויים הביולוגיים שיש להם רלוונטיות, כולל הטרוצ'ורומטין, לקחו תפקיד בסיסי בקביעת הפרדת השלבים המקדמ?...

מאז המחקרים המוקדמים של אמיל הייץ1, הטרוכרומטין נחשב רגולטור חשוב של תהליכים תאיים כגון ביטוי גנים, הפרדה מיוטית ומיטוטית של כרומוזומים, ושמירה על יציבות הגנום2,3,4.
הטרוכרומטין מחולק בעיקר לשני סוגים: הטרוקרומטין מהווה המגדיר באופן אופייני רצפים חוזרים ונשנים, ואלמנטים הניתנים לתחלפתם הנמצאים באתרי כרומוזום ספציפיים כגון הטלומרים והצנטרומרים. סוג זה של הטרוכרומטין מוגדר בעיקר באופן אפיגנטי על ידי סימני היסטון ספציפיים כגון di או תלת-מתילציה של ליצין 9 של היסטון H3 (H3K9me3) ואת הכריכה של חלבון Heterochromatin 1a (HP1a)5,6. מצד שני, הטרוצ'ורומטין פקולטיבי ממקם דרך זרועות הכרומוזום ומורכב בעיקר גנים מושתקים התפתחותית7,8. חיסון של בלוקים הטרוצ'ורומטין בתאי metaphase, או תצפית של אגרגטים הטרוצ'ורומטין בתאים בין-פאזיים, חשף הרבה אור בהבנת היווצרות ותפקוד של אזורים הטרכוכרומטיים9.
השימוש Drosophila כמערכת מודל אפשר פיתוח של כלים חיוניים ללמוד הטרוצ'רומטין ללא שימוש במיקרוסקופיה אלקטרונית10. מאז התיאור של שינוי אפקט המיקום וגילוי חלבונים הקשורים להטרוכרומטין, כגון HP1a, ושינויים לאחר תרגום histone, קבוצות רבות פיתחו מספר טכניקות אימונוהיסטוכימיות המאפשרות הדמיה של אזורים הטרכוכרומטיים אלה10,11.
טכניקות אלה מבוססות על שימוש בנוגדנים ספציפיים המזהים חלבונים הקשורים להטרוכרומטין או סימני היסטון. עבור כל סוג תא ונוגדן, יש לקבוע את תנאי הקיבעון והחמלול באופן אמפירי. כמו כן, התנאים עשויים להשתנות אם נעשה שימוש בתהליכים מכניים נוספים כגון טכניקות מעיכה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש בבלוטות הרוק של Drosophila כדי לחקור מוקדים הטרוקרומטיים. בלוטות הרוק יש תאים רביטציה המכילים יותר מ -1,000 עותקים של הגנום, ובכך מספקים תצוגה מוגברת של רוב תכונות הכרומטין, למעט DNA לווין וכמה אזורים הטרכוכרומטיים אשר נמצאים תחת משוכפל. עם זאת, אזורי הטרוכרומטין מוצגים בקלות בתכשירי כרומוזום פוליטן, אך טכניקות העיוץ עלולות לעתים לשבש מתחמים אופייניים הקשורים לכרומטין או את ארכיטקטורת הכרומטין. לכן, אימונולוקלציה של חלבונים ברקמת בלוטת הרוק כולה יכול לעלות על ההשפעות הבלתי רצויות האלה. השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לזהות מספר חלבונים הקשורים לכרומטין, והוכחנו כי פרוטוקול זה בשילוב עם מלאי Drosophila מוטציה יכול לשמש כדי ללמוד הפרעה הטרוקרומטין12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen MCT-150-C</td>
			<td>11351904</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF1 Citifluor</td>
			<td>Ted pella</td>
			<td>19470</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735078001</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free 
			protease inhibitors</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5892953001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS285022-200EA</td>
			<td>22x22, brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>d9779</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Gold seal</td>
			<td>3011</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>Baker</td>
			<td>0084-01</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K9me3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>8889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP1a</td>
			<td>Hybridoma Bank</td>
			<td>C1A9</td>
			<td>Product Form&#160;Concentrate 0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Baker</td>
			<td>3040-01</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Baker</td>
			<td>9070-03</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-687-12Q</td>
			<td>&#160;Labquake Tube Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Mixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13527550</td>
			<td>SmartBlock 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>648311</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>100 mL, brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610710</td>
			<td>25 mL, brand not critical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescent staining for visualization of heterochromatin associated proteins in drosophila salivary glands

הדמיה של אגרגטים הטרוכרומטינים על ידי חיסון יכול להיות מאתגר. רכיבים יונקים רבים של כרומטין נשמרים Drosophila melanogaster. לכן, זהו מודל מצוין ללמוד היווצרות ותחזוקה הטרוצ'ורומטין. תאים רב-תאיים, כגון אלה שנמצאו בבלוטות הרוק של זחלי אינסטאר D. מלנוגאסטר השלישי, מספקים כלי מצוין להתבוננות בכרומטין מוגבר כמעט אלף פעמים ואפשרו לחוקרים לחקור שינויים בהתפלגות הטרוכרומטין בגרעין. למרות התצפית של רכיבי heterochromatin יכול להתבצע ישירות בתכשירי כרומוזום פוליטן, לוקליזציה של חלבונים מסוימים ניתן לשנות על ידי חומרת הטיפול. לכן, הדמיה ישירה של הטרוקרומטין בתאים משלימה סוג זה של מחקר. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את טכניקות החיסון המשמשות לרקמה זו, את השימוש בנוגדנים פלואורסצנטיים משניים, ומיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לבחון את אגרגטים הטרוקרומטין אלה בדיוק ובפרטים גדולים יותר.

תוצאות מייצגות של HP1a חיסוני בבלוטות הרוק של Drosophila מוצגות באיור 1. תוצאה חיובית היא להתבונן בנקודת מוקד אחת (איור 1a) (צבירה או עיבוי הטרכוכרומטי). תוצאה שלילית היא לא אות או אות מפוזר. לפעמים ניתן לצפות באות כפול, כלומר, עם נקודה כפולה (איור 1c</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands at JoVE.com

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

פרוטוקול זה נועד לדמיין אגרגטים הטרוקרומטין בתאי טוריטנה Drosophila.

כתמים אימונופלואורסצנטיים להדמיה של חלבונים הקשורים הטרוכרומטין בבלוטות הרוק של דרוסופילה

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...

מטרת הפרוטוקול הזה היא לדמיין אגרגטים הטרוקרומטין בתאי Drosophila. כדי להשיג זאת, אנו משתמשים בתאי פוליטן הנמצאים בבלוטות הרוק של זחלי אינסטאר שלישי הגנום של תאים אלה מוגבר כמעט אלף פעמים, והכרומוזומים משמרים את התכונות של תאי ממשק. יש להם טלומרים מוגדרים היטב, וגשרים הנקראים כרומוסנטר שבהם כל הצנטרומרים מצטברים, וזה בעיקר הטרוקרומטי.באמצעות רקמת הזחלים השלישית, מאפשר לנו גם להעריך את השינוי במצטברים ההטרוכרומטיים ברקע של מוטציות גנטיות שונות. כדי לייעל את תרבות הזחלים השלישית, יהיה עליך קודם לאסוף מבוגרים בני 5 עד 10 ימים, ולשים סביב 50 בבקבוק צוואר רחב של מדיה סטנדרטית. 25 גברים ו-25 נשים.מניחים את הבקבוק באינקובטור טמפרטורה מבוקר ב 25 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות. לאחר זמן הדגירה נגמר, להסיר את המבוגרים ולהעביר אותם לבקבוק חדש לחזור על ההליך. תן לעוברים לגדול ב 18 מעלות צלזיוס במשך 22 שעות.עבור אוסף זחלים, הקפד לבחור את הזחלים הנודדים, אשר אין כדורי גלוי. לנתח 15 זוגות של בלוטות רוק, או ככל שאתה יכול בתקופה של 30 דקות PBS קר עם מעכבי מחאה מתחת למיקרוסקופ. מעבירים את בלוטות הרוק לצינור אחר עם PBS קר כקרח.לשטוף פעם אחת עם PBS קר בתוספת מעכבי מחאה. זכור, תמיד לחכות לרקמה להגיע לתחתית הצינור. לאחר הסרת PBS מהשלב האחרון, להוסיף ישירות 0.5 מיליליטר של מאגר קיבוע חניכיים קבוצתי X אחד ו 50%מתנול בתוספת 2%פורמלדהיד.דגירה במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב קל. בצע שטיפה סיבוב אחת חמש דקות עם חוצץ טריס-טריטון, הוספת מיליליטר אחד. תמיד לחכות לרקמה להגיע לתחתית הצינור.הערה:המתן עד שהרקמה תגיע לתחתית הצינור. לדגור על בלוטות הרוק עם טריס-טריטון, כמו לעיל, בתוספת 1% של מרקפטואתנול בטא במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד קל. לשטוף עם חוצץ BO3, ודגורה עם BO3 בתוספת 10 מילימולר DTT ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד קל במשך 15 דקות.בסוף תקופת הדגירה, לבצע לשטוף עם מיליליטר אחד של חוצץ BO3 לבד. לדגור את בלוטות הרוק במיליליטר אחד של חוצץ B במשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם סיבוב. הסר את כל המאגר B והוסף מאגר A בתוספת נוגדן עניין.במקרה זה, אנו משתמשים HP אחד, C 18 9 מבנק אירידיום. 1 ל-3,000 בלילה בארבע מעלות עם סיבוב. בשלב זה חשוב כי הרעידות לא להעלות בועות, אשר עלול לפגוע בנוגדן.תן פינוק על ידי 15 דקות שטיפות עם חוצץ B, תחת ערבוב בטמפרטורת החדר באמצעות מילימטר אחד בכל פעם. הבלוטות מועברות חוצץ B יחד עם זוג אנטיביוטיקה משני לרצפה להפנות במשך שעתיים, תחת סיבוב בארבע מעלות. בשלב זה, חשוב לכסות את הצינור בנייר נייר אלומיניום כדי להגן על הנוגדן המשני מפני האור.בצע מכונות כביסה 2x15 דקות בטמפרטורת החדר, תוך סיבוב עם מיליליטר אחד של חוצץ B.Incubate עם סמן DNA כגון Sydox או OH, ולהמיס מיליליטר אחד של חוצץ B במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם סיבוב. בצע לשטוף אחד עם חוצץ B ופעם אחת עם PBS, כל לשטוף נמשך 10 דקות, תוך סיבוב בטמפרטורת החדר. לבסוף, לעלות על בלוטות הרוק על שקופית, מה שהופך בריכה עם פתק כיסוי.שים את בלוטות הרוק באמצע הבריכה לכסות עם Sidiflor. כדי למנוע עיוות של בועה, הרחבת הנוזל הצמיג בכל מקום. לאחר מכן, לאטום את כל השקופיות עם לק ברור.שימו לב תחת פלואורסצנטיות או מיקרוסקופ קונפוקלי. אם המדגם לא הולך להיות נצפה באותו יום, אז לאחסן מהאור בארבע מעלות. תוצאות מייצגות של HB1 monostaining בבלוטות הרוק Drosophila מוצגים באיור אחד.תוצאה חיובית היא להתבונן בנקודת מוקד אחת כמו ב- A, צבירה כרומטית אתרו או עיבוי. תוצאה שלילית היא לא אות או אות מפוזר. לפעמים, אות כפול ניתן לראות כמו נקודה כפולה ב- C, אבל בדרך כלל מתרחש בכמויות קטנות יותר.כדי לנתח את הנתונים שניתן לייצג כגרף עמודות, השוואת ההתפלגות של HP1 עם רקעים מוטנטיים שונים. לדוגמה, באיור השני, אנו יכולים לראות כי 98% מהגרעין מציגים התפלגות של נקודה אחת. ו-2% משני מוקדים בסוג פראי.במוטנט, השיעור השתנה, ונוכחותם של שני מוקדים גדלה ל-40% איור שלוש מראה ליצין 9H3 מייצג בשחור-ממד. התוצאה של בלוטות הרוק של Drosophila התבוננות בנקודת מוקד אחת ב- B, זוהי תוצאה חיובית במצטבר הכרומטי או עיבוי, אות כפול או משולש ב- C ניתן לראות במקרים נדירים, אך בכמויות קטנות. בסוף פרוטוקול זה, תוכל לראות עיבוי דיכרומטי של חלבון HP1 למרות מגבלות המדינה, זו תהיה גישה ראשונה טובה.

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

Dissection של בלוטות הרוק midgut ו מ AE. aegypti יתושים

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Staining Proteins in Gels

מכתים חלבונים ג&#39;ל

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

RFP כתב רומן על סיוע ויזואליזציה של דיסק העין דמותי ב תסיסנית</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAÃƒÅ½Ã¢â‚¬Â41

טיהור של מ magneticum מסננים השגריר-1 Magnetosome חלבון Associated MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection ו מכתים של תסיסנית הזחל השחלות

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

ב Situ Immunofluorescent מכתים של autophagy בתאי גזע שריר

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

קביעת חלוקה למחיצות של קרום פלזמה חלבונים הקשורים באופן עקיף

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

הדמיה של מבנה שומן לבן תלת-ממד באמצעות צביעת כולה-הר

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

לחיתוך וליפיד Droplet כתמים של Oenocytes בתוך דרוזופילה הזחלים

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...