Name: a mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein r-methylation analysis
Uploaded: 2022-04-28T12:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis at JoVE.com

MM و EM هم طلاب دكتوراه في المدرسة الأوروبية للطب الجزيئي (SEMM). EM هو المستفيد من منحة FIRC-AIRC لمدة 3 سنوات (رمز المشروع: 22506). يتم دعم التحليلات العالمية لبروتينات R-methyl-في مجموعة السل من قبل AIRC IG Grant (رمز المشروع: 21834).

1. زراعة الخلايا واستخراج البروتين (الوقت: 3 - 4 أسابيع مطلوبة)
<ol><li>تنمو خلايا هيلا بالتوازي في وسط مزود إما بالميثيونين الخفيف (L) أو الثقيل (H) ، على التوالي (انظر الجدول 1 لتكوين الوسائط). عند ثمانية انقسامات خلوية على الأقل ، اجمع حصة من الخلايا من كل قناة SILAC وقم بإجراء اختبار الدمج....

<ol>
	<li>Bulau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+arginine+methylation+in+free+versus+protein-incorporated+amino+acids+in+vitro+and+in+vivo+using+protein+hydrolysis+and+high-performance+liquid+chromatography.">Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography.</a> Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).</li><li>Blanc, R. S., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+methylation:+the+coming+of+age.">Arginine methylation: the coming of age.</a> Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).</li><li>Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+arginine+methylation+sites+in+human+cells+reveals+dynamic+regulation+during+transcriptional+arrest.">Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).</li><li>Yang, Y., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methyltransferases+and+cancer.">Protein arginine methyltransferases and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).</li><li>Bezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+constitutive+and+alternative+splicing+by+PRMT5+reveals+a+role+for+Mdm4+pre-mRNA+in+sensing+defects+in+the+spliceosomal+machinery.">Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery.</a> Genes &amp; Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).</li><li>Auclair, Y., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+arginine+methylation+in+the+DNA+damage+response.">The role of arginine methylation in the DNA damage response.</a> DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).</li><li>Spadotto, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT1-mediated+methylation+of+the+microprocessor-associated+proteins+regulates+microRNA+biogenesis.">PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).</li><li>Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+computational+approaches+for+the+large-scale+analysis+of+protein+arginine+methylation+by+mass+spectrometry.">Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry.</a> Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).</li><li>Ong, S. -. E., Mittler, G., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+and+quantifying+in+vivo+methylation+sites+by+heavy+methyl+SILAC.">Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC.</a> Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).</li><li>Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+mass+spectrometry-based+identifications+of+enzyme-mediated+protein+methylation+are+subject+to+high+false+discovery+rates.">Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).</li><li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methylation+in+mammals:+who,+what,+and+why.">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).</li><li>Larsen, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+analysis+of+arginine+monomethylation+reveals+widespread+occurrence+in+human+cells.">Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells.</a> Science Signaling. 9 (443), (2016).</li><li>Massignani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hmSEEKER:+Identification+of+hmSILAC+doublets+in+MaxQuant+output+data.">hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data.</a> Proteomics. 19 (5), 1800300 (2019).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+the+sulfhydryl+reductants+tris(2-carboxyethyl)phosphine+and+dithiothreitol+for+use+in+protein+biochemistry.">A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry.</a> Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).</li><li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry.">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li><li>Huesgen, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LysargiNase+mirrors+trypsin+for+protein+C-terminal+and+methylation-site+identification.">LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification.</a> Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896 (2007).</li><li>Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+protein+methylation+profiling+by+combined+chemical+and+immunoaffinity+approaches+reveals+novel+PRMT1+targets.">Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).</li><li>Bremang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+identification+and+characterisation+of+lysine+and+arginine+methylation+in+the+human+proteome.">Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome.</a> Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).</li><li>Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+arginine+methylation+in+primary+T+cells+reveals+regulatory+roles+in+cell+signalling.">Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).</li><li>Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+basic+residue+content+on+fragment+ion+peak+intensities+in+low-energy+collision-induced+dissociation+spectra+of+peptides.">Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides.</a> Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).</li><li>Guthals, A., Bandeira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+identification+by+tandem+mass+spectrometry+with+alternate+fragmentation+modes.">Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).</li><li>Swaney, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supplemental+activation+method+for+high-efficiency+electron-transfer+dissociation+of+doubly+protonated+peptide+precursors.">Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors.</a> Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).</li><li>Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle-down+proteomics+reveals+dense+sites+of+methylation+and+phosphorylation+in+arginine-rich+RNA-binding+proteins.">Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins.</a> Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).</li><li>Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-line+high-pH+reversed-phase+fractionation+for+in-depth+phosphoproteomics.">Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics.</a> Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).</li><li>Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pH+reversed-phase+chromatography+with+fraction+concatenation+for+2D+proteomic+analysis.">High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis.</a> Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).</li><li>Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+protein+methylation+profiling+by+combined+chemical+and+immunoaffinity+approaches+reveals+novel+PRMT1+targets.">Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).</li><li>Uhlmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+large-scale+identification+of+protein+arginine+methylation.">A method for large-scale identification of protein arginine methylation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-free+approach+for+the+global+analysis+of+protein+methylation.">Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation.</a> Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).</li><li>Moore, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+molecular+affinity+strategy+for+global+detection+and+proteomic+analysis+of+lysine+methylation.">A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation.</a> Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+proteomics+approach+for+global+analysis+of+lysine+monomethylome+profiling.">A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).</li><li>Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+arginine+methylation+sites+in+human+cells+reveals+dynamic+regulation+during+transcriptional+arrest.">Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).</li><li>Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MethylQuant:+A+Tool+for+Sensitive+Validation+of+Enzyme-Mediated+Protein+Methylation+Sites+from+Heavy-Methyl+SILAC+Data.">MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).</li></ol>

يمثل تحديد الثقة العالية لمثيلة البروتين / الببتيد في الجسم الحي بواسطة البروتينات العالمية القائمة على مرض التصلب العصبي المتعدد أمرا صعبا ، بسبب خطر ارتفاع FDR ، مع حدوث العديد من بدائل الأحماض الأمينية وأسترة الميثيل أثناء تحضير العينة التي تكون متساوية الضغط للمثيلة ويمكن أن تسبب...

أرجينين (R) - مثيلة هو تعديل ما بعد الترجمة (PTM) الذي يزين حوالي 1 ٪ من البروتينالثديي 1. بروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراز (PRMTs) هي الإنزيمات التي تحفز تفاعل R-methylation عن طريق ترسب مجموعة أو مجموعتين من الميثيل إلى ذرات النيتروجين (N) لمجموعة guanidino من السلسلة الجانبية ل R بطريقة متماثلة أو غير متماثلة. في الثدييات ، يمكن تجميع PRMTs في ثلاث فئات - النوع الأول والنوع الثاني والنوع الثالث - اعتمادا على قدرتها على إيداع كل من المثيلة الأحادية (MMA) وثنائي المثيلة غير المتماثل (ADMA) و MMA وثنائي المثيلة المتماثل (SDMA) أو MMA فقط ،على التوالي 2,3. تستهدف PRMTs بشكل أساسي بقايا R الموجودة داخل المناطق الغنية بالجليكاين والأرجينين ، والمعروفة باسم زخارف GAR ، ولكن بعض PRMTs ، مثل PRMT5 و CARM1 ، يمكن أن تكون ميثيل البرولين - الجلايسين - الزخارف الغنية بالميثيونين (PGM)4. برز R-methylation كمغير بروتين للعديد من العمليات البيولوجية ، مثل ربط الحمض النوويالريبي 5 ، وإصلاح الحمض النووي6 ، والتولد الحيويmiRNA 7 ، والترجمة2 ، مما يعزز البحث في PTM هذا.
يعرف قياس الطيف الكتلي (MS) بأنه أكثر التقنيات فعالية لدراسة مثيلة R العالمية بشكل منهجي بدقة البروتين والببتيد والموقع. ومع ذلك ، يتطلب PTM هذا بعض الاحتياطات الخاصة لتحديد الثقة العالية من قبل MS. أولا ، R-methylation هو قياس ، حيث يكون الشكل غير المعدل للببتيدات أكثر وفرة من الببتيدات المعدلة ، بحيث تقوم مطياف الكتلة التي تعمل في وضع اكتساب البيانات (DDA) بتجزئة الببتيدات غير المعدلة عالية الكثافة في كثير من الأحيان أكثر من نظيراتها الميثيلية منخفضة الكثافة8. علاوة على ذلك ، فإن معظم تدفقات العمل المستندة إلى MS لتحديد موقع R-methylated تعاني من قيود على مستوى التحليل المعلوماتي الحيوي. في الواقع ، فإن التحديد الحسابي لببتيدات الميثيل عرضة لمعدلات اكتشاف خاطئة عالية (FDR) ، لأن PTM هذا متساوي الضغط لبدائل الأحماض الأمينية المختلفة (على سبيل المثال ، الجلايسين في ألانين) والتعديل الكيميائي ، مثل أسترة الميثيل للأسبارتات والغلوتامات9. ومن ثم ، فقد تم تنفيذ طرق تستند إلى توسيم النظائر لمجموعات الميثيل ، مثل وضع العلامات على النظائر المستقرة للميثيل الثقيل مع الأحماض الأمينية في زراعة الخلايا (hmSILAC) ، كاستراتيجيات متعامدة لتحديد MS الواثق للمثيلات في الجسم الحي ، مما يقلل بشكل كبير من معدل التعليقات التوضيحية الإيجابية الخاطئة10.
في الآونة الأخيرة ، تم تحسين بروتوكولات مختلفة على مستوى البروتين لدراسة البروتينات R-methylated. أدى تطوير الاستراتيجيات القائمة على الأجسام المضادة لإثراء التقارب المناعي لببتيدات R-methyl-peptides إلى شرح عدة مئات من مواقع R-methylated في الخلايا البشرية11,12. علاوة على ذلك ، ذكرت العديد من الدراسات 3,13 أن اقتران الإثراء القائم على الأجسام المضادة بتقنيات فصل الببتيد مثل تجزئة كروماتوغرافيا HpH-RP يمكن أن يعزز العدد الإجمالي لببتيدات الميثيل المحددة.
تصف هذه المقالة استراتيجية تجريبية مصممة لتحديد منهجي وعالي الثقة لمواقع R-methylated في الخلايا البشرية ، بناء على خطوات كيميائية حيوية وتحليلية مختلفة: استخراج البروتين من الخلايا التي تحمل علامة hmSILAC ، والهضم الأنزيمي المزدوج المتوازي مع بروتياز التربسين و LysargiNase ، متبوعا بتجزئة كروماتوغرافية HpH-RP للببتيدات المهضومة ، إلى جانب إثراء التقارب المناعي القائم على الأجسام المضادة ل MMA- ، SDMA- ، والببتيدات المحتوية على ADMA. ثم يتم تحليل جميع الببتيدات المخصبة بالتقارب بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الدقة (LC) -MS / MS في وضع DDA ، وتتم معالجة بيانات MS الخام بواسطة خوارزمية MaxQuant لتحديد R-methyl-peptides. أخيرا ، تتم معالجة نتائج إخراج MaxQuant باستخدام hmSEEKER ، وهي أداة معلوماتية حيوية مطورة داخليا للبحث عن أزواج من ببتيدات الميثيل الثقيلة والخفيفة. باختصار ، يقرأ hmSEEKER ويصفي تعريفات ببتيدات الميثيل من ملف msms ، ثم يطابق كل ببتيد ميثيل مع ذروة MS1 المقابلة له في ملف جميع الببتيدات ، وأخيرا ، يبحث في ذروة نظيره الببتيد الثقيل / الخفيف. لكل زوج من أزواج الضوء الثقيل المفترضة ، يتم حساب نسبة Log2 H / L (LogRatio) وفرق وقت الاحتفاظ (dRT) ومعلمات خطأ الكتلة (ME) ، ويتم تصنيف الثنائيات الموجودة داخل عمليات القطع المحددة من قبل المستخدم على أنها إيجابيات حقيقية. يتم وصف سير عمل البروتوكول الكيميائي الحيوي في الشكل 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate (AMBIC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>497363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colloidal Coomassie staining Instant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini, EDTA-free</td>
			<td>Roche-Sigma Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Protease Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO ThermoFisher</td>
			<td>26400-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3483-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>GIBCO ThermoFisher</td>
			<td>requested</td>
			<td>&#160;with stabile glutamine and without methionine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nano LC 1200 chromatography system</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray HPLC Columns</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ES907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerolo</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jupiter C12-RP column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4396-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5308</td>
			<td>Light (L) Methionine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine-(methyl-13C,d3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299154</td>
			<td>Heavy (H) Methionine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysargiNase</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>EMS0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtip Cell Disruptor Sonifier 250</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>GIBCO ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP</td>
			<td>Roche-Sigma Aldrich</td>
			<td>4906837001</td>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Tips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>87782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85175</td>
			<td>LC-MS Solvent B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85170</td>
			<td>LC-MS Solvent A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; Water, LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein&#160; All Blue Prestained Protein Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan antibodies &#945;-ADMA</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan antibodies &#945;-MMA</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan antibodies &#945;-SDMA</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 HPLC</td>
			<td>Dionex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Concentrator 5301</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Speed vac</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein r-methylation analysis

بروتين أرجينين (R) - مثيلة هو بروتين واسع الانتشار بعد التعديل الانتقالي (PTM) يشارك في تنظيم العديد من المسارات الخلوية ، بما في ذلك معالجة الحمض النووي الريبي ، ونقل الإشارة ، والاستجابة لتلف الحمض النووي ، والتولد الحيوي للحمض النووي الريبي ، والترجمة.
في السنوات الأخيرة ، وبفضل التطورات البيوكيميائية والتحليلية ، برزت البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي (MS) باعتبارها الاستراتيجية الأكثر فعالية لتوصيف بروتينات الميثيل الخلوية بدقة موقع واحد. ومع ذلك ، فإن تحديد وتنميط مثيلة البروتين الحي R-methylation بواسطة MS لا يزال يمثل تحديا وعرضة للخطأ ، ويرجع ذلك أساسا إلى الطبيعة التكميلية لهذا التعديل ووجود بدائل مختلفة للأحماض الأمينية وأسترة الميثيل الكيميائية للمخلفات الحمضية التي تكون متساوية الضغط للمثيلة. ومن ثم، يلزم اتباع أساليب إثراء لتعزيز تحديد ببتيدات R-methyl واستراتيجيات التحقق المتعامدة للحد من معدلات الاكتشاف الخاطئ في دراسات بروتينات الميثيل.
هنا ، يتم وصف بروتوكول مصمم خصيصا لتحديد ببتيدات R-methyl عالية الثقة وكميتها من العينات الخلوية ، والذي يجمع بين وضع العلامات الأيضية للخلايا مع الميثيونين المشفر بالنظائر الثقيلة (hmSILAC) وهضم البروتياز المزدوج في المحلول لمستخلص الخلية الكاملة ، متبوعا بتجزئة كروماتوغرافيا المرحلة المعكوسة عالية الأس الهيدروجيني (HpH-RP) خارج الخط وإثراء تقارب R-methyl-peptides باستخدام الأجسام المضادة المضادة لعموم R-methyl. عند تحليل MS عالي الدقة ، تتم معالجة البيانات الأولية أولا باستخدام حزمة برامج MaxQuant ثم يتم تحليل النتائج بواسطة hmSEEKER ، وهو برنامج مصمم للبحث المتعمق لأزواج ذروة MS المقابلة لببتيد الميثيل الخفيف والثقيل داخل ملفات إخراج MaxQuant.

تصف المقالة سير العمل لتحديد الثقة العالية لمثيلة البروتين العالمي R-methylation ، والذي يعتمد على مزيج من الهضم الأنزيمي لمستخلص البروتين مع اثنين من البروتياز المتميزين بالتوازي ، متبوعا بتجزئة كروماتوغرافيا HpH-RP السائلة للببتيدات المحللة للبروتين وإثراء التقارب المناعي لببتيدات R-methyl مع ا?...

Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis at JoVE.com

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

بروتين أرجينين (R) - مثيلة هو تعديل واسع الانتشار بعد الترجمة ينظم مسارات بيولوجية متعددة. يعد قياس الطيف الكتلي أفضل تقنية لتحديد ملامح R-methyl-proteome عالميا ، عندما يقترن بالنهج الكيميائية الحيوية لتخصيب الببتيد المعدل. يتم وصف سير العمل المصمم لتحديد الثقة العالية لمثيلة R العالمية في الخلايا البشرية هنا.

نهج البروتينات القائم على قياس الطيف الكتلي لتحليل مثيلة البروتين R العالمية وعالية الثقة

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

هذا البروتوكول مهم للغاية لأنه يمثل أحدث سير العمل للتحليل العالمي لمثيلة البروتين أرجينين بواسطة قياس الطيف الكتلي. هذه هي الطريقة الوحيدة لتحديد وتعريف البروتين R-methylated بدقة نمط واحد لا يمكن تحقيقها باستخدام التقنيات الكيميائية الحيوية الأخرى. عندما يقترن هذا البروتوكول باستخدام مثبطات PRMT ، والعديد منها في التجارب السريرية والأدوية المضادة للسرطان ، يسمح هذا البروتوكول بإجراء تحليل متعمق لآلية عملها.للبدء ، قم بإجراء تقليل مجموعة الثيول من البروتينات باستخدام محلول مخزون من DTT مذاب في ماء فائق النقاء بتركيز نهائي قدره 4.5 مليمولار واترك التفاعل لمدة 30 دقيقة عند 55 درجة مئوية. أداء الألكلة من مجموعة ثيول من البروتينات عن طريق إضافة يودواسيتاميد بتركيز 10 مليمولار واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. للتحقق من كفاءة التحلل البروتيني ، احفظ حصة من مستخلص البروتين للتحليل اللاحق على جل SDS-PAGE Coomassie الملون ومقارنته بكمية مقابلة من العينة عند الهضم.قم بتخفيف مستخلص البروتين المتبقي بأربعة مجلدات من 20 ملليمولار HEPES عند درجة حموضة 8.0 للوصول إلى تركيز اليوريا النهائي من اثنين من الضرس. قسم العينة إلى جزأين ، ثم أضف التربسين المعدل بدرجة التسلسل إلى أحدهما وبروتياز LysargiNase إلى الآخر. اترك العينات طوال الليل عند 37 درجة مئوية في ThermoMixer بمعدل 600 دورة في الدقيقة للسماح بالهضم الأنزيمي.لكل تدرج كروماتوغرافي ، اجمع كل الكسور في لوحة عميقة من 96 بئرا. قم بتجميع الكسور التي تم جمعها قبل بدء التدرج في كسر واحد يسمى pre. قم بربط 60 كسرا من التدرج اللوني الكروماتوجرافي السائل المعكوس ذو الأس الهيدروجيني العالي عن طريق تجميعها بطريقة غير متجاورة في 14 كسرا نهائيا.للحصول على تسلسل غير متجاور ، قم بتجميع كسور الطور المعكوسة ذات الأس الهيدروجيني العالي كما هو موضح في مخطوطة النص. قم بتجميع الكسور التي تم جمعها بعد التدرج في كسر فريد يسمى post. إجراء إثراء متسلسل بالتقارب المناعي للببتيد المعدل بشكل منفصل للعينتين من هضم التربسين و LysargiNase.تمييع تنقية التقارب المناعي المركز 10X أو العازلة IAP 10 مرات. جهاز طرد مركزي للببتيدات المجففة بالتجميد عند 2،000 جم لمدة خمس دقائق لتدوير الببتيدات إلى أسفل الأنبوب. أعد تعليق الببتيدات ب 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت المخفف IAP لكل أنبوب سعة 15 ملليلتر وانقله إلى أنبوب ربط منخفض سعة 1.5 ملليلتر.استخدم ورقة عباد الشمس للتحقق من أن الرقم الهيدروجيني أكبر من ستة. احتفظ بقسمة صغيرة من كل كسر كمدخل لتحليل MS اللاحق. قسم كل جزء إلى جزأين لإجراء التخصيب المناعي للببتيدات ثنائية الميثيل غير المتماثلة ، أو ADMA ، وثنائي الميثيل المتماثل ، أو SDMA ، بالتوازي.تحضير ثلاث قوارير من الأجسام المضادة المختارة المضادة لعموم R-methylated مترافقة مع حبات البروتين A agarose لكل 10 ملليغرام من مستخلص البروتين الأولي. قم بإعداد الكمية الصحيحة من الأجسام المضادة المترافقة مع حبات الأغاروز عن طريق طرد كل قارورة بالطرد المركزي عند 2،000 G لمدة 30 ثانية وإزالة المخزن المؤقت من الخرزات. اغسل الخرز ثلاث مرات بملليلتر واحد من 1X PBS عن طريق الطرد المركزي عند 2،000 G لمدة 30 ثانية.بعد الغسيل الأخير ، أعد تعليق الخرز في 40 ميكرولتر 1X PBS لكل قارورة ، وقم بتجميعها ثم قسمها أخيرا بالتساوي إلى 16 كسرا. أضف 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت 1X IAP إلى كل أنبوب واخلطه عن طريق التقليب. ثم احتضان الأنابيب على عجلة دوارة لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية.بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للأنابيب سعة 1.5 ملليلتر التي تحتوي على الببتيدات وحبيبات الجسم المضاد R-methyl المترافقة عند 2،000 G لمدة 30 ثانية لحبيبات الخرز ونقل التدفق من كل جزء إلى أنبوب ربط منخفض نظيف 1.5 ملليلتر. أضف الخرزات إلى التدفق المترافق مع الأجسام المضادة ضد مثيلة R-mono وكرر إعادة التعليق في PBS ، والحضانة باستخدام المخزن المؤقت IAP ، والطرد المركزي. أثناء حضانة عينات الببتيد مع حبات أحادية الميثيل أو MMA ، اغسل الكسور التي كانت مترسبة سابقا بمضادات ADMA و SDMA باستخدام 250 ميكرولتر من محلول IAP مرتين وتخلص من المادة الطافية بعد كل غسلة.ثم يغسل بالماء LC-MS ثلاث مرات. تخلص من ببتيدات SDMA أو ADMA المخصبة بالتقارب من حبات الأغاروز بإضافة 50 ميكرولتر من 0.15 TFA إلى كل أنبوب. اترك هذا المحلول لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، واقلب الأنابيب كل دقيقتين إلى ثلاث دقائق.انقل الشطف الأول إلى أنابيب منخفضة الربط نظيفة سعة 1.5 ملليلتر وكرر الشطف باستخدام 50 ميكرولتر من 0.15 TFA. قم بتجميع جزأي الشطف في أنبوب واحد. كرر هذه العملية مع الببتيدات R-mono-methylated التي تم تحضينها مع حبات الأجسام المضادة ل MMA.بعد خلط الخلايا الخفيفة والثقيلة ، تم استخراج البروتينات وتعريضها للهضم بواسطة التربسين و LysargiNase. تم استخدام هلام SDS-PAGE Coomassie الملون للتحقق من الهضم الأنزيمي الفعال للبروتينات الكلية في الببتيدات. تم تقييم كفاءة خطوة التنقية التي قام بها عمود C18 Sep-Pak ، مما يؤكد عدم وجود الببتيدات في تدفق العمود C18 وفي الغسيل الأول والثاني بالإضافة إلى وجودها المتوقع في المحلول .تم تقييم الدمج الصحيح ل MET4 في القناة الثقيلة والخلط الثقيل أو الخفيف الصحيح. يوضح هنا مخطط كروماتوجرام الكروماتوغرافيا المتغيرة للببتيدات ذات الأس الهيدروجيني المرتفع غير المتصل بالإنترنت وسلسلة الكسور غير المتجاورة اللاحقة. تم الكشف عن الببتيدات بواسطة 250 نانومتر من الأشعة فوق البنفسجية ، في حين تم تقييم البروتينات غير المهضومة المتبقية بواسطة 280 نانومتر من الأشعة فوق البنفسجية. تم الحصول على أطياف MS الكاملة للببتيدات التي تمثل شرحا إيجابيا حقيقيا لببتيد الميثيل.تتوافق الاختلافات M على Z التي لوحظت بين القمم الثلاث مع وجود بقايا ميثلية إنزيمية. تم الحصول على أطياف MS الكاملة للببتيدات التي تمثل شرحا إيجابيا كاذبا لببتيد الميثيل. الاختلافات M على Z التي لوحظت بين الببتيد الميثيلي الخفيف ونظيره الثقيل العقابي ينحرف عن القيمة المتوقعة بمقدار 0.0312.سير عمل البروتوكول خطي بشكل عام ، ولكن هناك بعض الخطوات التي تحتاج إلى عناية خاصة. على سبيل المثال ، فصل كروماتوغرافيا IPH مع تسلسل الكسر غير المتجاور ، وكذلك إعداد IP. يمكن أن يقترن نفس البروتوكول إما بمعيار SILAC أو القياس الكمي الخالي من الملصقات لتحديد ديناميكيات مثيلة الأرجينين استجابة لمجموعة متنوعة من الاضطرابات.يمهد هذا البروتوكول الطريق لتوصيف مدى وديناميكيات مثيلة البروتين في العديد من أنواع الخلايا وأنظمة النماذج التي تدعم جميع جوانب البحوث الأساسية والانتقالية التي تركز على PRMTs.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

النهج القائم على الطيف، جنبا إلى جنب السائل اللوني الكتلة لتحليل المستقلب من<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

الدهون عزل القطرة عن التحليل الكمي الطيف الكتلي

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

هضم البروتين، أولترافيلتراتيون، وحجم الاستبعاد اللوني لتحسين عزل اكسوسوميس من بلازما الدم البشري والمصل

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

البروتين خارج الخلية ميكرواري تكنولوجيا للكشف عن ارتفاع الإنتاجية منخفضة تقارب مستقبلات-يجند التفاعلات

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

إعداد الأقسام الفرعية بلاستيدات الخضراء من نبات لتحليل البروتين التعريب Immunoblotting أو البروتيوميات

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

تحليل الموجات الاختزالية السائلة غير المستهدفة - قياس الطيف الشامل - Metabolomics من حبوب القمح

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...