Name: a mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein r-methylation analysis
Uploaded: 2022-04-28T12:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis at JoVE.com

MM ו- EM הם תלמידי דוקטורט בבית הספר האירופי לרפואה מולקולרית (SEMM). EM הוא הזוכה של 3 שנים FIRC-AIRC bursary (קוד הפרויקט: 22506). ניתוחים גלובליים של R-מתיל-פרוטאומים בקבוצת השחפת נתמכים על ידי מענק AIRC IG (קוד הפרויקט: 21834).

1. גידול תאים ומיצוי חלבונים (זמן: 3 - 4 שבועות נדרשים)
<ol><li>לגדל תאי HeLa במקביל במדיה המסופקת עם מתיונין קל (L) או כבד (H), בהתאמה ( ראה טבלה 1 להרכב מדיה). לאחר לפחות שמונה חלוקות תאים, לאסוף aliquot של תאים מכל ערוץ SILAC ולבצע את בדיקת השילוב. הערה: כדי לבדוק את יעילות השילוב, בדוק על-ידי ניתוח ...

<ol>
	<li>Bulau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+arginine+methylation+in+free+versus+protein-incorporated+amino+acids+in+vitro+and+in+vivo+using+protein+hydrolysis+and+high-performance+liquid+chromatography.">Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography.</a> Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).</li><li>Blanc, R. S., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+methylation:+the+coming+of+age.">Arginine methylation: the coming of age.</a> Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).</li><li>Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+arginine+methylation+sites+in+human+cells+reveals+dynamic+regulation+during+transcriptional+arrest.">Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).</li><li>Yang, Y., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methyltransferases+and+cancer.">Protein arginine methyltransferases and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).</li><li>Bezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+constitutive+and+alternative+splicing+by+PRMT5+reveals+a+role+for+Mdm4+pre-mRNA+in+sensing+defects+in+the+spliceosomal+machinery.">Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery.</a> Genes &amp; Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).</li><li>Auclair, Y., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+arginine+methylation+in+the+DNA+damage+response.">The role of arginine methylation in the DNA damage response.</a> DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).</li><li>Spadotto, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT1-mediated+methylation+of+the+microprocessor-associated+proteins+regulates+microRNA+biogenesis.">PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).</li><li>Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+computational+approaches+for+the+large-scale+analysis+of+protein+arginine+methylation+by+mass+spectrometry.">Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry.</a> Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).</li><li>Ong, S. -. E., Mittler, G., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+and+quantifying+in+vivo+methylation+sites+by+heavy+methyl+SILAC.">Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC.</a> Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).</li><li>Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+mass+spectrometry-based+identifications+of+enzyme-mediated+protein+methylation+are+subject+to+high+false+discovery+rates.">Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).</li><li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methylation+in+mammals:+who,+what,+and+why.">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).</li><li>Larsen, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+analysis+of+arginine+monomethylation+reveals+widespread+occurrence+in+human+cells.">Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells.</a> Science Signaling. 9 (443), (2016).</li><li>Massignani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hmSEEKER:+Identification+of+hmSILAC+doublets+in+MaxQuant+output+data.">hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data.</a> Proteomics. 19 (5), 1800300 (2019).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+the+sulfhydryl+reductants+tris(2-carboxyethyl)phosphine+and+dithiothreitol+for+use+in+protein+biochemistry.">A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry.</a> Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).</li><li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry.">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li><li>Huesgen, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LysargiNase+mirrors+trypsin+for+protein+C-terminal+and+methylation-site+identification.">LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification.</a> Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896 (2007).</li><li>Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+protein+methylation+profiling+by+combined+chemical+and+immunoaffinity+approaches+reveals+novel+PRMT1+targets.">Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).</li><li>Bremang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+identification+and+characterisation+of+lysine+and+arginine+methylation+in+the+human+proteome.">Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome.</a> Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).</li><li>Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+arginine+methylation+in+primary+T+cells+reveals+regulatory+roles+in+cell+signalling.">Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).</li><li>Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+basic+residue+content+on+fragment+ion+peak+intensities+in+low-energy+collision-induced+dissociation+spectra+of+peptides.">Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides.</a> Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).</li><li>Guthals, A., Bandeira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+identification+by+tandem+mass+spectrometry+with+alternate+fragmentation+modes.">Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).</li><li>Swaney, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supplemental+activation+method+for+high-efficiency+electron-transfer+dissociation+of+doubly+protonated+peptide+precursors.">Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors.</a> Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).</li><li>Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle-down+proteomics+reveals+dense+sites+of+methylation+and+phosphorylation+in+arginine-rich+RNA-binding+proteins.">Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins.</a> Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).</li><li>Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-line+high-pH+reversed-phase+fractionation+for+in-depth+phosphoproteomics.">Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics.</a> Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).</li><li>Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pH+reversed-phase+chromatography+with+fraction+concatenation+for+2D+proteomic+analysis.">High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis.</a> Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).</li><li>Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+protein+methylation+profiling+by+combined+chemical+and+immunoaffinity+approaches+reveals+novel+PRMT1+targets.">Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).</li><li>Uhlmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+large-scale+identification+of+protein+arginine+methylation.">A method for large-scale identification of protein arginine methylation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-free+approach+for+the+global+analysis+of+protein+methylation.">Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation.</a> Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).</li><li>Moore, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+molecular+affinity+strategy+for+global+detection+and+proteomic+analysis+of+lysine+methylation.">A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation.</a> Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+proteomics+approach+for+global+analysis+of+lysine+monomethylome+profiling.">A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).</li><li>Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+arginine+methylation+sites+in+human+cells+reveals+dynamic+regulation+during+transcriptional+arrest.">Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).</li><li>Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MethylQuant:+A+Tool+for+Sensitive+Validation+of+Enzyme-Mediated+Protein+Methylation+Sites+from+Heavy-Methyl+SILAC+Data.">MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).</li></ol>

הזיהוי בביטחון גבוה של מתילציה של חלבון in vivo /פפטיד על ידי פרוטאומיקה גלובלית מבוססת MS הוא מאתגר, בשל הסיכון ל-FDR גבוה, כאשר מספר תחליפי חומצות אמינו ומתיל-אסטריפיקציה מתרחשים במהלך הכנת הדגימה שהם איזובריים למתילציה ועלולים לגרום להקצאות שגויות בהיעדר אסטרטגיות אימות MS אורתוגונליות...

ארגינין (R)-מתילציה הוא שינוי פוסט-תרגומי (PTM) המעטר כ-1% מהפרוטאום של היונקים1. חלבון ארגינין מתיל-טרנספראזות (PRMTs) הם האנזימים המזרזים את תגובת המתילציה של R על ידי תצהיר של קבוצת מתיל אחת או שתיים לאטומי החנקן (N) של חבורת הגואנידינו בשרשרת הצדדית של R באופן סימטרי או אסימטרי. ביונקים, ניתן לקבץ PRMTs לשלוש מחלקות - סוג I, סוג II וסוג III - בהתאם ליכולתם להפקיד הן מונו-מתילציה (MMA) והן די-מתילציה אסימטרית (ADMA), MMA ודי-מתילציה סימטרית (SDMA) או רק MMA,בהתאמה 2,3. PRMT מתמקדים בעיקר בשאריות R הממוקמות באזורים עשירים בגליצין וארגינין, הידועים כמוטיבים של GAR, אך PRMTs מסוימים, כגון PRMT5 ו-CARM1, יכולים לבצע מתיל-מאט של מוטיבים עשירים בפרולין-גליצין-מתיונין (PGM)4. R-מתילציה התגלתה כמודולטור חלבונים של מספר תהליכים ביולוגיים, כגון שחבור RNA5, תיקון DNA6, ביוגנזה של miRNA7 ותרגום2, מה שמעודד את המחקר על PTM זה.
ספקטרומטריית מסה (MS) מוכרת כטכנולוגיה היעילה ביותר לחקור באופן שיטתי R-מתילציה גלובלית ברזולוציית חלבון, פפטיד ואתר. עם זאת, PTM זה דורש כמה אמצעי זהירות מיוחדים עבור זיהוי הביטחון הגבוה שלה על ידי טרשת נפוצה. ראשית, מתילציה של R היא תת-קרקעית, כאשר הצורה הלא-משתנה של הפפטידים שופעת הרבה יותר מזו ששונתה, כך שספקטרומטרים של מסה הפועלים במצב רכישה תלוית נתונים (DDA) יחלקו פפטידים בעוצמה גבוהה ללא שינוי לעתים קרובות יותר מאשר עמיתיהם בעלי המתילציה בעוצמה נמוכה יותר8. יתר על כן, רוב תהליכי העבודה מבוססי MS לזיהוי אתרים עם מתילציה R סובלים ממגבלות ברמת הניתוח הביואינפורמטי. ואכן, הזיהוי החישובי של מתיל-פפטידים נוטה לשיעורי גילוי שווא גבוהים (FDR), מכיוון ש-PTM זה הוא איזוברי לתחליפי חומצות אמינו שונים (למשל, גליצין לאלנין) ולשינויים כימיים, כגון מתיל-אסטריפיקציה של אספרטט וגלוטמט9. לפיכך, שיטות המבוססות על תיוג איזוטופים של קבוצות מתיל, כגון תיוג איזוטופים כבדים של מתיל יציב עם חומצות אמינו בתרבית תאים (hmSILAC), יושמו כאסטרטגיות אורתוגונליות לזיהוי בטוח של MS של מתילציות in vivo , והפחיתו באופן משמעותי את שיעור הביאורים החיוביים השגויים10.
לאחרונה, פרוטוקולים שונים של פרוטאום לחקר חלבונים שעברו מתילציה של R עברו אופטימיזציה. פיתוח אסטרטגיות מבוססות נוגדנים להעשרת זיקה חיסונית של R-מתיל-פפטידים הוביל לביאור של כמה מאות אתרי R-מתילציה בתאים אנושיים11,12. יתר על כן, מחקרים רבים 3,13 דיווחו כי צימוד העשרה מבוססת נוגדנים עם טכניקות הפרדת פפטידים כגון פיצול כרומטוגרפיה של HpH-RP יכול להגביר את המספר הכולל של מתיל פפטידים שזוהו.
מאמר זה מתאר אסטרטגיה ניסיונית המיועדת לזיהוי שיטתי ובטוח של אתרי R-מתילציה בתאים אנושיים, המבוססת על שלבים ביוכימיים ואנליטיים שונים: מיצוי חלבונים מתאים המסומנים ב- hmSILAC, עיכול אנזימטי כפול מקביל עם פרוטאזות טריפסין ו- LysargiNase, ולאחר מכן פיצול כרומטוגרפי של HpH-RP של פפטידים מעוכלים, יחד עם העשרת זיקה חיסונית מבוססת נוגדנים של MMA-, SDMA-, ופפטידים המכילים ADMA. לאחר מכן, כל הפפטידים המועשרים באהדה מנותחים על-ידי כרומטוגרפיה נוזלית ברזולוציה גבוהה (LC)-MS/MS במצב DDA, ונתוני MS גולמיים מעובדים על-ידי אלגוריתם MaxQuant לזיהוי פפטידים מסוג R-מתיל-פפטידים. לבסוף, תוצאות הפלט של MaxQuant מעובדות באמצעות hmSEEKER, כלי ביואינפורמטיקה שפותח על ידי החברה לחיפוש זוגות של מתיל-פפטידים כבדים וקלים. בקצרה, hmSEEKER קורא ומסנן זיהויי מתיל-פפטידים מקובץ ה-MSMS, לאחר מכן מתאים כל מתיל-פפטיד לשיא MS1 המתאים לו בקובץ allPeptides, ולבסוף, מחפש את השיא של מקבילו הפפטיד הכבד/קל. עבור כל זוג פוטטיבי כבד-קל, מחושבים הפרמטרים Log2 H/L (LogRatio), הפרש זמן השמירה (dRT) ו- Mass Error (ME), וכפילים הממוקמים בתוך חתכים המוגדרים על-ידי המשתמש מסומנים כחיוביים אמיתיים. זרימת העבודה של הפרוטוקול הביוכימי מתוארת באיור 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate (AMBIC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>497363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colloidal Coomassie staining Instant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini, EDTA-free</td>
			<td>Roche-Sigma Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Protease Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO ThermoFisher</td>
			<td>26400-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3483-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>GIBCO ThermoFisher</td>
			<td>requested</td>
			<td>&#160;with stabile glutamine and without methionine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nano LC 1200 chromatography system</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray HPLC Columns</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ES907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerolo</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jupiter C12-RP column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4396-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5308</td>
			<td>Light (L) Methionine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine-(methyl-13C,d3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299154</td>
			<td>Heavy (H) Methionine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysargiNase</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>EMS0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtip Cell Disruptor Sonifier 250</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>GIBCO ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP</td>
			<td>Roche-Sigma Aldrich</td>
			<td>4906837001</td>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Tips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>87782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85175</td>
			<td>LC-MS Solvent B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85170</td>
			<td>LC-MS Solvent A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; Water, LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein&#160; All Blue Prestained Protein Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan antibodies &#945;-ADMA</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan antibodies &#945;-MMA</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan antibodies &#945;-SDMA</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 HPLC</td>
			<td>Dionex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Concentrator 5301</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Speed vac</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein r-methylation analysis

ארגינין חלבון (R)-מתילציה הוא שינוי חלבוני נפוץ לאחר תרגום (PTM) המעורב בוויסות של מספר מסלולים תאיים, כולל עיבוד RNA, התמרת אותות, תגובת נזק לדנ"א, ביוגנזה של miRNA ותרגום.
בשנים האחרונות, הודות להתפתחויות ביוכימיות ואנליטיות, פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות (MS) התגלתה כאסטרטגיה היעילה ביותר לאפיון מתיל פרוטאום תאי ברזולוציה של אתר יחיד. עם זאת, זיהוי ויצירת פרופיל של חלבון in vivo R-methylation על ידי טרשת נפוצה נותר מאתגר ומועד לטעויות, בעיקר בשל האופי הסובסטואיכיומטרי של שינוי זה ונוכחותם של תחליפי חומצות אמינו שונים ומתיל-אסטריפיקציה כימית של שאריות חומציות שהן איזובריות למתילציה. לפיכך, נדרשות שיטות העשרה לשיפור הזיהוי של R-מתיל-פפטידים ואסטרטגיות אימות אורתוגונליות להפחתת שיעורי גילוי כוזב (FDR) במחקרי מתיל-פרוטאומיקה.
כאן מתואר פרוטוקול שתוכנן במיוחד לזיהוי וכמות של R-מתיל-פפטידים בביטחון גבוה מדגימות תאים, אשר משלב תיוג מטבולי של תאים עם מתיונין בקידוד איזוטופים כבד (hmSILAC) ועיכול כפול של פרוטאז בתמיסה של תמצית תאים שלמים, ולאחר מכן פיצול כרומטוגרפיה לא מקוונת של שלב הפוך ב-pH גבוה (HpH-RP) והעשרת זיקה של R-מתיל-פפטידים באמצעות נוגדנים נגד פאן-R-מתיל. לאחר ניתוח טרשת נפוצה ברזולוציה גבוהה, נתונים גולמיים מעובדים תחילה עם חבילת התוכנה MaxQuant והתוצאות מנותחות לאחר מכן על ידי hmSEEKER, תוכנה המיועדת לחיפוש מעמיק של זוגות שיא MS המתאימים למתיל-פפטיד קל וכבד בתוך קבצי הפלט MaxQuant.

המאמר מתאר תהליך עבודה לזיהוי בביטחון גבוה של חלבון R-מתילציה גלובלי, המבוססת על שילוב של העיכול האנזימטי של תמצית החלבון עם שני פרוטאזות נפרדות במקביל, ולאחר מכן פיצול כרומטוגרפיה נוזלית של HpH-RP של פפטידים פרוטאוליטיים והעשרת זיקה חיסונית של פפטידים R-מתיל עם נוגדנים נגד פאן-R-מתיל (<strong class...

Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis at JoVE.com

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

ארגינין חלבון (R)-מתילציה הוא שינוי פוסט-תרגומי נרחב המווסת מסלולים ביולוגיים מרובים. ספקטרומטריית מסות היא הטכנולוגיה הטובה ביותר ליצירת פרופיל עולמי של R-מתיל-פרוטאום, כאשר היא משולבת לגישות ביוכימיות להעשרת פפטידים מותאמים. תהליך העבודה המיועד לזיהוי בביטחון גבוה של מתילציה גלובלית של R בתאים אנושיים מתואר כאן.

גישה פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות לניתוח R-מתילציה של חלבונים גלובליים ובביטחון גבוה

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

פרוטוקול זה משמעותי ביותר מכיוון שהוא מייצג את זרימת העבודה המתקדמת ביותר לניתוח גלובלי של מתילציה של חלבונים ארגינין על ידי ספקטרומטריית מסה. זוהי השיטה היחידה לזיהוי ופרופיל של חלבון R-מתילציה ברזולוציה בסגנון יחיד שאינה ניתנת להשגה בטכניקות ביוכימיות אחרות. בשילוב עם השימוש במעכבי PRMT, שחלקם נמצאים בניסויים קליניים ובתרופות אנטי-סרטניות, פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מעמיק של מנגנון הפעולה שלהם.כדי להתחיל, בצע הפחתה של קבוצת החלבונים תיול באמצעות תמיסת מלאי של DTT מומס במים אולטרה-פוריים בריכוז סופי של 4.5 מילימולאר ותן לתגובה ללכת במשך 30 דקות ב 55 מעלות צלזיוס. בצע אלקילציה של קבוצת החלבונים תיול על ידי הוספת יודואצטמיד בריכוז של 10 מילימולאר ודגרה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. כדי לוודא את יעילות הפרוטאוליזה, שמור אליקוט של תמצית חלבון לניתוח הבא על ג'ל מוכתם ב- SDS-PAGE Coomassie והשווה אותו לכמות הדגימה המתאימה בעת העיכול.דלל את תמצית החלבון הנותרת עם ארבעה נפחים של 20 מילימולר HEPES ב- pH 8.0 כדי להגיע לריכוז אוריאה סופי של שתי טוחנות. פצל את הדגימה לשני חלקים, ולאחר מכן הוסף טריפסין שונה בדירוג רצף לאחד ופרוטאז LysargiNase לשני. השאירו את הדגימות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-ThermoMixer ב-600 סיבובים לדקה כדי לאפשר עיכול אנזימטי.עבור כל שיפוע כרומטוגרפי, אסוף את כל השברים ללוח עמוק של 96 בארות. איחד את השברים שנאספו לפני תחילת ההדרגה לשבר אחד בודד בשם pre. שרשר את 60 השברים מהשיפוע הכרומטוגרפי הנוזלי בעל הפאזה ההפוכה ב- pH גבוה על-ידי איגוזם בצורה לא רציפה ל-14 שברים סופיים.כדי לקבל שרשור לא רציף, אגד את שברי הפאזה ההפוכה בעלי ה-pH הגבוה כמתואר בכתב היד של הטקסט. איחד את השברים שנאספו לאחר ההדרגה לשבר ייחודי בשם פוסט. בצע העשרה רציפה של זיקה חיסונית של הפפטיד המהונדס בנפרד עבור שתי הדגימות מעיכול טריפסין ו- LysargiNase.דלל את טיהור הזיקה החיסונית המרוכזת פי 10 או את חיץ ה-IAP 10 פעמים. צנטריפוגה פפטידים lyophilized ב 2, 000 G במשך חמש דקות כדי לסובב את הפפטידים לתחתית הצינור. השהה את הפפטידים עם 250 מיקרוליטרים של חיץ IAP מדולל לכל צינור 15 מיליליטר והעבר לצינור קשירה נמוך של 1.5 מיליליטר.השתמשו בנייר ליטמוס כדי לבדוק שה-pH גדול משישה. שמור על אליקוט קטן של כל שבר כקלט לניתוח MS הבא. פצלו כל שבר לשני חלקים כדי לבצע את ההעשרה החיסונית של פפטידים שעברו דימתילציה אסימטרית, או ADMA, ודימתילאט סימטרי, או SDMA, במקביל.הכינו שלושה בקבוקונים של הנוגדנים הנבחרים נגד פאן R-מתילציה המצומדים לחלבון A חרוזי אגרוז לכל 10 מיליגרם של תמצית החלבון הראשונית. הכן את הכמות הנכונה של נוגדנים מצומדים לחרוזי אגרוז על ידי צנטריפוגה של כל בקבוקון ב 2, 000 G במשך 30 שניות והסרת החיץ מן החרוזים. לשטוף את החרוזים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של 1X PBS על ידי צנטריפוגה אותם ב 2, 000 G במשך 30 שניות.לאחר הכביסה האחרונה, יש לתלות את החרוזים ב-40 מיקרוליטרים 1X PBS עבור כל בקבוקון, לאגור אותם ולבסוף לחלק אותם באופן שווה ל-16 שברים. הוסף 250 מיקרוליטרים של מאגר IAP 1X לכל צינור וערבב על ידי היפוך. ואז לדגור את הצינורות על גלגל מסתובב במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה, צנטריפוגה של צינורות 1.5 מיליליטר המכילים פפטידים ונוגדן פאן R-מתיל חרוזים מצומדים ב 2, 000 G במשך 30 שניות כדי לזרוק את החרוזים ולהעביר את הזרימה מכל שבר לתוך צינור קשירה נקי 1.5 מיליליטר נמוך. הוסיפו את החרוזים לזרימה המצומדת לנוגדנים נגד מתילציה R-mono וחזרו על ההדחה ל-PBS, דגירה עם חיץ IAP וצנטריפוגה. במהלך הדגירה של דגימות הפפטידים עם חרוזי מונו-מתיליזציה או MMA, שטפו את השברים שהיו בעבר חיסוניים עם אנטי-ADMA ו-SDMA עם חיץ IAP של 250 מיקרוליטרים פעמיים והשליכו את הסופר-נטנט לאחר כל שטיפה.לאחר מכן יש לשטוף במים בדרגה LC-MS שלוש פעמים. שדרגו את הפפטידים המועשרים של SDMA או ADMA מחרוזי האגרוז על ידי הוספת 50 מיקרוליטרים של 0.15 TFA לכל צינור. השאירו את הפתרון הזה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, היפוך הצינורות כל שתיים עד שלוש דקות.מעבירים את האליציה הראשונה לצינורות קשירה נמוכים של 1.5 מיליליטר נקיים וחוזרים על האלוציה עם 50 מיקרוליטרים של 0.15 TFA. איחד את שני שברי האלוציה לצינור אחד. חזור על תהליך זה עבור פפטידים R-מונו-מתילציה שהודגרו עם חרוזי נוגדנים נגד MMA.לאחר ערבוב התאים הקלים והכבדים, חלבונים הופקו והיו נתונים לעיכול על ידי טריפסין ו- LysargiNase. נעשה שימוש בג'ל מוכתם בקומסי SDS-PAGE כדי לאמת את העיכול האנזימטי היעיל של סך החלבונים בפפטידים. הוערכה היעילות של שלב הטיהור שבוצע על ידי טור C18 Sep-Pak, המאשר את היעדר הפפטידים בזרימה של עמודת C18 ובשטיפה הראשונה והשנייה, כמו גם את נוכחותם הצפויה ב- eluent.נבחנו שילוב תקין של MET4 בערוץ הכבד וערבוב כבד או קל נכון. הכרומטוגרמה מהפירומטוגרפיה הנוזלית הלא מקוונת בעלת ה-pH הגבוה ההפוך של פפטידים ושרשור הלא רציף של שברים מוצגים כאן. פפטידים זוהו על ידי 250 ננומטר UV, בעוד חלבונים פוטנציאליים שנותרו מעוכלים הוערכו על ידי 280 ננומטר UV. התקבלו ספקטרום MS מלא של פפטידים המייצגים ביאור מתיל פפטיד חיובי אמיתי.ההבדלים בין M ל-Z שנצפו בין שלוש הפסגות עולים בקנה אחד עם נוכחות של שאריות שעברו מתילציה אנזימטית. התקבלו ספקטרום MS מלא של פפטידים המייצגים ביאור מתיל פפטיד חיובי כוזב. ההבדלים בין M ל-Z שנצפו בין הפפטיד המתילציה הקל לבין מקבילו הכבד העונשי חורגים מהערך הצפוי ב-0.0312.זרימת העבודה של הפרוטוקול היא ליניארית בסך הכל, אך ישנם כמה שלבים הדורשים תשומת לב מיוחדת. לדוגמה, הפרדת הכרומטוגרפיה של IPH עם שרשור שברים לא רציף, כמו גם הגדרת ה- IP. ניתן להצמיד את אותו פרוטוקול ל-SILAC סטנדרטי או לכימות ללא תוויות כדי ליצור פרופיל של דינמיקת מתילציה של ארגינין בתגובה למגוון הפרעות.פרוטוקול זה סולל את הדרך לאפיון ההיקף והדינמיקה של מתילציה של חלבונים במספר סוגי תאים ומערכות מודל התומכות בכל ההיבטים של מחקר בסיסי ותרגומי המתמקד ב-PRMTs.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

גישת טנדם נוזלת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה מבוססת עבור ניתוח המטבוליט<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

בידוד אגל ליפידים על ניתוח כמותי ספקטרומטריית מסה

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

עיכול חלבון אולטראפילטרציה, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה כדי למטב את ניתוקה של Exosomes פלזמה דם אנושי, סרום

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

הכנת כלורופלסט תאי המשנה של תודרנית לניתוח של חלבון לוקליזציה Immunoblotting או פרוטאומיקס

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

בדיקות מבוססות-כרומטוגרפיה של נוזלים מבוססי-המסה של טבולומיקס חיטה

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...