Name: immunofluorescent staining for visualization of heterochromatin associated proteins in drosophila salivary glands
Uploaded: 2021-08-21T14:30:00
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マルコ・アントニオ・ロサレス・ベガとアベル・セグラは、メディアの準備のためにカルメン・ムニョス、メディアの準備のためにカルメン・ムニョス博士、M.Cアンドレス・サラレギ、LMNAのクリス・ウッド博士に顕微鏡の使用に関するアドバイスをしてくれたことに感謝します。

1. 第三のインスター幼虫文化
<ol><li>1リットルの酵母、100gの未精製の全てのサトウキビ砂糖、16gの寒天、プロピオン酸10mL、ゼラチン14gを加えて、標準培地を1リットル用意します。800mLの水道水に酵母以外の成分をすべて溶解し、酵母を溶解します。30分間すぐにオートクレーブ。<ol>
<li>その後、培地を60°Cまで冷却し、プロピオン酸を最終濃度0.01%に加えます。ゼラチンが形成されるまでボ?...

<ol>
	<li>Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emil+Heitz,+a+true+epigenetics+pioneer.">Emil Heitz, a true epigenetics pioneer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572 (2019).</li><li>Irick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+function+for+heterochromatin.">A new function for heterochromatin.</a> Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).</li><li>Kasinathan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovation+of+heterochromatin+functions+drives+rapid+evolution+of+essential+ZAD-ZNF+genes+in+Drosophila.">Innovation of heterochromatin functions drives rapid evolution of essential ZAD-ZNF genes in Drosophila.</a> Elife. , 1-31 (2020).</li><li>Lifschytz, E., Hareven, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+markers:+Arrangement+of+obligatory+heterochromatin,+histone+genes+and+multisite+gene+families+in+the+interphase+nucleus+of+D.+melanogaster.">Heterochromatin markers: Arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster.</a> Chromosoma. 86 (4), 443-455 (1982).</li><li>Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1a:+A+structural+chromosomal+protein+regulating+transcription.">HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription.</a> Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).</li><li>Lee, Y. C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericentromeric+heterochromatin+is+hierarchically+organized+and+spatially+contacts+H3K9me2+islands+in+euchromatin.">Pericentromeric heterochromatin is hierarchically organized and spatially contacts H3K9me2 islands in euchromatin.</a> PLoS Genetics. 16 (3), 1-27 (2020).</li><li>Koryakov, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUUR+protein+is+involved+in+binding+of+SU+(VAR)3-9+and+methylation+of+H3K9+and+H3K27+in+chromosomes+of+Drosophila+melanogaster.">The SUUR protein is involved in binding of SU (VAR)3-9 and methylation of H3K9 and H3K27 in chromosomes of Drosophila melanogaster.</a> Chromosome Research. 19 (2), 235-249 (2011).</li><li>Cao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Histone+H3+Lysine+27+Methylation+in+Polycomb-Group+Silencing.">Role of Histone H3 Lysine 27 Methylation in Polycomb-Group Silencing.</a> Science. 298 (5595), 1039 (2002).</li><li>Hines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domains+of+heterochromatin+protein+1+required+for+Drosophila+melanogaster+heterochromatin+spreading.">Domains of heterochromatin protein 1 required for Drosophila melanogaster heterochromatin spreading.</a> Genetics. 182 (4), 967-977 (2009).</li><li>Elgin, S. C. R., Reuter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position-effect+variegation,+heterochromatin+formation,+and+gene+silencing+in+Drosophila.">Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (8), 1-26 (2013).</li><li>Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+growth+and+maturation+-+Insights+from+drosophila.">Coordinating growth and maturation - Insights from drosophila.</a> Current Biology. 21 (18), 750-757 (2011).</li><li>Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+drosophila+polytene+chromosome+squashes+for+antibody+labeling.">Preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), 1-4 (2010).</li><li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66 (1967), 57-80 (1981).</li><li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+droplet+formation+by+HP1&#945;+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin.">Liquid droplet formation by HP1&#945; suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).</li><li>Larson, A. G., Narlikar, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Phase+Separation+in+Heterochromatin+Formation,+Function,+and+Regulation.">The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation.</a> Biochemistry. 57 (17), 2540-2548 (2018).</li><li>Keenen, M. M., Larson, A. G., Narlikar, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+Quantitation+of+Phase-Separated+Droplet+Formation+by+Human+HP1&#945;.">Visualization and Quantitation of Phase-Separated Droplet Formation by Human HP1&#945;.</a> Methods in Enzymology. , (2018).</li><li>Lu, B. Y., Emtage, P. C., Duyf, B. J., Hilliker, a. J., Eissenberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+protein+1+is+required+for+the+normal+expression+of+two+heterochromatin+genes+in+Drosophila.">Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila.</a> Genetics. 155 (2), 699-708 (2000).</li><li>Marsano, R. M., Giordano, E., Messina, G., Dimitri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Portrait+of+Constitutive+Heterochromatin:+Lessons+from+Drosophila+melanogaster.">A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster.</a> Trends in Genetics. , (2019).</li><li>Strom, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+drives+heterochromatin+domain+formation.">Phase separation drives heterochromatin domain formation.</a> Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).</li><li>Sanulli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1+reshapes+nucleosome+core+to+promote+phase+separation+of+heterochromatin.">HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin.</a> Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).</li><li>Dialynas, G., Delabaere, L., Chiolo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+and+Unc45+maintain+heterochromatin+stability+in+Drosophila+polytene+chromosomes.">Arp2/3 and Unc45 maintain heterochromatin stability in Drosophila polytene chromosomes.</a> Experimental Biology and Medicine. 244 (15), 1362-1371 (2019).</li><li>Kolesnikova, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+decondensation+of+heterochromatin+in+drosophila+melanogaster+polytene+chromosomes+under+condition+of+ectopic+expression+of+the+supressor+of+underreplication+gene.">Induced decondensation of heterochromatin in drosophila melanogaster polytene chromosomes under condition of ectopic expression of the supressor of underreplication gene.</a> Fly. 5 (3), 181-190 (2011).</li><li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122 (8), 2517-2527 (1996).</li><li>Messina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeti,+an+essential+Drosophila+melanogaster+gene,+encodes+a+protein+required+for+chromatin+organization.">Yeti, an essential Drosophila melanogaster gene, encodes a protein required for chromatin organization.</a> Journal of Cell Science. 127 (11), 2577-2588 (2014).</li><li>Aguilar-Fuentes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p8/TTDA+overexpression+enhances+UV-irradiation+resistance+and+suppresses+TFIIH+mutations+in+a+Drosophila+trichothiodystrophy+model.">p8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model.</a> PLOS Genetics. 4 (11), 1-9 (2008).</li><li>Reynaud, E., Lomeli, H., Vazquez, M., Zurita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+Homologue+of+the+Xeroderma+Pigmentosum+D+Gene+Product+Is+Located+in+Euchromatic+Regions+and+Has+a+Dynamic+Response+to+UV+Light-induced+Lesions+in+Polytene+Chromosomes.">The Drosophila melanogaster Homologue of the Xeroderma Pigmentosum D Gene Product Is Located in Euchromatic Regions and Has a Dynamic Response to UV Light-induced Lesions in Polytene Chromosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 10 (4), 1191-1203 (1999).</li><li>Farka&#353;, R., Mechler, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+timing+of+Drosophila+salivary+gland+apoptosis+displays+an+I+(2)gl-dose+response.">The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays an I (2)gl-dose response.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 7 (1), 89-101 (2000).</li><li>Zhang, P., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+salivary+gland+chromocenter+contains+highly+polytenized+subdomains+of+mitotic+heterochromatin.">The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin.</a> Genetics. 139 (2), 659-670 (1995).</li><li>Stormo, B. M., Fox, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyteny:+still+a+giant+player+in+chromosome+research.">Polyteny: still a giant player in chromosome research.</a> Chromosome Research. 25 (3-4), 201-214 (2017).</li></ol>

真核生物の細胞機能は、核内の3D構造を定義することができ、これはクロマチンとの異なるタンパク質とRNAを含む様々な分子との相互作用によって支えられる。過去3年間で、ヘテロクロマチンを含む関連性を有する生物学的凝縮物は、活性クロマチン16、17、18の明確な核空間組織を促進する相分離の決定において基本的な役割を<sup class="xre...

エミール・ハイツ1の初期研究以来、ヘテロクロマチンは、遺伝子発現、染色体のmeioticおよびmitotic分離、およびゲノム安定性2、3、4の維持などの細胞プロセスの重要な調節因子と考えられてきました。
ヘテロクロマチンは、主に、反復配列を特徴的に定義する構成ヘテロクロマチンと、テロメアやセントロメレスなどの特定の染色体部位に存在する変容可能な要素の2つに分けられます。この種のヘテロクロマチンは、ヒストンH3のリシン9のジまたはトリメチル化(H3K9me3)およびヘテロクロマチンタンパク質1a(HP1a)5,6の結合などの特異的ヒストンマークによって主にエピジェネティックに定義される。一方、栄養性ヘテロクロマチンは染色体の腕を通して局所化し、主に発達的に沈黙した遺伝子7、8から構成される。メタフェーズ細胞におけるヘテロクロマチンブロックの免疫染色、または相間細胞におけるヘテロクロマチン凝集体の観察は、ヘテロクロマティック領域9の形成および機能の理解において多くの光を明らかにした。
モデルシステムとしてのショウジョウバエの使用により、電子顕微鏡10を使用せずにヘテロクロマチンを研究するための必須ツールの開発が可能になった。HP1aなどのヘテロクロマチン関連タンパク質の位置効果変化や発見、ヒストン翻訳後修飾の記述以来、多くのグループはこれらの異球領域10,11の可視化を可能にするいくつかの免疫組織化学的手法を開発してきた。
これらの技術は、ヘテロクロマチン関連タンパク質またはヒストンマークを認識する特定の抗体の使用に基づいています。細胞の種類や抗体ごとに、固定および透過性の条件を経験的に決定する必要があります。また、スカッシュ技術などの追加の機械的プロセスを使用する場合にも条件が異なる場合があります。このプロトコルでは、ショ ウジョウバエ 唾液腺を用いて異血球性病巣を研究することを説明する。唾液腺は、ゲノムの1,000部以上を含む多着細胞を有しており、衛星DNAおよび複製中の一部の異血球領域を除いて、クロマチンの特徴の大部分を増幅したビューを提供する。それにもかかわらず、ヘテロクロマチン領域はポリテーン染色体製剤で容易に可視化されるが、スカッシュ技術は、特徴的なクロマチン結合複合体またはクロマチンアーキテクチャを破壊する場合がある。したがって、唾液腺組織全体におけるタンパク質の免疫局在化は、これらの望ましくない効果を上回る可能性がある。我々は、いくつかのクロマチン結合タンパク質を検出するためにこのプロトコルを使用しており、我々は、変異型 ショウジョウバエ 株と組み合わせたこのプロトコルは、ヘテロクロマチン破壊12を研究するために使用することができることを実証した。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen MCT-150-C</td>
			<td>11351904</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF1 Citifluor</td>
			<td>Ted pella</td>
			<td>19470</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735078001</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free 
			protease inhibitors</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5892953001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS285022-200EA</td>
			<td>22x22, brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>d9779</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Gold seal</td>
			<td>3011</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>Baker</td>
			<td>0084-01</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K9me3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>8889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP1a</td>
			<td>Hybridoma Bank</td>
			<td>C1A9</td>
			<td>Product Form&#160;Concentrate 0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Baker</td>
			<td>3040-01</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Baker</td>
			<td>9070-03</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-687-12Q</td>
			<td>&#160;Labquake Tube Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Mixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13527550</td>
			<td>SmartBlock 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>648311</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>100 mL, brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610710</td>
			<td>25 mL, brand not critical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescent staining for visualization of heterochromatin associated proteins in drosophila salivary glands

免疫染色によるヘテロクロマチン凝集体の可視化は困難な場合があります。クロマチンの多くの哺乳類成分は、ショ ウジョウバエのメラノガスター で保存されている。したがって、ヘテロクロマチンの形成とメンテナンスを研究するための優れたモデルです。 第3インスター D.メラノガスター 幼虫の唾液腺に見られるような多テン化された細胞は、クロマチンが1000回近く増幅するのを観察するための優れたツールを提供し、研究者は核中のヘテロクロマチンの分布の変化を研究することを可能にしました。ヘテロクロマチン成分の観察はポリテーン染色体製剤で直接行うことができるが、一部のタンパク質の局在化は治療の重症度によって変化する可能性がある。したがって、細胞内のヘテロクロマチンの直接可視化は、この種の研究を補完する。本プロトコルでは、この組織に用いられる免疫染色技術、二次蛍光抗体の使用、および共焦点顕微鏡を用いて、これらのヘテロクロマチン凝集体をより精密かつ詳細に観察する方法について述べる。

ショウジョウバエ唾液腺におけるHP1a免疫染色の代表的な結果を図1に示す。肯定的な結果は、1つの焦点(図1a)(不均一な凝集または凝縮物)を観察する。負の結果は信号または分散信号ではありません。二重信号、つまり二重点(図1c)を観測できる場合がありますが、通常は少量で発生します。
データ?...

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Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

このプロトコルは、ショ ウジョウバエ ポリテン細胞のヘテロクロマチン集合体を可視化することを目的としている。

ショ ウジョウバエ 唾液腺におけるヘテロクロマチン関連タンパク質の可視化のための免疫蛍光染色

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...

このプロトコルの目的は、ショウジョウバエ細胞におけるヘテロクロマチン集合体を可視化することである。これを達成するために、我々は第三のインスター幼虫の唾液腺に見られるポリテン細胞を使用するこれらの細胞のゲノムはほぼ千回増幅され、染色体は界面細胞の特徴を保存する。彼らは明確に定義されたテロメアを持っており、すべてのセントロメレスが凝集するクロモセンターと呼ばれる橋があり、それは主にヘテロクロマティックです。第3のインスター幼虫組織を用いて、異なる遺伝子変異体の背景における異血球性凝集体の変化を評価することもできる。第3のインスター幼虫培養を最適化するには、まず5〜10日の成人を収集し、標準メディアの広い首のボトルに50の周りを入れる必要があります。男性25名、女性25名。ボトルを25°Cの温度インキュベーターに12時間置きます。インキュベーション時間が経過したら、成人を取り除き、新しいボトルに移して手順を繰り返します。胚を摂氏18度で22時間成長させてください。幼虫の収集のために、あなたはあからさまな球形を持っていない放浪幼虫を、選択することを確認してください。15組の唾液腺を解剖するか、顕微鏡下で抗議阻害剤を持つ冷たいPBSで30分の期間にできるだけ多くを解剖する。唾液腺を氷冷PBSで別のチューブに移します。冷たいPBSプラス抗議阻害剤で一度洗います。覚えておいてください、常に組織がチューブの底に達するのを待ちます。最後のステップからPBSを取り除いた後、1つのX群ガム固定バッファーと50%メタノール+2%ホルムアルデヒドを直接0.5ミリリットル加えます。穏やかな回転で摂氏4度で2時間インキュベートする。トリストリトンバッファーで5分間の回転洗浄を1回行い、1ミリリットルを加えます。常に組織がチューブの底に到達するのを待ちます.注:組織がチューブの底に到達するのを待ちます。上記と同じトリストリトンに加えて、軽度の揺れで摂氏37度で2時間、唾液腺をインキュベートします。BO3バッファーで洗浄し、15分間軽度の揺れで37°CでBO3プラス10ミリモルDTTでインキュベートします。インキュベーション期間の終わりに、1ミリリットルのBO3バッファー単独で洗浄を行う。唾液腺を1ミリリットルの緩衝Bで室温で2時間回転してインキュベートする。すべてのバッファーBを取り外し、目的のバッファーAプラス抗体を追加します。この場合、私たちはイリジウム銀行からHP 1、A C 1 8 9を使用します。回転で4度で一晩で3,000で1。この時点で、揺れが気泡を発生しないことが重要であり、抗体に損傷を与える可能性があります。バッファーBで15分の洗剤を与え、室温で攪拌するごとに1ミリメートルを使用します。腺は、二次抗生物質カップルと一緒にバッファBに移され、4度の回転下で2時間参照する。このステップでは、二次抗体を光から保護するために、チューブをアルミ製の箔で覆うことが重要です。室温で2x15分のワッシャーを行い、シドックスやOHなどのDNAマーカーを用いて1ミリリットルのバッファーB.Incubateで回転させ、室温で1ミリリットルのバッファーBに1ミリリットルに溶解し、回転させます。バッファーBで1回洗浄し、PBSで1回、室温で回転しながら10分間洗浄します。最後に、唾液腺をスライドに取り付け、カバースリップ付きのプールを作ります。唾液腺をプールの真ん中に入れ、シディブラーで覆います。気泡の変形を避けるために、粘性液体をあちこちに伸ばす。その後、すべてのスライドを透明なマニキュアで密封します。蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で観察します。同じ日にサンプルが観測されない場合は、光から4度で保存します。ショウジョウバエ唾液腺におけるHB1単染色の代表的な結果は、図1に示されている。肯定的な結果は、A、アテロ色集または凝縮物のような1つの焦点点を観察することです。負の結果は信号または分散信号ではありません。Cでは二重点のように二重信号が観測されることもありますが、通常は少量で発生します。それらが棒グラフとして表すことができるデータを分析するために、異なる変異背景を持つHP1の分布を比較する。例えば、図2では、98%の核が1点の分布を示していることがわかります。そして、野生型の2つの病巣の2%。変異体において、割合が変化し、かつ2つの病巣の存在が40%に増加した図3は、単染色における代表的なトリメチル化リジン9H3を示す。ショウジョウバエ唾液腺がBの1つの焦点を観察する結果、それは色凝集体または凝縮物で有利な結果であり、Cの二重または三重の信号はまれに見られるが、少量である。このプロトコルの最後に、状態制限にもかかわらずHP1タンパク質のジアクロマチック凝縮物を見ることができるでしょう、それは良い最初のアプローチになるでしょう。

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

AEから中腸と唾液腺の解剖。ネッタイシマカ蚊

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

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Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

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A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

のアイ成虫原基の可視化を支援するために新しいRFPレポーターショウジョウバエ</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAÃƒÅ½Ã¢â‚¬Â41

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Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

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の解剖と染色ショウジョウバエ幼虫卵巣

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Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

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でGFP標識タンパク質のイメージングを生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵母細胞

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In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

筋幹細胞におけるオートファジーのin situ Immunofluorescent Staining

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

細胞膜の末梢関連タンパク質の分割の決定

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

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全取り付ける染色を用いた 3 D 白色脂肪組織構造の可視化

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Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

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ショウジョウバエ幼虫における大鼻細胞の解剖と脂質液滴染色

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ショ ウジョウバエ 唾液腺におけるヘテロクロマチン関連タンパク質の可視化のための免疫蛍光染色

ショウジョウバエ唾液腺におけるヘテロクロマチン関連タンパク質の可視化のための免疫蛍光染色