Name: immunofluorescent staining for visualization of heterochromatin associated proteins in drosophila salivary glands
Uploaded: 2021-08-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands at JoVE.com

Мы благодарим Марко Антонио Росалес Вега и Абеля Сегуру за то, что они сделали некоторые из конфокальных изображений, Кармен Муньос за подготовку к сми и доктора Артуро Пиментеля, М.C Андреса Саралеги и доктора Криса Вуда из LMNA за советы по использованию микроскопов.

1. Третья культура личинок
<ol><li>Приготовить 1 л стандартной среды, добавив 100 г дрожжей, 100 г нерафинированного цельного тростникового сахара, 16 г агара, 10 мл пропионовой кислоты и 14 г желатина. Растворите все ингредиенты, кроме дрожжей, в 800 мл водопроводной воды, а затем растворите дрожжи....

<ol>
	<li>Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emil+Heitz,+a+true+epigenetics+pioneer.">Emil Heitz, a true epigenetics pioneer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572 (2019).</li><li>Irick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+function+for+heterochromatin.">A new function for heterochromatin.</a> Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).</li><li>Kasinathan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovation+of+heterochromatin+functions+drives+rapid+evolution+of+essential+ZAD-ZNF+genes+in+Drosophila.">Innovation of heterochromatin functions drives rapid evolution of essential ZAD-ZNF genes in Drosophila.</a> Elife. , 1-31 (2020).</li><li>Lifschytz, E., Hareven, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+markers:+Arrangement+of+obligatory+heterochromatin,+histone+genes+and+multisite+gene+families+in+the+interphase+nucleus+of+D.+melanogaster.">Heterochromatin markers: Arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster.</a> Chromosoma. 86 (4), 443-455 (1982).</li><li>Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1a:+A+structural+chromosomal+protein+regulating+transcription.">HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription.</a> Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).</li><li>Lee, Y. C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericentromeric+heterochromatin+is+hierarchically+organized+and+spatially+contacts+H3K9me2+islands+in+euchromatin.">Pericentromeric heterochromatin is hierarchically organized and spatially contacts H3K9me2 islands in euchromatin.</a> PLoS Genetics. 16 (3), 1-27 (2020).</li><li>Koryakov, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUUR+protein+is+involved+in+binding+of+SU+(VAR)3-9+and+methylation+of+H3K9+and+H3K27+in+chromosomes+of+Drosophila+melanogaster.">The SUUR protein is involved in binding of SU (VAR)3-9 and methylation of H3K9 and H3K27 in chromosomes of Drosophila melanogaster.</a> Chromosome Research. 19 (2), 235-249 (2011).</li><li>Cao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Histone+H3+Lysine+27+Methylation+in+Polycomb-Group+Silencing.">Role of Histone H3 Lysine 27 Methylation in Polycomb-Group Silencing.</a> Science. 298 (5595), 1039 (2002).</li><li>Hines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domains+of+heterochromatin+protein+1+required+for+Drosophila+melanogaster+heterochromatin+spreading.">Domains of heterochromatin protein 1 required for Drosophila melanogaster heterochromatin spreading.</a> Genetics. 182 (4), 967-977 (2009).</li><li>Elgin, S. C. R., Reuter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position-effect+variegation,+heterochromatin+formation,+and+gene+silencing+in+Drosophila.">Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (8), 1-26 (2013).</li><li>Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1a:+A+structural+chromosomal+protein+regulating+transcription.">HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription.</a> Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).</li><li>Meyer-Nava, S., Torres, A., Zurita, M., Valadez-graham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+effects+of+dADD1+misexpression+in+chromatin+organization+and+transcription.">Molecular effects of dADD1 misexpression in chromatin organization and transcription.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 2, 1-17 (2020).</li><li>Tennessen, J. M., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+growth+and+maturation+-+Insights+from+drosophila.">Coordinating growth and maturation - Insights from drosophila.</a> Current Biology. 21 (18), 750-757 (2011).</li><li>Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+drosophila+polytene+chromosome+squashes+for+antibody+labeling.">Preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), 1-4 (2010).</li><li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66 (1967), 57-80 (1981).</li><li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+droplet+formation+by+HP1&#945;+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin.">Liquid droplet formation by HP1&#945; suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).</li><li>Larson, A. G., Narlikar, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Phase+Separation+in+Heterochromatin+Formation,+Function,+and+Regulation.">The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation.</a> Biochemistry. 57 (17), 2540-2548 (2018).</li><li>Keenen, M. M., Larson, A. G., Narlikar, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+Quantitation+of+Phase-Separated+Droplet+Formation+by+Human+HP1&#945;.">Visualization and Quantitation of Phase-Separated Droplet Formation by Human HP1&#945;.</a> Methods in Enzymology. , (2018).</li><li>Lu, B. Y., Emtage, P. C., Duyf, B. J., Hilliker, a. J., Eissenberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+protein+1+is+required+for+the+normal+expression+of+two+heterochromatin+genes+in+Drosophila.">Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila.</a> Genetics. 155 (2), 699-708 (2000).</li><li>Marsano, R. M., Giordano, E., Messina, G., Dimitri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Portrait+of+Constitutive+Heterochromatin:+Lessons+from+Drosophila+melanogaster.">A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster.</a> Trends in Genetics. , (2019).</li><li>Strom, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+drives+heterochromatin+domain+formation.">Phase separation drives heterochromatin domain formation.</a> Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).</li><li>Sanulli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1+reshapes+nucleosome+core+to+promote+phase+separation+of+heterochromatin.">HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin.</a> Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).</li><li>Dialynas, G., Delabaere, L., Chiolo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+and+Unc45+maintain+heterochromatin+stability+in+Drosophila+polytene+chromosomes.">Arp2/3 and Unc45 maintain heterochromatin stability in Drosophila polytene chromosomes.</a> Experimental Biology and Medicine. 244 (15), 1362-1371 (2019).</li><li>Kolesnikova, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+decondensation+of+heterochromatin+in+drosophila+melanogaster+polytene+chromosomes+under+condition+of+ectopic+expression+of+the+supressor+of+underreplication+gene.">Induced decondensation of heterochromatin in drosophila melanogaster polytene chromosomes under condition of ectopic expression of the supressor of underreplication gene.</a> Fly. 5 (3), 181-190 (2011).</li><li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122 (8), 2517-2527 (1996).</li><li>Messina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeti,+an+essential+Drosophila+melanogaster+gene,+encodes+a+protein+required+for+chromatin+organization.">Yeti, an essential Drosophila melanogaster gene, encodes a protein required for chromatin organization.</a> Journal of Cell Science. 127 (11), 2577-2588 (2014).</li><li>Aguilar-Fuentes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p8/TTDA+overexpression+enhances+UV-irradiation+resistance+and+suppresses+TFIIH+mutations+in+a+Drosophila+trichothiodystrophy+model.">p8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model.</a> PLOS Genetics. 4 (11), 1-9 (2008).</li><li>Reynaud, E., Lomeli, H., Vazquez, M., Zurita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+Homologue+of+the+Xeroderma+Pigmentosum+D+Gene+Product+Is+Located+in+Euchromatic+Regions+and+Has+a+Dynamic+Response+to+UV+Light-induced+Lesions+in+Polytene+Chromosomes.">The Drosophila melanogaster Homologue of the Xeroderma Pigmentosum D Gene Product Is Located in Euchromatic Regions and Has a Dynamic Response to UV Light-induced Lesions in Polytene Chromosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 10 (4), 1191-1203 (1999).</li><li>Farka&#353;, R., Mechler, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+timing+of+Drosophila+salivary+gland+apoptosis+displays+an+I+(2)gl-dose+response.">The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays an I (2)gl-dose response.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 7 (1), 89-101 (2000).</li><li>Zhang, P., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+salivary+gland+chromocenter+contains+highly+polytenized+subdomains+of+mitotic+heterochromatin.">The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin.</a> Genetics. 139 (2), 659-670 (1995).</li><li>Stormo, B. M., Fox, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyteny:+still+a+giant+player+in+chromosome+research.">Polyteny: still a giant player in chromosome research.</a> Chromosome Research. 25 (3-4), 201-214 (2017).</li></ol>

Клеточная функция эукариотических организмов может определять 3D-структуру внутри ядра, которая поддерживается взаимодействиями между различными белками с хроматином и различными молекулами, включая РНК. В последние три года биологические конденсаты, которые имели отношение, в том ч?...

Начиная с ранних исследований Эмиля Хайца1,гетерохроматин считался важным регулятором клеточных процессов, таких как экспрессия генов, мейотическое и митотическое разделение хромосом и поддержание стабильности генома2,3,4.
Гетерохроматин в основном делится на два типа: конститутивный гетерохроматин, который характерно определяет повторяющиеся последовательности, и транспонируемые элементы, которые присутствуют в определенных участках хромосом, таких как теломеры и центромеры. Этот тип гетерохроматина в основном определяется эпигенетически специфическими гистоновыми метками, такими как ди- или триметилирование лизина 9 гистона H3 (H3K9me3) и связывание белка гетерохроматина 1a (HP1a)5,6. С другой стороны, факультативный гетерохроматин локализуется через руки хромосомы и состоит в основном из генов, заглушающих развитие7,8. Иммуноокрашивание блоков гетерохроматина в метафазных клетках или наблюдение за агрегатами гетерохроматина в межфазных клетках открыло много света в понимании формирования и функции гетерохроматических областей9.
Использование дрозофилы в качестве модельной системы позволило разработать необходимые инструменты для изучения гетерохроматина без использования электронной микроскопии10. С момента описания изменения эффекта положения и открытия гетерохроматин-ассоциированных белков, таких как HP1a, и постпереводных модификаций гистона многие группы разработали несколько иммуногистохимических методов, которые позволяют визуализировать эти гетерохроматическиеобласти 10,11.
Эти методы основаны на использовании специфических антител, которые распознают гетерохроматин-ассоциированные белки или гистоновые метки. Для каждого типа клеток и антител условия фиксации и пермеабилизации должны быть определены эмпирически. Кроме того, условия могут варьироваться, если используются дополнительные механические процессы, такие как методы раздавливания. В этом протоколе мы описываем использование слюнных желез Drosophila для изучения гетерохроматических очагов. Слюнные железы имеют политенизированные клетки, которые содержат более 1000 копий генома, что обеспечивает усиленное представление о большинстве особенностей хроматина, за исключением спутниковой ДНК и некоторых гетерохроматических областей, которые недостаточно реплицируются. Тем не менее, области гетерохроматина легко визуализируются в препаратах политеновых хромосом, но методы раздавливания могут иногда нарушать характерные хроматин-связанные комплексы или архитектуру хроматина. Поэтому иммунолокализация белков в целой ткани слюнных желез может превзойти эти нежелательные эффекты. Мы использовали этот протокол для обнаружения нескольких связанных с хроматином белков, и мы продемонстрировали, что этот протокол в сочетании с мутантными запасами дрозофилы может быть использован для изучения нарушения гетерохроматина12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen MCT-150-C</td>
			<td>11351904</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF1 Citifluor</td>
			<td>Ted pella</td>
			<td>19470</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735078001</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free 
			protease inhibitors</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5892953001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS285022-200EA</td>
			<td>22x22, brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>d9779</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Gold seal</td>
			<td>3011</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>Baker</td>
			<td>0084-01</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K9me3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>8889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP1a</td>
			<td>Hybridoma Bank</td>
			<td>C1A9</td>
			<td>Product Form&#160;Concentrate 0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Baker</td>
			<td>3040-01</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Baker</td>
			<td>9070-03</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-687-12Q</td>
			<td>&#160;Labquake Tube Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Mixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13527550</td>
			<td>SmartBlock 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>648311</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>100 mL, brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610710</td>
			<td>25 mL, brand not critical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescent staining for visualization of heterochromatin associated proteins in drosophila salivary glands

Визуализация агрегатов гетерохроматина путем иммуноокрашивания может быть сложной задачей. Многие компоненты хроматина у млекопитающих сохраняются в Drosophila melanogaster. Поэтому это отличная модель для изучения образования и поддержания гетерохроматина. Политенизированные клетки, такие как те, которые обнаружены в слюнных железах личинок третьей звезды D. melanogaster, обеспечивают отличный инструмент для наблюдения за усилением хроматина почти в тысячу раз и позволили исследователям изучить изменения в распределении гетерохроматина в ядре. Хотя наблюдение за компонентами гетерохроматина может проводиться непосредственно в политеновых хромосомных препаратах, локализация некоторых белков может быть изменена тяжестью лечения. Поэтому прямая визуализация гетерохроматина в клетках дополняет этот вид исследования. В этом протоколе мы описываем методы иммуноокрашения, используемые для этой ткани, использование вторичных флуоресцентных антител и конфокальную микроскопию для наблюдения этих гетерохроматиновых агрегатов с большей точностью и детализацией.

Репрезентативные результаты иммуноокрашивания HP1a в слюнных железах Drosophila показаны на рисунке 1. Положительным результатом является наблюдение одной фокусной точки(рисунок 1а)(гетерохроматический агрегат или конденсат). Отрицательным результатом ...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands at JoVE.com

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Этот протокол направлен на визуализацию агрегатов гетерохроматина в клетках Drosophila polytene.

Иммунофлуоресцентное окрашивание для визуализации гетерохроматиновых ассоциированных белков в слюнных железах дрозофилы

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...

Целью этого протокола является визуализация агрегатов гетерохроматина в клетках дрозофилы. Для этого мы используем политеновые клетки, которые находятся в слюнных железах личинок третьей звезды Геном этих клеток амплифицируется почти в тысячу раз, а хромосомы сохраняют особенности интерфейсных клеток. Они имеют четко определенные теломеры и мосты, называемые хромоцентрами, в которых все центромеры агрегируются, и это в основном гетерохроматически.Использование ткани личинок третьей звезды также позволяет оценить изменение гетерохроматических агрегатов в различных генетических мутантах. Чтобы оптимизировать культуру личинок третьей звезды, вам нужно будет сначала собрать взрослых особей в возрасте от 5 до 10 дней и поместить около 50 в бутылку с широким горлышком стандартного носителя. 25 мужчин и 25 женщин.Поместите бутылку в инкубатор с контролируемой температурой при 25 градусах Цельсия в течение 12 часов. После того, как время инкубации закончится, удалите взрослых и перенесите их в новый флакон, чтобы повторить процедуру. Дайте эмбрионам вырасти при 18 градусах Цельсия в течение 22 часов.Для сбора личинок убедитесь, что вы выбрали блуждающих личинок, которые не имеют явных сферических. Рассекните 15 пар слюнных желез или столько, сколько сможете за 30 минут периода в холодном PBS с ингибиторами протеста под микроскопом. Перенесите слюнные железы в другую трубку с ледяным холодом PBS.Мойте один раз с холодным PBS плюс ингибиторы протестов. Помните, всегда ждите, пока ткань достигнет дна трубки. После удаления PBS с последней ступени добавьте непосредственно 0,5 миллилитра одного буфера фиксации смолы X-группы и 50% метанола плюс 2% формальдегида.Инкубировать в течение двух часов при четырех градусах Цельсия с мягким вращением. Провести одну пятиминутную ротационную промывку с буфером Трис-Тритона, добавив один миллилитр. Всегда ждите, пока ткань достигнет дна трубки.Примечание: подождите, пока ткань достигнет дна трубки. Инкубировать слюнные железы Трис-Тритоном, таким же, как и выше, плюс 1% бета-меркаптоэтанола в течение двух часов при 37 градусах Цельсия с легким встряхиванием. Промыть буфером BO3 и инкубировать с BO3 плюс 10 миллимолярным DTT при 37 градусах Цельсия с легким встряхиванием в течение 15 минут.В конце инкубационного периода выполните промывку одним миллилитром только буфера BO3. Инкубируют слюнные железы в одном миллилитрах буфера В в течение двух часов при комнатной температуре с ротацией. Удалите весь буфер B и добавьте буфер A плюс интересующих антитела.В этом случае мы используем HP one, A C 1 8 9 от банка Iridium. 1 к 3 000 за ночь при четырех градусах с вращением. В этот момент важно, чтобы встряхивание не поднимало пузырьки, которые могут повредить антитело.Дать лакомство через 15 минут промыть буфером В, при перемешивании при комнатной температуре используя по одному миллиметру каждый раз. Железы переносятся в буфер В вместе со вторичной парой антибиотиков на пол в течение двух часов, при вращении на четыре градуса. На этом этапе важно покрыть трубку алюминиевой бумажной фольгой, чтобы защитить вторичное антитело от света.Проводят 2х15 минутные шайбы при комнатной температуре, при этом вращение с помощью одного миллилитра буфера B.Инкубируют с ДНК-маркером, таким как Sydox или OH, и растворяют в одном миллилитрах буфера B в течение 10 минут при комнатной температуре с вращением. Провести одну стирку с буфером B и один раз с PBS, каждая стирка длится 10 минут, при этом вращаясь при комнатной температуре. Наконец, установите слюнные железы на горку, сделав бассейн с крышкой.Поместите слюнные железы в середину бассейна и накройте Сидифлором. Чтобы избежать деформации пузырька, распространяйте вязкую жидкость по всему месту. Затем запечатайте все слайды прозрачным лаком для ногтей.Наблюдают под флуоресцентным или конфокальным микроскопом. Если образец не будет наблюдаться в тот же день, то храните от света при четырех градусах. Репрезентативные результаты моноокрашения HB1 в слюнных железах Drosophila показаны на рисунке один.Положительным результатом является наблюдение одной фокусной точки, как в А, атерохроматическом агрегате или конденсате. Отрицательным результатом является отсутствие сигнала или рассеянный сигнал. Иногда двойной сигнал может наблюдаться как двойная точка в С, но обычно встречается в меньших количествах.Для анализа данных их можно представить в виде гистограммы, сравнивающей распределение HP1 с различными мутантными фонами. Например, на рисунке втором мы видим, что 98% ядер представляют собой распределение одной точки. И 2% из двух очагов дикого типа.У мутанта пропорция изменилась, и наличие двух очагов увеличилось до 40%Рисунок третий показывает репрезентативное триметилирование лизина 9H3 в моноокрашении. Результат в drosophila слюнных желез наблюдается в одной фокусной точке в B, это благоприятный результат на хроматическом агрегате или конденсате, двойной или тройной сигнал в C можно увидеть в редких случаях, но в небольших количествах. В конце этого протокола вы сможете увидеть диахроматические конденсаты белка HP1, несмотря на ограничения состояния, это будет хороший первый подход.

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

Препарирование Средняя кишка и слюнных желез от Ae. aegypti комаров

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Staining Proteins in Gels

Окрашивание белков в гелях

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

Репортер Роман ППП в помощь Визуализация глаз имагинальных дисков в Drosophila</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAÃƒÅ½Ã¢â‚¬Â41

Очистка М. magneticum Штамм AMB-1 Magnetosome белка, связанного MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Разбор и Окрашивание Drosophila Личинок Яичники

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Жить Визуализация GFP-меченых белков в<em&gt; Drosophila</em&gt; Ооцитов

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

In Situ Иммунофлуоресцентное окрашивание аутофагии в мышечных клетках

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Определение плазматической мембраны секционирования для периферически связанных белков

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Визуализация 3D белой жировой ткани структуры, с помощью окрашивания целом гора

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Рассечение и Липид капли пятно Эноцитов в Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...