Name: immunofluorescent staining for visualization of heterochromatin associated proteins in drosophila salivary glands
Uploaded: 2021-08-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands at JoVE.com

우리는 공초점 이미지의 일부를 복용 마르코 안토니오 로살레스 베가와 아벨 세구라, 미디어 준비를위한 카르멘 무뇨스 박사와 박사 아르투로 피멘텔, M.C. 안드레스 사라레기, 현미경의 사용에 대한 조언을 LMNA에서 크리스 우드 박사에게 감사드립니다.

1. 제3회 인스타 애벌레 문화
<ol><li>효모 100g, 정제되지 않은 통지팡이 설탕 100g, 한천 16g, 프로피오닉산 10mL, 젤라틴 14g을 추가하여 표준 미디어 1리터를 준비합니다. 효모를 제외한 모든 재료를 수돗물 800mL에 녹인 다음 효모를 녹입니다. 즉시 30분 동안 오토클레이브.<ol>
<li>그 후, 미디어를 60°C로 식히고 최종 농도0.01%에 프로피오닉산을 첨가하게 한다. 젤라틴이 형성될 때까지 병을 방치하십시오....

<ol>
	<li>Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emil+Heitz,+a+true+epigenetics+pioneer.">Emil Heitz, a true epigenetics pioneer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572 (2019).</li><li>Irick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+function+for+heterochromatin.">A new function for heterochromatin.</a> Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).</li><li>Kasinathan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovation+of+heterochromatin+functions+drives+rapid+evolution+of+essential+ZAD-ZNF+genes+in+Drosophila.">Innovation of heterochromatin functions drives rapid evolution of essential ZAD-ZNF genes in Drosophila.</a> Elife. , 1-31 (2020).</li><li>Lifschytz, E., Hareven, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+markers:+Arrangement+of+obligatory+heterochromatin,+histone+genes+and+multisite+gene+families+in+the+interphase+nucleus+of+D.+melanogaster.">Heterochromatin markers: Arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster.</a> Chromosoma. 86 (4), 443-455 (1982).</li><li>Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1a:+A+structural+chromosomal+protein+regulating+transcription.">HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription.</a> Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).</li><li>Lee, Y. C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericentromeric+heterochromatin+is+hierarchically+organized+and+spatially+contacts+H3K9me2+islands+in+euchromatin.">Pericentromeric heterochromatin is hierarchically organized and spatially contacts H3K9me2 islands in euchromatin.</a> PLoS Genetics. 16 (3), 1-27 (2020).</li><li>Koryakov, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUUR+protein+is+involved+in+binding+of+SU+(VAR)3-9+and+methylation+of+H3K9+and+H3K27+in+chromosomes+of+Drosophila+melanogaster.">The SUUR protein is involved in binding of SU (VAR)3-9 and methylation of H3K9 and H3K27 in chromosomes of Drosophila melanogaster.</a> Chromosome Research. 19 (2), 235-249 (2011).</li><li>Cao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Histone+H3+Lysine+27+Methylation+in+Polycomb-Group+Silencing.">Role of Histone H3 Lysine 27 Methylation in Polycomb-Group Silencing.</a> Science. 298 (5595), 1039 (2002).</li><li>Hines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domains+of+heterochromatin+protein+1+required+for+Drosophila+melanogaster+heterochromatin+spreading.">Domains of heterochromatin protein 1 required for Drosophila melanogaster heterochromatin spreading.</a> Genetics. 182 (4), 967-977 (2009).</li><li>Elgin, S. C. R., Reuter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position-effect+variegation,+heterochromatin+formation,+and+gene+silencing+in+Drosophila.">Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (8), 1-26 (2013).</li><li>Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1a:+A+structural+chromosomal+protein+regulating+transcription.">HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription.</a> Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).</li><li>Meyer-Nava, S., Torres, A., Zurita, M., Valadez-graham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+effects+of+dADD1+misexpression+in+chromatin+organization+and+transcription.">Molecular effects of dADD1 misexpression in chromatin organization and transcription.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 2, 1-17 (2020).</li><li>Tennessen, J. M., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+growth+and+maturation+-+Insights+from+drosophila.">Coordinating growth and maturation - Insights from drosophila.</a> Current Biology. 21 (18), 750-757 (2011).</li><li>Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+drosophila+polytene+chromosome+squashes+for+antibody+labeling.">Preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), 1-4 (2010).</li><li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66 (1967), 57-80 (1981).</li><li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+droplet+formation+by+HP1&#945;+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin.">Liquid droplet formation by HP1&#945; suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).</li><li>Larson, A. G., Narlikar, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Phase+Separation+in+Heterochromatin+Formation,+Function,+and+Regulation.">The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation.</a> Biochemistry. 57 (17), 2540-2548 (2018).</li><li>Keenen, M. M., Larson, A. G., Narlikar, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+Quantitation+of+Phase-Separated+Droplet+Formation+by+Human+HP1&#945;.">Visualization and Quantitation of Phase-Separated Droplet Formation by Human HP1&#945;.</a> Methods in Enzymology. , (2018).</li><li>Lu, B. Y., Emtage, P. C., Duyf, B. J., Hilliker, a. J., Eissenberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+protein+1+is+required+for+the+normal+expression+of+two+heterochromatin+genes+in+Drosophila.">Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila.</a> Genetics. 155 (2), 699-708 (2000).</li><li>Marsano, R. M., Giordano, E., Messina, G., Dimitri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Portrait+of+Constitutive+Heterochromatin:+Lessons+from+Drosophila+melanogaster.">A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster.</a> Trends in Genetics. , (2019).</li><li>Strom, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+drives+heterochromatin+domain+formation.">Phase separation drives heterochromatin domain formation.</a> Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).</li><li>Sanulli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1+reshapes+nucleosome+core+to+promote+phase+separation+of+heterochromatin.">HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin.</a> Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).</li><li>Dialynas, G., Delabaere, L., Chiolo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+and+Unc45+maintain+heterochromatin+stability+in+Drosophila+polytene+chromosomes.">Arp2/3 and Unc45 maintain heterochromatin stability in Drosophila polytene chromosomes.</a> Experimental Biology and Medicine. 244 (15), 1362-1371 (2019).</li><li>Kolesnikova, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+decondensation+of+heterochromatin+in+drosophila+melanogaster+polytene+chromosomes+under+condition+of+ectopic+expression+of+the+supressor+of+underreplication+gene.">Induced decondensation of heterochromatin in drosophila melanogaster polytene chromosomes under condition of ectopic expression of the supressor of underreplication gene.</a> Fly. 5 (3), 181-190 (2011).</li><li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122 (8), 2517-2527 (1996).</li><li>Messina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeti,+an+essential+Drosophila+melanogaster+gene,+encodes+a+protein+required+for+chromatin+organization.">Yeti, an essential Drosophila melanogaster gene, encodes a protein required for chromatin organization.</a> Journal of Cell Science. 127 (11), 2577-2588 (2014).</li><li>Aguilar-Fuentes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p8/TTDA+overexpression+enhances+UV-irradiation+resistance+and+suppresses+TFIIH+mutations+in+a+Drosophila+trichothiodystrophy+model.">p8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model.</a> PLOS Genetics. 4 (11), 1-9 (2008).</li><li>Reynaud, E., Lomeli, H., Vazquez, M., Zurita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+Homologue+of+the+Xeroderma+Pigmentosum+D+Gene+Product+Is+Located+in+Euchromatic+Regions+and+Has+a+Dynamic+Response+to+UV+Light-induced+Lesions+in+Polytene+Chromosomes.">The Drosophila melanogaster Homologue of the Xeroderma Pigmentosum D Gene Product Is Located in Euchromatic Regions and Has a Dynamic Response to UV Light-induced Lesions in Polytene Chromosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 10 (4), 1191-1203 (1999).</li><li>Farka&#353;, R., Mechler, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+timing+of+Drosophila+salivary+gland+apoptosis+displays+an+I+(2)gl-dose+response.">The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays an I (2)gl-dose response.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 7 (1), 89-101 (2000).</li><li>Zhang, P., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+salivary+gland+chromocenter+contains+highly+polytenized+subdomains+of+mitotic+heterochromatin.">The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin.</a> Genetics. 139 (2), 659-670 (1995).</li><li>Stormo, B. M., Fox, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyteny:+still+a+giant+player+in+chromosome+research.">Polyteny: still a giant player in chromosome research.</a> Chromosome Research. 25 (3-4), 201-214 (2017).</li></ol>

진핵 생물의 세포 기능은 크로마티닌과 RNA를 포함한 다양한 분자와의 상호 작용에 의해 지원되는 핵 내의 3D 구조를 정의할 수 있다. 지난 3년 동안 이종로크로마틴을 포함한 관련성이 있는 생물학적 응축수들은 활성 및 억압적인 크로마틴 16,17,18의뚜렷한 핵 공간 조직을 촉진하는 위상 분리 의 결정에 근본적인 역할을수행했다.</su...

에밀 헤이츠1의초기 연구 이후, 이종학은 염색체의 유전자 발현, 메이오틱 및 미토틱 분리, 게놈 안정성2,3,4의 유지 와 같은 세포 과정의 중요한 레귤레이터로 간주되었다.
이종로크로마티닌은 주로 반복적인 시퀀스를 정의하는 구성이종, 텔로미어 및 원로메머와 같은 특정 염색체 부위에 존재하는 전이 가능한 요소의 두 가지 유형으로 나뉩니다. 이 종족의 이종은 주로 히스톤 H3(H3K9me3)의 리신 9의 디 또는 트라이메틸화와 헤테로크로마티틴 단백질 1a(HP1a)5,6의결합과 같은 특정 히스톤 마크에 의해 후성유전학적으로 정의된다. 한편, 이종은 염색체의 팔을 통해 국소화되며 주로 발달침묵유전자7,8로구성된다. 전상 세포에서 이종로크로마틴 블록의 면역 염색, 또는 단계 간 세포에서 이종로크로마티닌 골재의 관찰, 이종학 영역9의 형성 및기능에 대한 이해에 많은 빛을 공개했다.
드로소필라를 모델 시스템으로 사용하면 전자 현미경검사법(10)을사용하지 않고 이종로크로마티닌을 연구할 수 있는 필수 도구의 개발이 허용되었다. 위치 효과 의 설명 다양화 및 HP1a와 같은 이종로크로마틴 관련 단백질의 발견 이후, 많은 그룹은 이러한 이종 영역의 시각화를 허용하는 여러 면역 조직 화학 적 기술을개발했다 10,11.
이러한 기술은 이종로크로마틴 관련 단백질 또는 히스톤 마크를 인식하는 특정 항체의 사용에 기초한다. 모든 세포 유형 및 항체에 대해 고정 및 투과성 조건은 경험적으로 결정되어야 합니다. 또한 스쿼싱 기술과 같은 추가 기계적 공정이 사용되는 경우 조건이 다를 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 이종적 인 포시를 공부하기 위해 Drosophila 타액 땀샘의 사용을 설명합니다. 살리보리 땀샘은 게놈의 1,000부 이상을 포함하는 다원화 세포를 가지고 있어, 따라서 위성 DNA와 복제되는 일부 이종 영역을 제외하고 대부분의 크로마틴 특징에 대한 증폭된 전망을 제공한다. 그럼에도 불구하고 이종염색체 영역은 폴리텐 염색체 제제로 쉽게 시각화되지만 스쿼시 기술은 때때로 특징적인 크로마틴 바운드 복합체 또는 크로마틴 아키텍처를 방해할 수 있습니다. 따라서 침선 조직 전체에서 단백질의 면역 지역화는 이러한 원치 않는 효과를 능가할 수 있습니다. 우리는 몇몇 크로마틴 바운드 단백질을 검출하기 위하여 이 프로토콜을 이용하고, 우리는 돌연변이 Drosophila 주식과 결합된 이 프로토콜이 이종로크로마틴 중단12를연구하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 보여주었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen MCT-150-C</td>
			<td>11351904</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF1 Citifluor</td>
			<td>Ted pella</td>
			<td>19470</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735078001</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free 
			protease inhibitors</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5892953001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS285022-200EA</td>
			<td>22x22, brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>d9779</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Gold seal</td>
			<td>3011</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>Baker</td>
			<td>0084-01</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K9me3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>8889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP1a</td>
			<td>Hybridoma Bank</td>
			<td>C1A9</td>
			<td>Product Form&#160;Concentrate 0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Baker</td>
			<td>3040-01</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Baker</td>
			<td>9070-03</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-687-12Q</td>
			<td>&#160;Labquake Tube Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Mixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13527550</td>
			<td>SmartBlock 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>648311</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>100 mL, brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610710</td>
			<td>25 mL, brand not critical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescent staining for visualization of heterochromatin associated proteins in drosophila salivary glands

면역 염색에 의한 이종로크로마틴 골재의 시각화는 어려울 수 있습니다. 크로마틴의 많은 포유류 성분은 드로소필라 멜라노가스터에 보존된다. 따라서 이종로크로마티닌 형성 및 유지보수를 연구하는 우수한모델이다. 제3의 별D. 멜라노가스터 유충의 타액선에서 발견되는 것과 같은 다각화된 세포는 크로마틴을 거의 천 번 증폭시키는 것을 관찰하는 훌륭한 도구를 제공하고 연구자들은 핵에서 이종로크로마틴의 분포변화를 연구할 수 있게 하였다. 이종염색로마티신 성분의 관찰은 폴리텐 염색체 제제에서 직접 수행될 수 있지만, 일부 단백질의 국소화는 치료의 중증도에 의해 변경될 수 있다. 따라서, 세포에서 이종로크로마틴의 직접적인 시각화는 이러한 유형의 연구를 보완한다. 이 프로토콜에서, 우리는 이 조직에 사용된 면역 염색 기술, 이차 형광 항체의 사용 및 더 중대한 정밀도 및 세부사항으로 이 이 이종로막골을 관찰하기 위하여 공초점 현미경 검사법을 기술합니다.

드로소필라 타액선에서 HP1a 면역염색의 대표적인 결과가 도 1에도시된다. 긍정적인 결과는 하나의 초점(도1a)(이종골골재 또는 응축수)을 관찰하는 것이다. 음의 결과는 신호나 분산된 신호가 아닙니다. 때로는 이중 신호를 관찰 할 수 있습니다, 즉, 이중 점(도 1c)와함께, 그러나 일반적으로 작은 양에서 발생합니다.
<p cla...

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Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

이 프로토콜은 드로소필라 폴리텐 세포에서 이종로크로마틴 골재를 시각화하는 것을 목표로 한다.

드로소필라 살리바리 땀샘의 이종로크로마티닌 관련 단백질의 시각화를 위한 면역형성 염색

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...

이 프로토콜의 목적은 드로소필라 세포에서 이종로크로마틴 골재를 시각화하는 것입니다. 이를 달성하기 위해, 우리는 이 세포의 게놈이 거의 천 번 증폭되고, 염색체는 인터페이스 세포의 특징을 보존하는 제 3 개의 인스타 애벌레의 타액 선지에서 발견되는 폴리텐 세포를 사용합니다. 그들은 잘 정의 된 텔로미어를 가지고 있으며, 모든 센트로메어가 집계되는 염색체라고 불리는 다리는 주로 이종학적입니다.세 번째 인스타 애벌레 조직을 사용하여, 또한 우리가 다른 유전 돌연변이의 배경에 있는 이종학 골재에 있는 변경을 평가하는 것을 허용합니다. 세 번째 인스타 애벌레 문화를 최적화하려면 먼저 5~10일 의 노인을 모으고 표준 미디어의 넓은 목 병에 약 50점을 넣어야 합니다. 남성 25명, 여성 25명.12시간 동안 25°C의 온도 인큐베이터에 병을 놓습니다. 잠복기 시간이 끝나면 성인을 제거하고 새 병으로 옮겨 절차를 반복하십시오. 배아는 22 시간 동안 섭씨 18도에서 자라고하십시오.애벌레 컬렉션의 경우 구형이 과도하게 없는 방황하는 애벌레를 선택해야 합니다. 15쌍의 타액선 또는 감기 PBS에서 30분 동안 현미경으로 항의 억제제로 해부하십시오. 타액 땀샘을 얼음 차가운 PBS로 다른 튜브로 옮긴다.차가운 PBS 플러스 시위 억제제로 한 번 세척하십시오. 기억, 항상 조직이 튜브의 바닥에 도달 할 때까지 기다립니다. 마지막 단계에서 PBS를 제거한 후 X 그룹 검 고정 버퍼 1개와 2%포름알데히드의 0.5 밀리리터를 직접 추가합니다.가벼운 회전으로 섭씨 4도에서 2 시간 동안 배양하십시오. 트리스 트리톤 버퍼로 5분 회전 세척을 수행하여 밀리리터 1개를 추가합니다. 항상 조직이 튜브의 바닥에 도달 할 때까지 기다립니다.참고: 조직이 튜브 의 바닥에 도달 할 때까지 기다립니다. 위와 같은 트리스 트리톤과 타액 땀샘을 37도에서 2시간 동안 1%의 베타 메르카토에탄올과 함께 배양합니다. BO3 버퍼로 세척하고 BO3 + 10 밀리모어 DTT로 15 분 동안 가벼운 흔들림으로 10 밀리모어 DTT로 배양하십시오.인큐베이션 기간이 끝나면 BO3 버퍼 1밀리리터만으로 세척을 수행합니다. 타액 땀샘을 완충 B의 1밀리리터로 배양하여 실온에서 2시간 동안 회전합니다. 모든 버퍼 B를 제거하고 버퍼 A 플러스 관심 있는 항체를 추가합니다.이 경우, 우리는 이리듐 은행에서 HP 하나, A C 1 8 9를 사용합니다. 3에서 1, 회전과 4도에서 밤에 000. 이 시점에서 흔들림은 항체를 손상시킬 수 있는 거품을 일으키지 않는 것이 중요합니다.버퍼 B로 15분간 세척하고, 실온에서 매번 1밀리미터를 사용하여 저어줍니다. 땀샘은 4도에서 회전하에 2 시간 동안 참조 바닥에 보조 항생제 부부와 함께 버퍼 B로 전송됩니다. 이 단계에서는 알루미늄 종이 호일로 튜브를 덮어 이차 항체를 빛으로부터 보호하는 것이 중요합니다.실온에서 2x15 분 와셔를 수행하고, Sydox 또는 OH와 같은 DNA 마커가있는 완충 B.Incubate 1 밀리리터로 회전하고 회전시 실온에서 10 분 동안 완충 B의 1 밀리리터로 용해하십시오. 완충 B로 한 번 세척하고 PBS로 한 번, 각 세척은 실온에서 회전하면서 10 분 동안 지속됩니다. 마지막으로, 미끄러짐에 타액땀샘을 장착하여 덮개가 달린 수영장을 만듭니다.침샘을 수영장 한가운데에 놓고 시디플로르로 덮습니다. 거품의 변형을 피하기 위해 점성 액체를 여기저기 확장하십시오. 그런 다음 모든 슬라이드를 명확한 매니큐어로 밀봉하십시오.형광 또는 공초점 현미경으로 관찰하십시오. 샘플이 같은 날에 관찰되지 않을 경우 빛에서 4도에서 저장합니다. 드로소필라 살리보샘에서 HB1 단색염의 대표적인 결과가 그림 하나에 나타난다.긍정적인 결과는 A, 체형 골재 또는 응축수와 같은 하나의 초점점을 관찰하는 것입니다. 음의 결과는 신호나 분산된 신호가 아닙니다. 때로는 이중 신호를 C의 이중 점처럼 관찰 할 수 있지만 일반적으로 소량에서 발생합니다.데이터를 분석하려면 HP1분포를 다른 돌연변이 배경과 비교하여 막대 그래프로 나타낼 수 있습니다. 예를 들어, 그림 2에서, 우리는 핵의 98%가 1점의 분포를 제시하는 것을 볼 수 있다. 그리고 야생 유형의 두 초점의 2 %.돌연변이체에서, 비율이 변경되고, 2개의 포시의 존재가 40%로 증가하여 3개의 대표적인 트리메틸레이션 리신 9H3을 모노스테인딩으로 나타낸다. B의 한 초점을 관찰하는 Drosophila 침샘의 결과, 그것은 색채 골재 또는 응축수에서 유리한 결과, C의 이중 또는 삼중 신호는 드문 경우에 볼 수 있지만, 소량. 이 프로토콜의 끝에서, 당신은 상태 제한에도 불구하고 HP1 단백질의 다이아진 응축수를 볼 수있을 것입니다, 그것은 좋은 첫 번째 접근 방식이 될 것입니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

애에서 Midgut과 침샘의 해부. aegypti 모기

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

연구

생물학

Staining Proteins in Gels

젤의 단백질 염색법

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

에있는 아이 Imaginal 디스크의 시각화에 도움을 소설 RFP 리포터 Drosophila</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAÃƒÅ½Ã¢â‚¬Â41

의 정화 M. magneticum 스트레인 AMB - 1 Magnetosome 관련 단백질 MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

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해부 그리고 스테 이닝 Drosophila 애벌레 난소

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

에 GFP-라벨 단백질의 영상을 라​​이브<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocytes

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

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근육 줄기 세포에서 Autophagy의 원위치 Immunofluorescent 얼룩

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

원형질 막 주변 관련 된 단백질에 대 한 분할 결정

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

전체-마운트 얼룩을 사용 하 여 3D 백색 지방 조직 구조의 시각화

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

초파리 유충에 있는 Oenocytes의 해부 그리고 지질 물방울 염색

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...