Name: a mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein r-methylation analysis
Uploaded: 2022-04-28T12:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis at JoVE.com

MM og EM er ph.d.-studerende inden for European School of Molecular Medicine (SEMM). EM er modtager af et 3-årigt FIRC-AIRC-stipendium (projektkode: 22506). Globale analyser af R-methylproteomer i TB-gruppen understøttes af AIRC IG Grant (projektkode: 21834).

1. Celledyrkning og proteinekstraktion (tid: 3 - 4 uger påkrævet)
<ol><li>Dyrk HeLa-celler parallelt i medier, der leveres med henholdsvis let (L) eller tung (H) methionin (se tabel 1 for mediesammensætning). Ved mindst otte celledelinger indsamles en aliquot af celler fra hver SILAC-kanal, og inkorporeringstesten udføres. BEMÆRK: For at kontrollere inkorporeringseffektiviteten testes ved LC-MS / MS-analyse, at procentdelen af tung methionin (Met-4) i Heavy-kanalen er så tæt som muligt på 10...

<ol>
	<li>Bulau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+arginine+methylation+in+free+versus+protein-incorporated+amino+acids+in+vitro+and+in+vivo+using+protein+hydrolysis+and+high-performance+liquid+chromatography.">Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography.</a> Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).</li><li>Blanc, R. S., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+methylation:+the+coming+of+age.">Arginine methylation: the coming of age.</a> Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).</li><li>Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+arginine+methylation+sites+in+human+cells+reveals+dynamic+regulation+during+transcriptional+arrest.">Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).</li><li>Yang, Y., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methyltransferases+and+cancer.">Protein arginine methyltransferases and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).</li><li>Bezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+constitutive+and+alternative+splicing+by+PRMT5+reveals+a+role+for+Mdm4+pre-mRNA+in+sensing+defects+in+the+spliceosomal+machinery.">Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery.</a> Genes &amp; Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).</li><li>Auclair, Y., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+arginine+methylation+in+the+DNA+damage+response.">The role of arginine methylation in the DNA damage response.</a> DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).</li><li>Spadotto, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT1-mediated+methylation+of+the+microprocessor-associated+proteins+regulates+microRNA+biogenesis.">PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).</li><li>Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+computational+approaches+for+the+large-scale+analysis+of+protein+arginine+methylation+by+mass+spectrometry.">Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry.</a> Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).</li><li>Ong, S. -. E., Mittler, G., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+and+quantifying+in+vivo+methylation+sites+by+heavy+methyl+SILAC.">Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC.</a> Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).</li><li>Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+mass+spectrometry-based+identifications+of+enzyme-mediated+protein+methylation+are+subject+to+high+false+discovery+rates.">Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).</li><li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methylation+in+mammals:+who,+what,+and+why.">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).</li><li>Larsen, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+analysis+of+arginine+monomethylation+reveals+widespread+occurrence+in+human+cells.">Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells.</a> Science Signaling. 9 (443), (2016).</li><li>Massignani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hmSEEKER:+Identification+of+hmSILAC+doublets+in+MaxQuant+output+data.">hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data.</a> Proteomics. 19 (5), 1800300 (2019).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+the+sulfhydryl+reductants+tris(2-carboxyethyl)phosphine+and+dithiothreitol+for+use+in+protein+biochemistry.">A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry.</a> Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).</li><li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry.">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li><li>Huesgen, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LysargiNase+mirrors+trypsin+for+protein+C-terminal+and+methylation-site+identification.">LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification.</a> Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896 (2007).</li><li>Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+protein+methylation+profiling+by+combined+chemical+and+immunoaffinity+approaches+reveals+novel+PRMT1+targets.">Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).</li><li>Bremang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+identification+and+characterisation+of+lysine+and+arginine+methylation+in+the+human+proteome.">Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome.</a> Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).</li><li>Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+arginine+methylation+in+primary+T+cells+reveals+regulatory+roles+in+cell+signalling.">Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).</li><li>Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+basic+residue+content+on+fragment+ion+peak+intensities+in+low-energy+collision-induced+dissociation+spectra+of+peptides.">Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides.</a> Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).</li><li>Guthals, A., Bandeira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+identification+by+tandem+mass+spectrometry+with+alternate+fragmentation+modes.">Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).</li><li>Swaney, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supplemental+activation+method+for+high-efficiency+electron-transfer+dissociation+of+doubly+protonated+peptide+precursors.">Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors.</a> Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).</li><li>Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle-down+proteomics+reveals+dense+sites+of+methylation+and+phosphorylation+in+arginine-rich+RNA-binding+proteins.">Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins.</a> Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).</li><li>Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-line+high-pH+reversed-phase+fractionation+for+in-depth+phosphoproteomics.">Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics.</a> Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).</li><li>Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pH+reversed-phase+chromatography+with+fraction+concatenation+for+2D+proteomic+analysis.">High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis.</a> Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).</li><li>Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+protein+methylation+profiling+by+combined+chemical+and+immunoaffinity+approaches+reveals+novel+PRMT1+targets.">Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).</li><li>Uhlmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+large-scale+identification+of+protein+arginine+methylation.">A method for large-scale identification of protein arginine methylation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-free+approach+for+the+global+analysis+of+protein+methylation.">Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation.</a> Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).</li><li>Moore, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+molecular+affinity+strategy+for+global+detection+and+proteomic+analysis+of+lysine+methylation.">A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation.</a> Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+proteomics+approach+for+global+analysis+of+lysine+monomethylome+profiling.">A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).</li><li>Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+arginine+methylation+sites+in+human+cells+reveals+dynamic+regulation+during+transcriptional+arrest.">Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).</li><li>Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MethylQuant:+A+Tool+for+Sensitive+Validation+of+Enzyme-Mediated+Protein+Methylation+Sites+from+Heavy-Methyl+SILAC+Data.">MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).</li></ol>

Den høje konfidensidentifikation af in vivo-protein /peptidmethylering ved global MS-baseret proteomics er udfordrende på grund af risikoen for høj FDR med flere aminosyresubstitutioner og methylesterificering, der forekommer under prøveforberedelse, der er isobariske til methylering og kan forårsage forkerte opgaver i fravær af ortogonale MS-valideringsstrategier. Den substoichiometriske karakter af denne PTM komplicerer yderligere opgaven med global methyl-proteomics, men kan overvindes med selektiv beri...

Arginin (R)-methylering er en posttranslationel modifikation (PTM), der dekorerer omkring 1% af pattedyrproteomet1. Protein argininmethyltransferaser (PRMT'er) er enzymerne, der katalyserer R-methyleringsreaktion ved aflejring af en eller to methylgrupper til nitrogenatomerne (N) i guanidino-gruppen i sidekæden af R på en symmetrisk eller asymmetrisk måde. Hos pattedyr kan PRMT'er grupperes i tre klasser - type I, type II og type III - afhængigt af deres evne til at deponere både monomethylering (MMA) og asymmetrisk di-methylering (ADMA), MMA og symmetrisk di-methylering (SDMA) eller kun MMA, henholdsvis 2,3. PRMT'er er hovedsageligt rettet mod R-rester placeret i glycin- og argininrige regioner, kendt som GAR-motiver, men nogle PRMT'er, såsom PRMT5 og CARM1, kan methylatprolin-glycin-methioninrige (PGM) motiver4. R-methylering er opstået som en proteinmodulator af flere biologiske processer, såsom RNA-splejsning5, DNA-reparation6, miRNA-biogenese7 og translation2, hvilket fremmer forskningen på denne PTM.
Massespektrometri (MS) er anerkendt som den mest effektive teknologi til systematisk at studere global R-methylering ved protein-, peptid- og stedopløsning. Denne PTM kræver dog nogle særlige forholdsregler for at kunne identificere den med høj tillid fra medlemsstaterne. For det første er R-methylering substoichiometrisk, idet den umodificerede form af peptiderne er meget mere rigelig end de modificerede, således at massespektrometre, der opererer i DDA-tilstand (Data Dependent Acquisition), vil fragmentere højintensive umodificerede peptider oftere end deres methylerede modstykker med lavere intensitet8. Desuden lider de fleste MS-baserede arbejdsgange til identifikation af R-methylerede steder af begrænsninger på bioinformatisk analyseniveau. Faktisk er beregningsidentifikationen af methylpeptider tilbøjelig til høje falske opdagelseshastigheder (FDR), fordi denne PTM er isobarisk for forskellige aminosyresubstitutioner (f.eks. Glycin til alanin) og kemisk modifikation, såsom methylesterificering af aspartat og glutamat9. Derfor er metoder baseret på isotopmærkning af methylgrupper, såsom tung methylstabil isotopmærkning med aminosyrer i cellekultur (hmSILAC), blevet implementeret som ortogonale strategier til sikker MS-identifikation af in vivo-methyleringer , hvilket signifikant reducerer antallet af falske positive annoteringer10.
For nylig er forskellige proteom-dækkende protokoller til undersøgelse af R-methylerede proteiner blevet optimeret. Udviklingen af antistofbaserede strategier for immun-affinitetsberigelse af R-methylpeptider har ført til annotering af flere hundrede R-methylerede steder i humane celler11,12. Desuden rapporterede mange undersøgelser 3,13, at kobling af antistofbaseret berigelse med peptidseparationsteknikker såsom HpH-RP-kromatografifraktionering kan øge det samlede antal identificerede methylpeptider.
Denne artikel beskriver en eksperimentel strategi designet til systematisk og høj tillid identifikation af R-methylerede steder i humane celler baseret på forskellige biokemiske og analytiske trin: proteinekstraktion fra hmSILAC-mærkede celler, parallel dobbelt enzymatisk fordøjelse med Trypsin og LysargiNase proteaser, efterfulgt af HpH-RP kromatografisk fraktionering af fordøjede peptider kombineret med antistofbaseret immuno-affinitetsberigelse af MMA-, SDMA-, og ADMA-holdige peptider. Alle affinitetsberigede peptider analyseres derefter ved højopløsnings væskekromatografi (LC)-MS/MS i DDA-tilstand, og rå MS-data behandles af MaxQuant-algoritmen til identifikation af R-methyl-peptider. Endelig behandles MaxQuant-outputresultaterne med hmSEEKER, et internt udviklet bioinformatikværktøj til at søge par tunge og lette methylpeptider. Kort fortalt læser og filtrerer hmSEEKER methylpeptididentifikationer fra msms-filen, matcher derefter hvert methylpeptid med dets tilsvarende MS1-top i allPeptides-filen og søger endelig toppen af den tunge / lette peptid-modstykke. For hvert formodet tungt lyspar beregnes parametrene Log2 H/L-forhold (LogRatio), retentionstidsforskel (dRT) og Mass Error (ME), og dubletter, der er placeret inden for brugerdefinerede afskæringer, mærkes som sande positive. Arbejdsgangen for den biokemiske protokol er beskrevet i figur 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate (AMBIC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>497363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colloidal Coomassie staining Instant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini, EDTA-free</td>
			<td>Roche-Sigma Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Protease Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO ThermoFisher</td>
			<td>26400-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3483-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>GIBCO ThermoFisher</td>
			<td>requested</td>
			<td>&#160;with stabile glutamine and without methionine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nano LC 1200 chromatography system</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray HPLC Columns</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ES907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerolo</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jupiter C12-RP column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4396-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5308</td>
			<td>Light (L) Methionine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine-(methyl-13C,d3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299154</td>
			<td>Heavy (H) Methionine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysargiNase</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>EMS0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtip Cell Disruptor Sonifier 250</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>GIBCO ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP</td>
			<td>Roche-Sigma Aldrich</td>
			<td>4906837001</td>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Tips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>87782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85175</td>
			<td>LC-MS Solvent B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85170</td>
			<td>LC-MS Solvent A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; Water, LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein&#160; All Blue Prestained Protein Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan antibodies &#945;-ADMA</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan antibodies &#945;-MMA</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan antibodies &#945;-SDMA</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 HPLC</td>
			<td>Dionex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Concentrator 5301</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Speed vac</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein r-methylation analysis

Protein arginin (R) -methylering er en udbredt protein posttranslationel modifikation (PTM) involveret i reguleringen af flere cellulære veje, herunder RNA-behandling, signaltransduktion, DNA-skaderespons, miRNA-biogenese og translation.
I de senere år har massespektrometri (MS) baseret proteomics takket være biokemiske og analytiske udviklinger vist sig som den mest effektive strategi til at karakterisere det cellulære methyl-proteom med single-site opløsning. Identifikation og profilering in vivo protein R-methylering af MS er imidlertid fortsat udfordrende og fejlbehæftet, hovedsagelig på grund af den substoichiometriske karakter af denne ændring og tilstedeværelsen af forskellige aminosyresubstitutioner og kemisk methylesterificering af sure rester, der er isobariske til methylering. Således kræves berigelsesmetoder til forbedring af identifikationen af R-methylpeptider og ortogonale valideringsstrategier for at reducere falske opdagelseshastigheder (FDR) i methylproteomics-undersøgelser.
Her beskrives en protokol specielt designet til identifikation og kvantificering af R-methylpeptider med høj tillid fra cellulære prøver, som kobler metabolisk mærkning af celler med tung isotopkodet methionin (hmSILAC) og dobbelt proteasefordøjelse i opløsning af helcelleekstrakt efterfulgt af off-line High-pH Reversed Phase (HpH-RP) kromatografifraktionering og affinitetsberigelse af R-methylpeptider ved anvendelse af anti-pan-R-methylantistoffer. Efter MS-analyse i høj opløsning behandles rådata først med MaxQuant-softwarepakken, og resultaterne analyseres derefter af hmSEEKER, en software designet til dybdegående søgning af MS-toppar svarende til let og tungt methylpeptid i MaxQuant-outputfilerne.

Artiklen beskriver en arbejdsgang til højkonfidensidentifikation af global protein R-methylering, som er baseret på kombinationen af den enzymatiske fordøjelse af proteinekstraktet med to forskellige proteaser parallelt efterfulgt af HpH-RP væskekromatografifraktionering af proteolytiske peptider og immuno-affinitetsberigelse af R-methyl-peptider med anti-pan-R-methylantistoffer (figur 1).
Cellerne blev dyrket i nærværelse af methionin, enten naturligt (lys,...

Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis at JoVE.com

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

Protein arginin (R) -methylering er en udbredt posttranslationel modifikation, der regulerer flere biologiske veje. Massespektrometri er den bedste teknologi til globalt at profilere R-methylproteomet, når det kobles til biokemiske tilgange til modificeret peptidberigelse. Arbejdsgangen designet til identifikation med høj tillid til global R-methylering i humane celler er beskrevet her.

En massespektrometribaseret proteomics-tilgang til global R-methyleringsanalyse med høj konfidensprotein

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Denne protokol er meget vigtig, fordi den repræsenterer den nyeste arbejdsgang for den globale analyse af proteinargininmethylering ved massespektrometri. Dette er den eneste metode til at identificere og profilere R-methyleret protein med en enkelt stilopløsning, som ikke kan opnås med andre biokemiske teknikker. Når det kombineres med brugen af PRMT-hæmmere, hvoraf flere er i kliniske forsøg og anti-kræftlægemidler, giver denne protokol mulighed for en dybdegående analyse af deres virkningsmekanisme.Til at begynde med udføres reduktion af thiolgruppen af proteiner ved anvendelse af en stamopløsning af DTT opløst i ultrarent vand ved en endelig koncentration på 4,5 millimolar og lad reaktionen gå i 30 minutter ved 55 grader Celsius. Udfør alkylering af thiolgruppen af proteiner ved at tilsætte iodoacetamid i en koncentration på 10 millimolar og inkubere i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke. For at verificere proteolyseeffektiviteten skal du gemme en aliquot proteinekstrakt til efterfølgende analyse på SDS-PAGE Coomassie-farvet gel og sammenligne den med en tilsvarende mængde prøve ved fordøjelsen.Fortynd det resterende proteinekstrakt med fire volumener af 20 millimolar HEPES ved pH 8,0 for at nå en endelig urinstofkoncentration på to kindtænder. Del prøven i to dele, og tilføj derefter sekventeringsklasse modificeret trypsin til den ene og LysargiNase protease til den anden. Efterlad prøverne natten over ved 37 grader Celsius i en ThermoMixer ved 600 rotationer i minuttet for at muliggøre enzymatisk fordøjelse.For hver kromatografisk gradient samles alle fraktioner i en dyb 96-brøndplade. Saml de fraktioner, der er indsamlet før gradientens start, i en enkelt brøkdel ved navn pre. De 60 fraktioner fra den omvendte fase væskekromatografiske gradient med høj pH sammenkædes ved at samle dem på en ikke-sammenhængende måde i 14 endelige fraktioner.For at opnå ikke-sammenhængende sammenkædning skal du samle de omvendte fasefraktioner med høj pH som beskrevet i tekstmanuskriptet. Saml de brøker, der er indsamlet efter gradienten, i en unik brøk med navnet post. Udfør sekventiel immun-affinitetsberigelse af det modificerede peptid separat for de to prøver fra trypsin og LysargiNase fordøjelser.Fortynd 10X koncentreret immunaffinitetsrensning eller IAP-buffer 10 gange. Centrifuge de frysetørrede peptider ved 2.000 G i fem minutter for at dreje peptiderne ned til bunden af røret. Resuspender peptiderne med 250 mikroliter fortyndet IAP-buffer pr. 15 ml rør og overføres til et 1,5 ml lavt bindende rør.Brug et lakmuspapir til at kontrollere, at pH-værdien er større end seks. Opbevar en lille aliquot af hver brøkdel som input til den efterfølgende MS-analyse. Opdel hver fraktion i to dele for at udføre immunberigelsen af asymmetrisk dimethylerede eller ADMA og symmetrisk dimethylerede eller SDMA-peptider parallelt.Forbered tre hætteglas med de udvalgte anti-pan R-methylerede antistoffer konjugeret til protein A agarose perler pr. 10 milligram af det oprindelige proteinekstrakt. Forbered den korrekte mængde antistof konjugeret til agaroseperler ved at centrifugere hvert hætteglas ved 2.000 G i 30 sekunder og fjerne bufferen fra perlerne. Vask perlerne tre gange med en milliliter 1X PBS ved at centrifugere dem ved 2.000 G i 30 sekunder.Efter den sidste vask skal perlerne genindtages i 40 mikroliter 1X PBS for hvert hætteglas, samle dem og derefter til sidst opdele dem ligeligt i 16 fraktioner. Tilsæt 250 mikroliter 1X IAP-buffer til hvert rør og bland ved at invertere. Derefter inkuberes rørene på et roterende hjul i to timer ved fire grader Celsius.Efter inkubationen centrifugeres 1,5 milliliter rør indeholdende peptider og pan R-methyl antistof konjugerede perler ved 2.000 G i 30 sekunder for at pelletere perlerne og overføre gennemstrømningen fra hver fraktion til et rent 1,5 ml lavt bindende rør. Perlerne tilsættes til gennemstrømningen konjugeret til antistoffer mod R-monomethylering og gentag resuspensionen i PBS, inkubation med IAP-buffer og centrifugering. Under inkubationen af peptidprøverne med monomethylisering eller MMA-perler vaskes de fraktioner, der tidligere var immunpræcipiteret med anti-ADMA og SDMA med 250 mikroliter IAP-buffer to gange, og supernatanten kasseres efter hver vask.Vask derefter med LC-MS vand tre gange. Elute affiniteten beriget SDMA eller ADMA peptider fra agarose perlerne ved at tilføje 50 mikroliter 0,15 TFA til hvert rør. Lad denne opløsning stå i 10 minutter ved stuetemperatur, og vend rørene hvert andet til tredje minut.Overfør den første elution til rene 1,5 ml lavbindende rør, og gentag elutionen med 50 mikroliter 0,15 TFA. Saml de to elueringsfraktioner i et rør. Gentag denne proces for de R-mono-methylerede peptider, der blev inkuberet med anti-MMA-antistofperlerne.Efter blanding af de lette og tunge mærkede celler blev proteiner ekstraheret og udsat for fordøjelse af trypsin og LysargiNase. En SDS-PAGE Coomassie-farvet gel blev brugt til at verificere den effektive enzymatiske fordøjelse af totale proteiner i peptider. Effektiviteten af rensningstrin udført af C18 Sep-Pak-søjlen blev evalueret, hvilket bekræftede fraværet af peptider i gennemstrømningen af C18-søjlen og i den første og anden vask samt deres forventede tilstedeværelse i eluenten.Korrekt MET4-inkorporering i den tunge kanal og korrekt tung eller let blanding blev evalueret. Kromatogrammet fra offline høj pH omvendt fase væskekromatografi fraktionering af peptider og den efterfølgende ikke-sammenhængende sammenkædning af fraktioner er vist her. Peptider blev detekteret af 250 nanometer UV, mens potentielt resterende ufordøjede proteiner blev evalueret af 280 nanometer UV. De fulde MS-spektre af peptider, der repræsenterer ægte positiv methylpeptidannotering, blev opnået.M over Z-forskellene observeret mellem de tre toppe er i overensstemmelse med tilstedeværelsen af enzymatisk methyleret rest. De fulde MS-spektre af peptider, der repræsenterer falsk positiv methylpeptidannotation, blev opnået. M over Z-forskellene observeret mellem det lette methylerede peptid og dets straffende tunge modstykke afviger fra den forventede værdi med 0,0312.Protokolarbejdsgangen er overordnet lineær, men der er et par trin, der kræver særlig opmærksomhed. For eksempel IPH-kromatografiseparationen med ikke-sammenhængende brøksammenkædning samt IP-opsætningen. Den samme protokol kan kobles til enten standard SILAC eller etiketfri kvantificering for at profilere argininmethyleringsdynamik som reaktion på en række forstyrrelser.Denne protokol baner vejen for karakterisering af omfanget og dynamikken af proteinmethylering i flere celletyper og modelsystemer, der understøtter alle aspekter af grundlæggende og translationel forskning med fokus på PRMT'er.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

En Tandem væskekromatografi-massespektrometri-baseret tilgang til Metabolit Analyse af<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolation for Kvantitativ massespektrometri Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein fordøjelse, ultrafiltrering og størrelse udstødelse kromatografi at optimere Isolation af Exosomes fra humant blod Plasma og Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi til High Throughput påvisning af lav affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Forberedelse af grønkorn sub rum fra Arabidopsis til analyse af Protein lokalisering af Immunoblotting eller Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning af proteinubiquitinationssteder ved peptidberigelse og massespektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Umålrettet flydende kromatografi-massespektrometri-baserede metabolomiske analyse af hvedekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...