Name: immunofluorescent staining for visualization of heterochromatin associated proteins in drosophila salivary glands
Uploaded: 2021-08-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands at JoVE.com

हम मार्को एंटोनियो रोसेल्स वेगा और हाबिल सेगुरा को कुछ कॉन्फोकल इमेज लेने के लिए धन्यवाद देते हैं, मीडिया की तैयारी के लिए कारमेन मुनोज और डॉ आर्तुरो पिमेंटेल, एम.C एंड्रेस सारालेगुई, और डॉ क्रिस वुड एलएमएनए से माइक्रोस्कोप के उपयोग पर सलाह के लिए ।

1. तीसरा इंस्टार लार्वा संस्कृति
<ol><li>100 ग्राम खमीर, 100 ग्राम अपरिष्कृत संपूर्ण गन्ना चीनी, 16 ग्राम आगर, प्रोपियोनिक एसिड के 10 एमएल और जिलेटिन के 14 ग्राम जोड़कर मानक मीडिया का 1 लीटर तैयार करें। नल के पानी के 800...

<ol>
	<li>Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emil+Heitz,+a+true+epigenetics+pioneer.">Emil Heitz, a true epigenetics pioneer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572 (2019).</li><li>Irick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+function+for+heterochromatin.">A new function for heterochromatin.</a> Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).</li><li>Kasinathan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovation+of+heterochromatin+functions+drives+rapid+evolution+of+essential+ZAD-ZNF+genes+in+Drosophila.">Innovation of heterochromatin functions drives rapid evolution of essential ZAD-ZNF genes in Drosophila.</a> Elife. , 1-31 (2020).</li><li>Lifschytz, E., Hareven, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+markers:+Arrangement+of+obligatory+heterochromatin,+histone+genes+and+multisite+gene+families+in+the+interphase+nucleus+of+D.+melanogaster.">Heterochromatin markers: Arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster.</a> Chromosoma. 86 (4), 443-455 (1982).</li><li>Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1a:+A+structural+chromosomal+protein+regulating+transcription.">HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription.</a> Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).</li><li>Lee, Y. C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericentromeric+heterochromatin+is+hierarchically+organized+and+spatially+contacts+H3K9me2+islands+in+euchromatin.">Pericentromeric heterochromatin is hierarchically organized and spatially contacts H3K9me2 islands in euchromatin.</a> PLoS Genetics. 16 (3), 1-27 (2020).</li><li>Koryakov, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUUR+protein+is+involved+in+binding+of+SU+(VAR)3-9+and+methylation+of+H3K9+and+H3K27+in+chromosomes+of+Drosophila+melanogaster.">The SUUR protein is involved in binding of SU (VAR)3-9 and methylation of H3K9 and H3K27 in chromosomes of Drosophila melanogaster.</a> Chromosome Research. 19 (2), 235-249 (2011).</li><li>Cao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Histone+H3+Lysine+27+Methylation+in+Polycomb-Group+Silencing.">Role of Histone H3 Lysine 27 Methylation in Polycomb-Group Silencing.</a> Science. 298 (5595), 1039 (2002).</li><li>Hines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domains+of+heterochromatin+protein+1+required+for+Drosophila+melanogaster+heterochromatin+spreading.">Domains of heterochromatin protein 1 required for Drosophila melanogaster heterochromatin spreading.</a> Genetics. 182 (4), 967-977 (2009).</li><li>Elgin, S. C. R., Reuter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position-effect+variegation,+heterochromatin+formation,+and+gene+silencing+in+Drosophila.">Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (8), 1-26 (2013).</li><li>Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1a:+A+structural+chromosomal+protein+regulating+transcription.">HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription.</a> Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).</li><li>Meyer-Nava, S., Torres, A., Zurita, M., Valadez-graham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+effects+of+dADD1+misexpression+in+chromatin+organization+and+transcription.">Molecular effects of dADD1 misexpression in chromatin organization and transcription.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 2, 1-17 (2020).</li><li>Tennessen, J. M., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+growth+and+maturation+-+Insights+from+drosophila.">Coordinating growth and maturation - Insights from drosophila.</a> Current Biology. 21 (18), 750-757 (2011).</li><li>Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+drosophila+polytene+chromosome+squashes+for+antibody+labeling.">Preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), 1-4 (2010).</li><li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66 (1967), 57-80 (1981).</li><li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+droplet+formation+by+HP1&#945;+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin.">Liquid droplet formation by HP1&#945; suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).</li><li>Larson, A. G., Narlikar, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Phase+Separation+in+Heterochromatin+Formation,+Function,+and+Regulation.">The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation.</a> Biochemistry. 57 (17), 2540-2548 (2018).</li><li>Keenen, M. M., Larson, A. G., Narlikar, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+Quantitation+of+Phase-Separated+Droplet+Formation+by+Human+HP1&#945;.">Visualization and Quantitation of Phase-Separated Droplet Formation by Human HP1&#945;.</a> Methods in Enzymology. , (2018).</li><li>Lu, B. Y., Emtage, P. C., Duyf, B. J., Hilliker, a. J., Eissenberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+protein+1+is+required+for+the+normal+expression+of+two+heterochromatin+genes+in+Drosophila.">Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila.</a> Genetics. 155 (2), 699-708 (2000).</li><li>Marsano, R. M., Giordano, E., Messina, G., Dimitri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Portrait+of+Constitutive+Heterochromatin:+Lessons+from+Drosophila+melanogaster.">A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster.</a> Trends in Genetics. , (2019).</li><li>Strom, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+drives+heterochromatin+domain+formation.">Phase separation drives heterochromatin domain formation.</a> Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).</li><li>Sanulli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1+reshapes+nucleosome+core+to+promote+phase+separation+of+heterochromatin.">HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin.</a> Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).</li><li>Dialynas, G., Delabaere, L., Chiolo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+and+Unc45+maintain+heterochromatin+stability+in+Drosophila+polytene+chromosomes.">Arp2/3 and Unc45 maintain heterochromatin stability in Drosophila polytene chromosomes.</a> Experimental Biology and Medicine. 244 (15), 1362-1371 (2019).</li><li>Kolesnikova, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+decondensation+of+heterochromatin+in+drosophila+melanogaster+polytene+chromosomes+under+condition+of+ectopic+expression+of+the+supressor+of+underreplication+gene.">Induced decondensation of heterochromatin in drosophila melanogaster polytene chromosomes under condition of ectopic expression of the supressor of underreplication gene.</a> Fly. 5 (3), 181-190 (2011).</li><li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122 (8), 2517-2527 (1996).</li><li>Messina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeti,+an+essential+Drosophila+melanogaster+gene,+encodes+a+protein+required+for+chromatin+organization.">Yeti, an essential Drosophila melanogaster gene, encodes a protein required for chromatin organization.</a> Journal of Cell Science. 127 (11), 2577-2588 (2014).</li><li>Aguilar-Fuentes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p8/TTDA+overexpression+enhances+UV-irradiation+resistance+and+suppresses+TFIIH+mutations+in+a+Drosophila+trichothiodystrophy+model.">p8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model.</a> PLOS Genetics. 4 (11), 1-9 (2008).</li><li>Reynaud, E., Lomeli, H., Vazquez, M., Zurita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+Homologue+of+the+Xeroderma+Pigmentosum+D+Gene+Product+Is+Located+in+Euchromatic+Regions+and+Has+a+Dynamic+Response+to+UV+Light-induced+Lesions+in+Polytene+Chromosomes.">The Drosophila melanogaster Homologue of the Xeroderma Pigmentosum D Gene Product Is Located in Euchromatic Regions and Has a Dynamic Response to UV Light-induced Lesions in Polytene Chromosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 10 (4), 1191-1203 (1999).</li><li>Farka&#353;, R., Mechler, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+timing+of+Drosophila+salivary+gland+apoptosis+displays+an+I+(2)gl-dose+response.">The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays an I (2)gl-dose response.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 7 (1), 89-101 (2000).</li><li>Zhang, P., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+salivary+gland+chromocenter+contains+highly+polytenized+subdomains+of+mitotic+heterochromatin.">The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin.</a> Genetics. 139 (2), 659-670 (1995).</li><li>Stormo, B. M., Fox, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyteny:+still+a+giant+player+in+chromosome+research.">Polyteny: still a giant player in chromosome research.</a> Chromosome Research. 25 (3-4), 201-214 (2017).</li></ol>

यूकेरियोटिक जीवों का सेलुलर फ़ंक्शन नाभिक के भीतर 3 डी संरचना को परिभाषित कर सकता है, जो क्रोमेटिन और आरएनए सहित विभिन्न अणुओं के साथ विभिन्न प्रोटीन के बीच बातचीत द्वारा समर्थित है। पिछले तीन वर्षों ?...

एमिल हेट्ज1के शुरुआती अध्ययनों के बाद से, हेट्रोक्रोमोमाटिन को सेलुलर प्रक्रियाओं का एक महत्वपूर्ण नियामक माना जाता है जैसे जीन अभिव्यक्ति, गुणसूत्रों का मेयोटिक और माइटोटिक पृथक्करण, और जीनोम स्थिरता2,3,4का रखरखाव।
हेट्रोक्रोमेटिन को मुख्य रूप से दो प्रकारों में विभाजित किया जाता है: संविलियन हेट्रोक्रोमेमीटरिन जो विशेष रूप से दोहराव वाले दृश्यों को परिभाषित करता है, और ट्रांसपोसेबल तत्व जो टेलोमेरेस और सेंट्रोमेर जैसे विशिष्ट गुणसूत्र साइटों पर मौजूद होते हैं। इस प्रकार के हेट्रोक्रोमेटिन को मुख्य रूप से विशिष्ट हिस्टोन के निशानों जैसे विशिष्ट हिस्टोन के निशानों द्वारा परिभाषित किया गया है जैसे कि हिस्टोन एच 3 (एच 3के 9मे3) के लिसाइन 9 का डी या त्रि-मिथाइलेशन और हेट्रोक्रोमेटिन प्रोटीन 1a (एचपी1ए)5,6का बंधन। दूसरी ओर, संकाय हेट्रोक्रोमेटिन गुणसूत्र की बाहों के माध्यम से स्थानीयकरण करता है और इसमें मुख्य रूप से विकासात्मक रूप से खामोश जीन7,8होते हैं। मेटाफेज कोशिकाओं में हेट्रोक्रोमेटिन ब्लॉकों की इम्यूनोदाता, या इंटरफेज कोशिकाओं में हेट्रोक्रोमेटिन के अवलोकन, ने हेट्रोक्रोमेटिक क्षेत्रों के गठन और कार्य की समझ में बहुत प्रकाश का अनावरण किया है9।
ड्रोसोफिला को एक मॉडल प्रणाली के रूप में उपयोग करने से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी10के उपयोग के बिना हेट्रोक्रोमेटिन का अध्ययन करने के लिए आवश्यक उपकरणों के विकास की अनुमति दी गई है । चूंकि स्थिति प्रभाव का विवरण विविधीकरण और हेट्रोक्रोमेटिन से जुड़े प्रोटीन की खोज, जैसे एचपी 1ए, और हिस्टोन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन, कई समूहों ने कई इम्यूनोहिस्टोकेमिकल तकनीकविकसित की हैं जो इन विषम क्षेत्रों10, 11के दृश्य की अनुमति देती हैं।
ये तकनीकें विशिष्ट एंटीबॉडी के उपयोग पर आधारित हैं जो हेट्रोक्रोमेटिन से जुड़े प्रोटीन या हिस्टोन के निशान को पहचानते हैं। हर सेल प्रकार और एंटीबॉडी के लिए, निर्धारण और पारयीकरण की स्थिति अनुभवजन्य रूप से निर्धारित की जानी चाहिए। इसके अलावा, यदि स्क्वैशिंग तकनीकों जैसी अतिरिक्त यांत्रिक प्रक्रियाओं का उपयोग किया जाता है तो स्थितियां भिन्न हो सकती हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम हेट्रोक्रोमेटिक फोसी का अध्ययन करने के लिए ड्रोसोफिला लार ग्रंथियों के उपयोग का वर्णन करते हैं। लार ग्रंथियों में पॉलीटेनाइज्ड कोशिकाएं होती हैं जिनमें जीनोम की 1,000 से अधिक प्रतियां होती हैं, इस प्रकार उपग्रह डीएनए और कुछ विषमता क्षेत्रों के अपवाद के साथ अधिकांश क्रोमेटिन सुविधाओं का एक प्रवर्धित दृश्य प्रदान किया जाता है। फिर भी, हेट्रो क्रोमोमीटर क्षेत्रों को पॉलीटीन गुणसूत्र तैयारी में आसानी से कल्पना की जाती है, लेकिन स्क्वैशिंग तकनीक कभी-कभी विशेषता क्रोमेटिन-बाउंड कॉम्प्लेक्स या क्रोमेटिन वास्तुकला को बाधित कर सकती है। इसलिए, पूरे लार ग्रंथि ऊतक में प्रोटीन का इम्यूनोलोकलाइजेशन इन अवांछित प्रभावों को पार कर सकता है। हमने कई क्रोमेटिन बाउंड प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया है, और हमने दिखा दिया है कि उत्परिवर्ती ड्रोसोफिला स्टॉक्स के साथ संयुक्त इस प्रोटोकॉल का उपयोग हेट्रोक्रोमेटिन व्यवधान12का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen MCT-150-C</td>
			<td>11351904</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF1 Citifluor</td>
			<td>Ted pella</td>
			<td>19470</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735078001</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free 
			protease inhibitors</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5892953001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS285022-200EA</td>
			<td>22x22, brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>d9779</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Gold seal</td>
			<td>3011</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>Baker</td>
			<td>0084-01</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K9me3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>8889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP1a</td>
			<td>Hybridoma Bank</td>
			<td>C1A9</td>
			<td>Product Form&#160;Concentrate 0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Baker</td>
			<td>3040-01</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Baker</td>
			<td>9070-03</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-687-12Q</td>
			<td>&#160;Labquake Tube Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Mixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13527550</td>
			<td>SmartBlock 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>648311</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>100 mL, brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610710</td>
			<td>25 mL, brand not critical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescent staining for visualization of heterochromatin associated proteins in drosophila salivary glands

इम्यूनोस्टेपिंग द्वारा हेट्रोक्रोमेटिन समुच्चय का दृश्य चुनौतीपूर्ण हो सकता है। क्रोमेटिन के कई स्तनधारी घटकों को ड्रोसोफिला मेलनोगास्टर में संरक्षित किया जाता है। इसलिए, हेट्रोक्रोमेटिन गठन और रखरखाव का अध्ययन करने के लिए यह एक उत्कृष्ट मॉडलहै। पॉलीटेनाइज्ड कोशिकाएं, जैसे कि तीसरे इंस्टार डी मेलानोगास्टर लार्वा की लार ग्रंथियों में पाए जाने वाले, लगभग एक हजार बार परिलक्षित क्रोमेटिन का निरीक्षण करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण प्रदान करते हैं और शोधकर्ताओं को नाभिक में हेट्रोक्रोमेटिन के वितरण में परिवर्तन का अध्ययन करने की अनुमति दी है। यद्यपि हेट्रोक्रोमेटिन घटकों का अवलोकन सीधे पॉलीटीन गुणसूत्र तैयारी में किया जा सकता है, कुछ प्रोटीन के स्थानीयकरण को उपचार की गंभीरता से बदला जा सकता है। इसलिए, कोशिकाओं में हेट्रोक्रोमेटिन का प्रत्यक्ष दृश्य इस प्रकार के अध्ययन का पूरक है। इस प्रोटोकॉल में, हम इस ऊतक के लिए उपयोग की जाने वाली इम्यूनोस्टेटिंग तकनीकों, माध्यमिक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के उपयोग और इन हेट्रोक्रोमेटिन को अधिक सटीकता और विस्तार के साथ एकत्रित करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का वर्णन करते हैं।

ड्रोसोफिला लार ग्रंथियों में HP1a इम्यूनोस्टेटिंग के प्रतिनिधि परिणाम चित्र 1में दिखाए गए हैं । एक सकारात्मक परिणाम एक केंद्र बिंदु(चित्रा 1a)(विषम समग्र या संघनित) का निरीक्षण ?...

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Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य ड्रोसोफिला पॉलीटेन कोशिकाओं में हेट्रोक्रोमेटिन समुच्चय की कल्पना करना है।

ड्रोसोफिला लार ग्रंथियों में हेट्रोक्रोमेटिन एसोसिएटेड प्रोटीन के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए इम्यूनोफ्लोर्सेंट स्टेनिंग

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य ड्रोसोफिला कोशिकाओं में हेट्रोक्रोमेटिन एग्रीगेट्स की कल्पना करना है। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए हम पॉलीटीन कोशिकाओं का उपयोग करते हैं जो तीसरे इंस्टार लार्वा की लार ग्रंथियों में पाए जाते हैं इन कोशिकाओं के जीनोम को लगभग एक हजार बार परिलक्षित किया जाता है, और गुणसूत्र इंटरफेस कोशिकाओं की विशेषताओं को संरक्षित करते हैं। उनके पास अच्छी तरह से परिभाषित टेलोमेरेस है, और पुलों को क्रोमोसेंटर कहा जाता है जिसमें सभी सेंट्रोमर एकत्र होते हैं, और यह मुख्य रूप से विषमतापूर्ण है।तीसरे इंस्टार लार्वा ऊतक का उपयोग करके, हमें विभिन्न आनुवंशिक म्यूटेंट की पृष्ठभूमि में विषमविज्ञानी समुच्चय में परिवर्तन का मूल्यांकन करने की अनुमति भी देते हैं। तीसरे इंस्टार लार्वा संस्कृति को अनुकूलित करने के लिए, आपको पहले 5 से 10 दिन पुराने वयस्कों को इकट्ठा करने की आवश्यकता होगी, और एक मानक मीडिया की एक व्यापक गर्दन की बोतल में लगभग 50 डाल दिया जाएगा। 25 पुरुष और 25 महिला।बोतल को 12 घंटे के लिए 25 सेल्सियस डिग्री पर एक नियंत्रित तापमान इनक्यूबेटर में रखें। इनक्यूबेशन समय समाप्त होने के बाद, वयस्कों को हटा दें और प्रक्रिया को दोहराने के लिए उन्हें एक नई बोतल में स्थानांतरित करें। भ्रूण को 22 घंटे के लिए 18 डिग्री सेल्सियस की तरह बढ़ने दें ।लार्वा संग्रह के लिए, सुनिश्चित करें कि आप भटकने वाले लार्वा चुनते हैं, जिसमें खुलकर गोलाकार नहीं होते हैं। लार ग्रंथियों के 15 जोड़े, या जितना आप माइक्रोस्कोप के तहत विरोध अवरोधकों के साथ ठंडे PBS में 30 मिनट की अवधि में कर सकते है विच्छेदन । बर्फ ठंड PBS के साथ एक और ट्यूब के लिए लार ग्रंथियों हस्तांतरण।ठंड पीबीएस प्लस विरोध अवरोधकों के साथ एक बार धोएं। याद रखें, हमेशा ट्यूब के नीचे तक पहुंचने के लिए ऊतक का इंतजार करें। पिछले चरण से पीबीएस को हटाने के बाद, सीधे एक एक्स समूह गम निर्धारण बफर और 50% मेथनॉल प्लस 2% फॉर्मलडिहाइड के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।हल्के रोटेशन के साथ चार सेल्सियस डिग्री पर दो घंटे के लिए इनक्यूबेट । एक मिलीलीटर जोड़ते हुए, ट्राइस-ट्राइटन बफर के साथ १ ५ मिनट का रोटेशन वॉश करें । हमेशा टिश्यू के ट्यूब के नीचे तक पहुंचने का इंतजार करें।नोट- टिश्यू के ट्यूब के नीचे पहुंचने का इंतजार करें। ट्रिस-ट्राइटन के साथ लार ग्रंथियों को इनक्यूबेट करें, ऊपर के समान, प्लस 1% बीटा मर्केप्टोथेनॉल दो घंटे के लिए हल्के झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर। BO3 बफर के साथ धोएं, और 15 मिनट के लिए हल्के मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर बीओ 3 प्लस 10 मिलीमोलर डीटीटी के साथ इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन अवधि के अंत में, अकेले BO3 बफर के एक मिलीलीटर के साथ एक धोने का प्रदर्शन करें। रोटेशन के साथ कमरे के तापमान पर दो घंटे के लिए बफर बी के एक मिलीलीटर में लार ग्रंथियों को इनक्यूबेट करें। सभी बफर बी निकालें और ब्याज की बफर ए प्लस एंटीबॉडी जोड़ें।इस मामले में, हम इरिडियम बैंक से एचपी वन, ए सी 1 8 9 का उपयोग करते हैं। रोटेशन के साथ चार डिग्री पर रात में 3, 000 से अधिक में 1। इस बिंदु पर महत्वपूर्ण है कि मिलाते हुए बुलबुले नहीं बढ़ा है, जो एंटीबॉडी को नुकसान पहुंचा सकता है।हर बार एक मिलीमीटर का उपयोग करके कमरे के तापमान पर सरगर्मी के तहत बफर बी के साथ 15 मिनट की धुलाई से इलाज दें। ग्रंथियों को एक मंजिल के लिए माध्यमिक एंटीबायोटिक जोड़े के साथ बफर बी में स्थानांतरित कर रहे हैं, चार डिग्री पर रोटेशन के तहत दो घंटे के लिए देखें । इस कदम पर, प्रकाश से माध्यमिक एंटीबॉडी की रक्षा के लिए एल्यूमीनियम पेपर पन्नी के साथ ट्यूब को कवर करना महत्वपूर्ण है।कमरे के तापमान पर 2x15 मिनट वाशर बाहर ले, जबकि इस तरह के Sydox या ओह के रूप में एक डीएनए मार्कर के साथ बफर बी Incubate के एक मिलीलीटर के साथ रोटेशन, और रोटेशन के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए बफर बी के एक मिलीलीटर में भंग । बफर बी के साथ एक धोने और पीबीएस के साथ एक बार, प्रत्येक 10 मिनट तक चलने वाले धोते हैं, जबकि कमरे के तापमान पर घूर्णन करते हैं। अंत में, एक स्लाइड पर लार ग्रंथियों माउंट, एक कवर पर्ची के साथ एक पूल बना रही है ।पूल के बीच में लार ग्रंथियों रखो और सिडिफ़लर के साथ कवर। बुलबुले के विरूपण से बचने के लिए, सभी जगह चिपचिपा तरल का विस्तार। इसके बाद साफ नेल पॉलिश के साथ सभी स्लाइड्स सील करें।फ्लोरेसेंस या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करें। यदि एक ही दिन सैंपल नहीं देखा जा रहा है तो चार डिग्री पर लाइट से स्टोर करें। ड्रोसोफिला लार ग्रंथियों में एचबी1 मोनोस्टैनिंग के प्रतिनिधि परिणाम आंकड़ा एक में दिखाए गए हैं।एक सकारात्मक परिणाम ए, एथेरो रंगीन कुल या संघनित की तरह एक केंद्र बिंदु का निरीक्षण करना है। एक नकारात्मक परिणाम कोई संकेत या एक फैलाया संकेत है । कभी-कभी, सी में डबल पॉइंट की तरह डबल सिग्नल देखा जा सकता है, लेकिन आमतौर पर कम मात्रा में होता है।डेटा का विश्लेषण करने के लिए वे एक बार ग्राफ के रूप में प्रतिनिधित्व किया जा सकता है, विभिन्न उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि के साथ HP1 के वितरण की तुलना । उदाहरण के लिए, आंकड़ा दो में, हम देख सकते हैं कि नाभिक का 98% एक बिंदु का वितरण प्रस्तुत करता है। और जंगली प्रकार में दो फोसी का 2%।उत्परिवर्ती में, अनुपात बदल गया, और दो फोसी की उपस्थिति 40% तक बढ़ गई, तीन मोनोस्टैनिंग में प्रतिनिधि ट्राइमेथिलेशन 9H3 दिखाता है। ड्रोसोफिला लार ग्रंथियों में परिणाम बी में एक केंद्र बिंदु देख, यह रंगीन कुल या संघनित पर एक अनुकूल परिणाम है, सी में एक डबल या ट्रिपल संकेत दुर्लभ अवसर पर देखा जा सकता है, लेकिन एक छोटी मात्रा में । इस प्रोटोकॉल के अंत में, आप राज्य की सीमाओं के बावजूद एचपी1 प्रोटीन के एक डायकोरोमैटिक कंडेनसेट देख पाएंगे, यह एक अच्छा पहला तरीका होगा।

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

ऐ से midgut और लार की गिल्टी के विच्छेदन. aegypti मच्छरों

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Staining Proteins in Gels

जैल में प्रोटीन धुंधला

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

एक उपन्यास आरएफपी रिपोर्टर आँखों Imaginal डिस्क के विज़ुअलाइज़ेशन में सहायता ड्रोसोफिला</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAÃƒÅ½Ã¢â‚¬Â41

के शोधन एम. magneticum तनाव Magnetosome एसोसिएटेड प्रोटीन MamAΔ41-1 AMB

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

के विच्छेदन और धुंधला ड्रोसोफिला लारवल अंडाशय

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

में प्रोटीन GFP लेबल की इमेजिंग लाइव<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; Oocytes

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

मस्तिष्क स्टेम कोशिकाओं में स्वस्थता के सिटू इम्युनोफ्लोरोइसेंट स्टाइनिंग में

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

परिधीय रूप से जुड़े प्रोटीन के लिए प्लाज्मा झिल्ली विभाजन का निर्धारण

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

3 डी सफेद वसा ऊतक संरचना के दृश्य का उपयोग कर पूरे माउंट धुंधला

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

ड्रोसोफिला लार्वा में ओएनोसाइट्स का विच्छेदन और लिपिड ड्रॉपलेट धुंधला

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...