Name: immunofluorescent staining for visualization of heterochromatin associated proteins in drosophila salivary glands
Uploaded: 2021-08-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands at JoVE.com

Vi tackar Marco Antonio Rosales Vega och Abel Segura för att de tagit några av de konfikala bilderna, Carmen Muñoz för medieförberedelser och Dr. Arturo Pimentel, M.C. Andrés Saralegui och Dr. Chris Wood från LMNA för råd om användningen av mikroskopen.

1. Tredje instar larver kultur
<ol><li>Förbered 1 liter standardmedia genom att tillsätta 100 g jäst, 100 g oraffinerat helrörssocker, 16 g agar, 10 ml propionsyra och 14 g gelatin. Lös upp alla ingredienser utom jästen i 800 ml kranvatten och lös sedan upp jästen. Autoklav omedelbart i 30 minuter.<ol>
<li>Låt sedan media svalna till 60 °C och tillsätt propionsyra till en slutlig koncentration på 0,01 %. Låt flaskan stå tills gelatinet bildas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>För att optimera 3o instar larver kult...

<ol>
	<li>Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emil+Heitz,+a+true+epigenetics+pioneer.">Emil Heitz, a true epigenetics pioneer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572 (2019).</li><li>Irick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+function+for+heterochromatin.">A new function for heterochromatin.</a> Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).</li><li>Kasinathan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovation+of+heterochromatin+functions+drives+rapid+evolution+of+essential+ZAD-ZNF+genes+in+Drosophila.">Innovation of heterochromatin functions drives rapid evolution of essential ZAD-ZNF genes in Drosophila.</a> Elife. , 1-31 (2020).</li><li>Lifschytz, E., Hareven, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+markers:+Arrangement+of+obligatory+heterochromatin,+histone+genes+and+multisite+gene+families+in+the+interphase+nucleus+of+D.+melanogaster.">Heterochromatin markers: Arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster.</a> Chromosoma. 86 (4), 443-455 (1982).</li><li>Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1a:+A+structural+chromosomal+protein+regulating+transcription.">HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription.</a> Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).</li><li>Lee, Y. C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericentromeric+heterochromatin+is+hierarchically+organized+and+spatially+contacts+H3K9me2+islands+in+euchromatin.">Pericentromeric heterochromatin is hierarchically organized and spatially contacts H3K9me2 islands in euchromatin.</a> PLoS Genetics. 16 (3), 1-27 (2020).</li><li>Koryakov, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUUR+protein+is+involved+in+binding+of+SU+(VAR)3-9+and+methylation+of+H3K9+and+H3K27+in+chromosomes+of+Drosophila+melanogaster.">The SUUR protein is involved in binding of SU (VAR)3-9 and methylation of H3K9 and H3K27 in chromosomes of Drosophila melanogaster.</a> Chromosome Research. 19 (2), 235-249 (2011).</li><li>Cao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Histone+H3+Lysine+27+Methylation+in+Polycomb-Group+Silencing.">Role of Histone H3 Lysine 27 Methylation in Polycomb-Group Silencing.</a> Science. 298 (5595), 1039 (2002).</li><li>Hines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domains+of+heterochromatin+protein+1+required+for+Drosophila+melanogaster+heterochromatin+spreading.">Domains of heterochromatin protein 1 required for Drosophila melanogaster heterochromatin spreading.</a> Genetics. 182 (4), 967-977 (2009).</li><li>Elgin, S. C. R., Reuter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position-effect+variegation,+heterochromatin+formation,+and+gene+silencing+in+Drosophila.">Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (8), 1-26 (2013).</li><li>Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1a:+A+structural+chromosomal+protein+regulating+transcription.">HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription.</a> Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).</li><li>Meyer-Nava, S., Torres, A., Zurita, M., Valadez-graham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+effects+of+dADD1+misexpression+in+chromatin+organization+and+transcription.">Molecular effects of dADD1 misexpression in chromatin organization and transcription.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 2, 1-17 (2020).</li><li>Tennessen, J. M., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+growth+and+maturation+-+Insights+from+drosophila.">Coordinating growth and maturation - Insights from drosophila.</a> Current Biology. 21 (18), 750-757 (2011).</li><li>Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+drosophila+polytene+chromosome+squashes+for+antibody+labeling.">Preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), 1-4 (2010).</li><li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66 (1967), 57-80 (1981).</li><li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+droplet+formation+by+HP1&#945;+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin.">Liquid droplet formation by HP1&#945; suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).</li><li>Larson, A. G., Narlikar, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Phase+Separation+in+Heterochromatin+Formation,+Function,+and+Regulation.">The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation.</a> Biochemistry. 57 (17), 2540-2548 (2018).</li><li>Keenen, M. M., Larson, A. G., Narlikar, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+Quantitation+of+Phase-Separated+Droplet+Formation+by+Human+HP1&#945;.">Visualization and Quantitation of Phase-Separated Droplet Formation by Human HP1&#945;.</a> Methods in Enzymology. , (2018).</li><li>Lu, B. Y., Emtage, P. C., Duyf, B. J., Hilliker, a. J., Eissenberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+protein+1+is+required+for+the+normal+expression+of+two+heterochromatin+genes+in+Drosophila.">Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila.</a> Genetics. 155 (2), 699-708 (2000).</li><li>Marsano, R. M., Giordano, E., Messina, G., Dimitri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Portrait+of+Constitutive+Heterochromatin:+Lessons+from+Drosophila+melanogaster.">A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster.</a> Trends in Genetics. , (2019).</li><li>Strom, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+drives+heterochromatin+domain+formation.">Phase separation drives heterochromatin domain formation.</a> Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).</li><li>Sanulli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1+reshapes+nucleosome+core+to+promote+phase+separation+of+heterochromatin.">HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin.</a> Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).</li><li>Dialynas, G., Delabaere, L., Chiolo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+and+Unc45+maintain+heterochromatin+stability+in+Drosophila+polytene+chromosomes.">Arp2/3 and Unc45 maintain heterochromatin stability in Drosophila polytene chromosomes.</a> Experimental Biology and Medicine. 244 (15), 1362-1371 (2019).</li><li>Kolesnikova, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+decondensation+of+heterochromatin+in+drosophila+melanogaster+polytene+chromosomes+under+condition+of+ectopic+expression+of+the+supressor+of+underreplication+gene.">Induced decondensation of heterochromatin in drosophila melanogaster polytene chromosomes under condition of ectopic expression of the supressor of underreplication gene.</a> Fly. 5 (3), 181-190 (2011).</li><li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122 (8), 2517-2527 (1996).</li><li>Messina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeti,+an+essential+Drosophila+melanogaster+gene,+encodes+a+protein+required+for+chromatin+organization.">Yeti, an essential Drosophila melanogaster gene, encodes a protein required for chromatin organization.</a> Journal of Cell Science. 127 (11), 2577-2588 (2014).</li><li>Aguilar-Fuentes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p8/TTDA+overexpression+enhances+UV-irradiation+resistance+and+suppresses+TFIIH+mutations+in+a+Drosophila+trichothiodystrophy+model.">p8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model.</a> PLOS Genetics. 4 (11), 1-9 (2008).</li><li>Reynaud, E., Lomeli, H., Vazquez, M., Zurita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+Homologue+of+the+Xeroderma+Pigmentosum+D+Gene+Product+Is+Located+in+Euchromatic+Regions+and+Has+a+Dynamic+Response+to+UV+Light-induced+Lesions+in+Polytene+Chromosomes.">The Drosophila melanogaster Homologue of the Xeroderma Pigmentosum D Gene Product Is Located in Euchromatic Regions and Has a Dynamic Response to UV Light-induced Lesions in Polytene Chromosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 10 (4), 1191-1203 (1999).</li><li>Farka&#353;, R., Mechler, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+timing+of+Drosophila+salivary+gland+apoptosis+displays+an+I+(2)gl-dose+response.">The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays an I (2)gl-dose response.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 7 (1), 89-101 (2000).</li><li>Zhang, P., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+salivary+gland+chromocenter+contains+highly+polytenized+subdomains+of+mitotic+heterochromatin.">The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin.</a> Genetics. 139 (2), 659-670 (1995).</li><li>Stormo, B. M., Fox, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyteny:+still+a+giant+player+in+chromosome+research.">Polyteny: still a giant player in chromosome research.</a> Chromosome Research. 25 (3-4), 201-214 (2017).</li></ol>

Den cellulära funktionen hos eukaryota organismer kan definiera 3D-strukturen i kärnan, vilket stöds av interaktioner mellan olika proteiner med kromatin och olika molekyler inklusive RNA. Under de senaste tre åren har de biologiska kondensat som har haft relevans, inklusive heterokromatin, tagit en grundläggande roll i fastställandet av fasseparationen som främjar den distinkta nukleära rumsliga organisationen av aktiv och repressiv kromatin 16,17,<...

Sedan de tidiga studierna av Emil Heitz1, heterochromatin har ansetts vara en viktig regulator av cellulära processer såsom genuttryck, meiotisk och mitotisk separation av kromosomer, och upprätthållandet av genomstabilitet2,3,4.
Heterochromatin är huvudsakligen indelat i två typer: konstituerande heterokromatin som karakteristiskt definierar repetitiva sekvenser och transponerbara element som finns på specifika kromosomplatser som telomerer och centromerer. Denna typ av heterokromatin definieras huvudsakligen epigenetiskt av specifika histonmärken såsom di- eller tri-metylering av lysin 9 av histon H3 (H3K9me3) och bindningen av heterochromatinproteinet 1a (HP1a)5,6. Å andra sidan lokaliserar facultative heterokromatin genom kromosomens armar och består huvudsakligen av utvecklingsmässigt tystade gener7,8. Immunostaining av heterokromatinblock i metafasceller, eller observation av heterokromatiska aggregat i interfasceller, har avtäckt mycket ljus i förståelsen av bildandet och funktionen av heterokromatiska regioner9.
Användningen av Drosophila som modellsystem har gjort det möjligt att utveckla viktiga verktyg för att studera heterochromatin utan användning av elektronmikroskopi10. Sedan beskrivningen av position effekt variation och upptäckten av heterochromatin-associerade proteiner, såsom HP1a, och histon post-translationella modifieringar, har många grupper utvecklat flera immunohistochemical tekniker som tillåter visualisering av dessa heterochromatic regioner10,11.
Dessa tekniker är baserade på användning av specifika antikroppar som känner igen heterochromatin-associerade proteiner eller histonmärken. För varje celltyp och antikropp måste fixerings- och permeabiliseringsförhållandena bestämmas empiriskt. Förhållandena kan också variera om ytterligare mekaniska processer som squashteknik används. I detta protokoll beskriver vi användningen av Drosophila salivary körtlar för att studera heterochromatic högborgar. Salivkörtlar har polyteniserade celler som innehåller mer än 1 000 kopior av genomet, vilket ger en förstärkt bild av de flesta kromatinfunktionerna, med undantag för satellit-DNA och vissa heterochromatiska regioner som är under replikerade. Ändå visualiseras heterokromatinregioner lätt i polytenkromosompreparat, men squashteknikerna kan ibland störa karakteristiska kromatinbundna komplex eller kromatinarkitekturen. Därför kan immunlokalisering av proteiner i hela salivkörtelvävnad överträffa dessa oönskade effekter. Vi har använt detta protokoll för att upptäcka flera kromatin bundna proteiner, och vi har visat att detta protokoll kombinerat med mutanta Drosophila lager kan användas för att studera heterochromatin störning12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen MCT-150-C</td>
			<td>11351904</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% formaldehyde</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF1 Citifluor</td>
			<td>Ted pella</td>
			<td>19470</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735078001</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free 
			protease inhibitors</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5892953001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS285022-200EA</td>
			<td>22x22, brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>d9779</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Gold seal</td>
			<td>3011</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>Baker</td>
			<td>0084-01</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K9me3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>8889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP1a</td>
			<td>Hybridoma Bank</td>
			<td>C1A9</td>
			<td>Product Form&#160;Concentrate 0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Baker</td>
			<td>3040-01</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Baker</td>
			<td>9070-03</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-687-12Q</td>
			<td>&#160;Labquake Tube Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Mixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13527550</td>
			<td>SmartBlock 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>648311</td>
			<td>brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>100 mL, brand not critical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610710</td>
			<td>25 mL, brand not critical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescent staining for visualization of heterochromatin associated proteins in drosophila salivary glands

Visualisering av heterochromatinaggregat genom immunostaining kan vara utmanande. Många däggdjur komponenter i kromatin bevaras i Drosophila melanogaster. Därför är det en utmärkt modell för att studera heterochromatinbildning och underhåll. Polyteniserade celler, som de som finns i salivkörtlar av tredje instar D. melanogaster larver, ger ett utmärkt verktyg för att observera kromatin förstärks nästan tusen gånger och har gjort det möjligt för forskare att studera förändringar i fördelningen av heterochromatin i kärnan. Även om observationen av heterokromatinkomponenter kan utföras direkt i polytenkromosompreparat, kan lokaliseringen av vissa proteiner ändras av behandlingens svårighetsgrad. Därför kompletterar den direkta visualiseringen av heterokromatin i celler denna typ av studie. I detta protokoll beskriver vi de immunostaining tekniker som används för denna vävnad, användning av sekundära fluorescerande antikroppar och confocal mikroskopi att observera dessa heterochromatin aggregat med större precision och detalj.

Representativa resultat av HP1a immunostaining i Drosophila salivkörtlar visas i figur 1. Ett positivt resultat är att observera en brännpunkt (figur 1a) (heterochromatiskt aggregat eller kondensat). Ett negativt resultat är ingen signal eller en spridd signal. Ibland kan en dubbelsignal observeras, det vill säga med en dubbelpunkt (figur 1c), men den förekommer vanligtvis i mindre mängder.
<p class="jove_content...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands at JoVE.com

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Detta protokoll syftar till att visualisera heterochromatin aggregat i Drosophila polytene celler.

Immunofluorescerande färgning för visualisering av heterochromatin associerade proteiner i Drosophila Salivary Körtlar

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...

Syftet med detta protokoll är att visualisera heterochromatinaggregat i Drosophila celler. För att uppnå detta använder vi polytenceller som finns i salivkörtlarna hos tredje instar larverna Genomet i dessa celler förstärks nästan tusen gånger, och kromosomerna bevarar funktionerna i gränssnittsceller. De har väldefinierade telomerer, och broar som kallas kromocenter där alla centromerer aggregerar, och det är främst heterokromatiskt.Med hjälp av den tredje instar larvvävnaden, gör det också möjligt för oss att utvärdera förändringar i heterokromatiska aggregat i olika genetiska mutanter bakgrund. För att optimera den tredje instar larverkulturen måste du först samla 5 till 10 dagar gamla vuxna och sätta cirka 50 i en bred halsflaska av ett standardmedier. 25 man och 25 kvinnor.Placera flaskan i en kontrollerad temperaturinkubator vid 25 Celsius grader i 12 timmar. När inkubationstiden är över, ta bort de vuxna och överför dem till en ny flaska för att upprepa proceduren. Låt embryona växa vid 18 grader Celsius i 22 timmar.För larvsamling, se till att du väljer de vandrande larverna, som inte har övernaturliga sfäriska. Dissekera 15 par salivkörtlar, eller så mycket du kan på 30 minuter i kall PBS med protesthämmare under mikroskopet. Överför salivkörtlarna till ett annat rör med iskallt PBS.Tvätta en gång med kall PBS plus protesthämmare. Kom ihåg att vänta alltid på att vävnaden når botten av röret. När du har tagit bort PBS från det sista steget, tillsätt direkt 0,5 milliliter av en X-grupp tandköttfixeringsbuffert och 50% metanol plus 2%formaldehyd.Inkubera i två timmar vid fyra Celsius grad med mild rotation. Utför en fem minuters rotationstvätt med Tris-Triton-buffert och tillsätt en milliliter. Vänta alltid tills vävnaden når botten av röret.Obs: vänta tills vävnaden når botten av röret. Inkubera salivkörtlarna med Tris-Triton, samma som ovan, plus 1% av beta mercaptoethanol i två timmar vid 37 grader Celsius med mild skakning. Tvätta med BO3-buffert och inkubera med BO3 plus 10 millimolar DTT vid 37 grader Celsius med mild skakning i 15 minuter.I slutet av inkubationsperioden, utför en tvätt med en milliliter BO3-buffert ensam. Inkubera salivkörtlarna i en milliliter buffert B i två timmar vid rumstemperatur med rotation. Ta bort all buffert B och lägg till buffert A plus antikropp av intresse.I det här fallet använder vi HP one, A C 1 8 9 från Iridium bank. 1 av 3 000 över natten vid fyra grader med rotation. Vid denna tidpunkt är det viktigt att skakningarna inte höjer bubblor, vilket kan skada antikroppen.Ge behandling med 15 minuters tvättar med buffert B, under omrörning vid rumstemperatur med en millimeter varje gång. Körtlarna överförs till buffert B tillsammans med det sekundära antibiotikaparet till ett golv hänvisar i två timmar, under rotation vid fyra grader. I det här steget är det viktigt att täcka röret med aluminiumpappersfolie för att skydda den sekundära antikroppen från ljuset.Utför 2x15 minuters brickor vid rumstemperatur, medan rotation med en milliliter buffert B.Inkubera med en DNA-markör som Sydox eller OH och lös upp i en milliliter buffert B i 10 minuter vid rumstemperatur med rotation. Utför en tvätt med buffert B och en gång med PBS, var och en tvätt varar i 10 minuter, medan den roterar vid rumstemperatur. Slutligen montera salivkörtlarna på en rutschkana, gör en pool med en täckspäck.Lägg salivkörtlarna i mitten av poolen och täck med Sidiflor. För att undvika deformation av bubblan, förlänga den trögflytande vätskan överallt. Försegla sedan alla diabilder med klart nagellack.Observera under ett fluorescens- eller konfokalt mikroskop. Om provet inte kommer att observeras samma dag, lagra sedan från ljuset vid fyra grader. Representativa resultat av HB1 monostaining i Drosophila salivary körtlar visas i figur ett.Ett positivt resultat är att observera en brännpunkt som i A, athero kromatiskt aggregat eller kondensat. Ett negativt resultat är ingen signal eller en spridd signal. Ibland kan en dubbelsignal observeras som en dubbelpunkt i C, men förekommer vanligtvis i mindre mängder.För att analysera data kan de representeras som ett stapeldiagram och jämföra fördelningen av HP1 med olika mutantbakgrunder. I figur två kan vi till exempel se att 98 procent av kärnorna utgör en fördelning av en punkt. Och 2% av två högborgar i vild typ.I mutanten förändrades andelen och närvaron av två högborgar ökade till 40%Figur tre visar representativ trimetylering lysin 9H3 i monostaining. Resultera i Drosophila salivkörtlar observera en brännpunkt i B, det är ett gynnsamt resultat vid kromatiska aggregera eller kondensat, en dubbel eller trippel signal i C kan ses vid sällsynta tillfällen, men i en liten mängd. I slutet av detta protokoll kommer du att kunna se ett diachromatiskt kondensat av HP1-protein trots tillståndsbegränsningar, det kommer att vara ett bra första tillvägagångssätt.

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

Dissekering av midgut och spottkörtlar från AE. aegypti Myggor

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Staining Proteins in Gels

Infärgning Proteiner i Geler

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

A Novel RFP Reporter till stöd i Visualisering av Eye Imaginal skiva i Drosophila</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAÃƒÅ½Ã¢â‚¬Â41

Rening av M. magneticum Sila AMB-1 Magnetosome Medverkande Protein MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissektion och färgning av Drosophila Larvernas Äggstockar

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live avbildning av GFP-märkta proteiner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocyter

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

I situ Immunofluorescerande färgning av autophagy i muskelstamceller

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

Bestämning av plasmamembranet partitionering för perifert-associerade proteiner

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualisering av 3D vit fettvävnad struktur med hjälp av hela-mount färgning

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissektion och lipid dropp färgning av Oenocyter i Drosophila larver

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...