Name: a mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein r-methylation analysis
Uploaded: 2022-04-28T12:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis at JoVE.com

MMとEMは、欧州分子医学学校(SEMM)の博士課程の学生です。EMは、3年間のFIRC-AIRC奨学金(プロジェクトコード:22506)の受領者です。結核グループのR-メチルプロテオームのグローバル分析は、AIRC IGグラント(プロジェクトコード:21834)によってサポートされています。

1.細胞培養とタンパク質抽出(時間:3〜4週間必要)
<ol><li>HeLa細胞を、それぞれ軽(L)または重(H)メチオニンのいずれかを供給された培地で並行して増殖させる(培地組成については 表1 を参照)。少なくとも8回の細胞分裂を行ったら、各SILACチャネルから細胞のアリコートを収集し、取り込み試験を実行します。 注:取り込み効率を確認するには、LC-MS / MS分析によって、ヘビーチャ?...

<ol>
	<li>Bulau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+arginine+methylation+in+free+versus+protein-incorporated+amino+acids+in+vitro+and+in+vivo+using+protein+hydrolysis+and+high-performance+liquid+chromatography.">Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography.</a> Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).</li><li>Blanc, R. S., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+methylation:+the+coming+of+age.">Arginine methylation: the coming of age.</a> Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).</li><li>Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+arginine+methylation+sites+in+human+cells+reveals+dynamic+regulation+during+transcriptional+arrest.">Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).</li><li>Yang, Y., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methyltransferases+and+cancer.">Protein arginine methyltransferases and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).</li><li>Bezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+constitutive+and+alternative+splicing+by+PRMT5+reveals+a+role+for+Mdm4+pre-mRNA+in+sensing+defects+in+the+spliceosomal+machinery.">Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery.</a> Genes &amp; Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).</li><li>Auclair, Y., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+arginine+methylation+in+the+DNA+damage+response.">The role of arginine methylation in the DNA damage response.</a> DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).</li><li>Spadotto, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT1-mediated+methylation+of+the+microprocessor-associated+proteins+regulates+microRNA+biogenesis.">PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).</li><li>Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+computational+approaches+for+the+large-scale+analysis+of+protein+arginine+methylation+by+mass+spectrometry.">Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry.</a> Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).</li><li>Ong, S. -. E., Mittler, G., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+and+quantifying+in+vivo+methylation+sites+by+heavy+methyl+SILAC.">Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC.</a> Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).</li><li>Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+mass+spectrometry-based+identifications+of+enzyme-mediated+protein+methylation+are+subject+to+high+false+discovery+rates.">Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).</li><li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methylation+in+mammals:+who,+what,+and+why.">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).</li><li>Larsen, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+analysis+of+arginine+monomethylation+reveals+widespread+occurrence+in+human+cells.">Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells.</a> Science Signaling. 9 (443), (2016).</li><li>Massignani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hmSEEKER:+Identification+of+hmSILAC+doublets+in+MaxQuant+output+data.">hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data.</a> Proteomics. 19 (5), 1800300 (2019).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+the+sulfhydryl+reductants+tris(2-carboxyethyl)phosphine+and+dithiothreitol+for+use+in+protein+biochemistry.">A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry.</a> Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).</li><li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry.">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li><li>Huesgen, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LysargiNase+mirrors+trypsin+for+protein+C-terminal+and+methylation-site+identification.">LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification.</a> Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896 (2007).</li><li>Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+protein+methylation+profiling+by+combined+chemical+and+immunoaffinity+approaches+reveals+novel+PRMT1+targets.">Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).</li><li>Bremang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+identification+and+characterisation+of+lysine+and+arginine+methylation+in+the+human+proteome.">Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome.</a> Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).</li><li>Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+arginine+methylation+in+primary+T+cells+reveals+regulatory+roles+in+cell+signalling.">Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).</li><li>Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+basic+residue+content+on+fragment+ion+peak+intensities+in+low-energy+collision-induced+dissociation+spectra+of+peptides.">Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides.</a> Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).</li><li>Guthals, A., Bandeira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+identification+by+tandem+mass+spectrometry+with+alternate+fragmentation+modes.">Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).</li><li>Swaney, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supplemental+activation+method+for+high-efficiency+electron-transfer+dissociation+of+doubly+protonated+peptide+precursors.">Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors.</a> Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).</li><li>Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle-down+proteomics+reveals+dense+sites+of+methylation+and+phosphorylation+in+arginine-rich+RNA-binding+proteins.">Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins.</a> Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).</li><li>Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-line+high-pH+reversed-phase+fractionation+for+in-depth+phosphoproteomics.">Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics.</a> Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).</li><li>Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pH+reversed-phase+chromatography+with+fraction+concatenation+for+2D+proteomic+analysis.">High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis.</a> Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).</li><li>Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+protein+methylation+profiling+by+combined+chemical+and+immunoaffinity+approaches+reveals+novel+PRMT1+targets.">Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).</li><li>Uhlmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+large-scale+identification+of+protein+arginine+methylation.">A method for large-scale identification of protein arginine methylation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-free+approach+for+the+global+analysis+of+protein+methylation.">Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation.</a> Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).</li><li>Moore, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+molecular+affinity+strategy+for+global+detection+and+proteomic+analysis+of+lysine+methylation.">A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation.</a> Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+proteomics+approach+for+global+analysis+of+lysine+monomethylome+profiling.">A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).</li><li>Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+arginine+methylation+sites+in+human+cells+reveals+dynamic+regulation+during+transcriptional+arrest.">Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).</li><li>Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MethylQuant:+A+Tool+for+Sensitive+Validation+of+Enzyme-Mediated+Protein+Methylation+Sites+from+Heavy-Methyl+SILAC+Data.">MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).</li></ol>

グローバルMSベースのプロテオミクスによる in vivo タンパク質/ペプチドメチル化の高信頼同定は、高いFDRのリスクのために困難であり、メチル化に同重体であり、直交MS検証戦略がない場合に誤った割り当てを引き起こす可能性のあるサンプル調製中にいくつかのアミノ酸置換およびメチルエステル化が発生します。このPTMの化学量論的性質は、グローバルなメチルプロテオミクスの?...

アルギニン(R)-メチル化は、哺乳類プロテオームの約1%を修飾する翻訳後修飾(PTM)です1。タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ(PRMT)は、Rの側鎖のグアニジノ基の窒素(N)原子に1つまたは2つのメチル基を対称的または不斉に沈着させることによってR-メチル化反応を触媒する酵素です。哺乳動物では、PRMTは、モノメチル化(MMA)と不斉ジメチル化(ADMA)、MMAと対称ジメチル化(SDMA)の両方を沈着させる能力に応じて、タイプI、タイプII、およびタイプIIIの3つのクラスに分類でき、それぞれMMAのみである2,3。PRMTは主に、GARモチーフとして知られるグリシンおよびアルギニンリッチ領域内に位置するR残基を標的としていますが、PRMT5やCARM1などの一部のPRMTは、プロリン-グリシン-メチオニンリッチ(PGM)モチーフをメチル化することができます4。R-メチル化は、RNAスプライシング5、DNA修復6、miRNA生合成7、翻訳2など、いくつかの生物学的プロセスのタンパク質調節因子として浮上しており、このPTMの研究を促進しています。
質量分析(MS)は、タンパク質、ペプチド、および部位分解能での全体的なR-メチル化を体系的に研究するための最も効果的な技術として認識されています。ただし、このPTMは、MSによる信頼性の高い識別のためにいくつかの特別な予防措置を必要とします。第一に、R-メチル化は化学量論的であり、修飾されていないペプチドは修飾されたペプチドよりもはるかに豊富であるため、データ依存取得(DDA)モードで動作する質量分析計は、低強度のメチル化ペプチドよりも高強度の非修飾ペプチドを断片化する頻度が高くなります8。さらに、R-メチル化部位同定のためのほとんどのMSベースのワークフローは、バイオインフォマティクス解析レベルでの制限に悩まされています。実際、メチルペプチドの計算同定は、このPTMが様々なアミノ酸置換(例えば、グリシンからアラニンへ)およびアスパラギン酸およびグルタミン酸のメチルエステル化などの化学修飾に同重体であるため、高い偽発見率(FDR)を起こしやすい9。したがって、細胞培養中のアミノ酸による重メチル安定同位体標識(hmSILAC)などのメチル基の同位体標識に基づく方法は、 in vivo メチル化の信頼性の高いMS同定のための直交戦略として実装されており、偽陽性アノテーションの割合を大幅に低減しています10。
最近、R-メチル化タンパク質を研究するためのさまざまなプロテオームワイドプロトコルが最適化されています。R-メチルペプチドの免疫親和性濃縮のための抗体ベースの戦略の開発は、ヒト細胞における数百のR-メチル化部位のアノテーションをもたらした11,12。さらに、多くの研究3,13では、抗体ベースの濃縮をHpH-RPクロマトグラフィー分画などのペプチド分離技術と結合させることで、同定されたメチルペプチドの総数を増やすことができると報告されています。
この記事では、さまざまな生化学的および分析ステップに基づいて、ヒト細胞のR-メチル化部位を体系的かつ信頼性の高い同定のために設計された実験戦略について説明します:hmSILAC標識細胞からのタンパク質抽出、トリプシンおよびリサルギナーゼプロテアーゼによる並行二重酵素消化、それに続く消化ペプチドのHpH-RPクロマトグラフィー分画、MMA-、SDMA-の抗体ベースの免疫親和性濃縮と組み合わせた、 およびADMA含有ペプチド。次に、すべてのアフィニティーが豊富なペプチドをDDAモードの高分解能液体クロマトグラフィー(LC)-MS/MSで分析し、生のMSデータをMaxQuantアルゴリズムで処理してR-メチルペプチドを同定します。最後に、MaxQuantの出力結果は、重金属ペプチドと軽メチルペプチドのペアを検索するために自社開発のバイオインフォマティクスツールであるhmSEEKERで処理されます。簡単に言うと、hmSEEKERはmsmsファイルからメチルペプチドの同定を読み取ってフィルタリングし、各メチルペプチドをallPeptidesファイル内の対応するMS1ピークと照合し、最後に重/軽ペプチドのピークを検索します。推定される重照度ペアごとに、Log2 H/L比(LogRatio)、保持時間差(dRT)、および質量誤差(ME)パラメータが計算され、ユーザー定義のカットオフ内にあるダブレットが真陽性としてラベル付けされます。生化学的プロトコルのワークフローを 図1に示します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate (AMBIC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>497363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colloidal Coomassie staining Instant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini, EDTA-free</td>
			<td>Roche-Sigma Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Protease Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO ThermoFisher</td>
			<td>26400-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3483-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>GIBCO ThermoFisher</td>
			<td>requested</td>
			<td>&#160;with stabile glutamine and without methionine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nano LC 1200 chromatography system</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray HPLC Columns</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ES907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerolo</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jupiter C12-RP column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4396-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5308</td>
			<td>Light (L) Methionine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine-(methyl-13C,d3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299154</td>
			<td>Heavy (H) Methionine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysargiNase</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>EMS0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtip Cell Disruptor Sonifier 250</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>GIBCO ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP</td>
			<td>Roche-Sigma Aldrich</td>
			<td>4906837001</td>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Tips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>87782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85175</td>
			<td>LC-MS Solvent B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85170</td>
			<td>LC-MS Solvent A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; Water, LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein&#160; All Blue Prestained Protein Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan antibodies &#945;-ADMA</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan antibodies &#945;-MMA</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan antibodies &#945;-SDMA</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 HPLC</td>
			<td>Dionex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Concentrator 5301</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Speed vac</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein r-methylation analysis

タンパク質アルギニン(R)-メチル化は、RNAプロセシング、シグナル伝達、DNA損傷応答、miRNA生合成、翻訳など、いくつかの細胞経路の調節に関与する広範なタンパク質翻訳後修飾(PTM)です。
近年、生化学的および分析的開発のおかげで、質量分析(MS)ベースのプロテオミクスが、単一部位分解能で細胞のメチルプロテオームを特徴付けるための最も効果的な戦略として浮上しています。しかし、MSによる in vivo タンパク質R-メチル化の同定とプロファイリングは、主にこの修飾の化学量論的性質と、さまざまなアミノ酸置換の存在、およびメチル化に同重な酸性残基の化学的メチルエステル化のために、依然として困難でエラーが発生しやすいままです。したがって、R-メチルペプチドの同定を強化するための濃縮法と、メチルプロテオミクス研究における偽発見率(FDR)を低減するための直交検証戦略が必要です。
ここでは、細胞サンプルからの高信頼性R-メチルペプチドの同定と定量のために特別に設計されたプロトコルについて説明し、細胞の代謝標識を重同位体コードメチオニン(hmSILAC)および二重プロテアーゼ溶液中消化で全細胞抽出物に結合し、その後、オフライン高pH逆相(HpH-RP)クロマトグラフィー分画と抗汎-R-メチル抗体を使用したR-メチルペプチドのアフィニティー濃縮を行います。高分解能MS分析では、生データはまずMaxQuantソフトウェアパッケージで処理され、その結果はMaxQuant出力ファイル内の軽メチルペプチドと重メチルペプチドに対応するMSピークペアの詳細な検索用に設計されたソフトウェアであるhmSEEKERによって分析されます。

本稿では、タンパク質抽出物の酵素消化と2つの異なるプロテアーゼの並列処理、それに続くタンパク質分解ペプチドのHpH-RP液体クロマトグラフィー分画、および抗汎-R-メチル抗体によるR-メチルペプチドの免疫親和性濃縮の組み合わせに基づく、グローバルプロテインR-メチル化の高信頼性同定のワークフローについて説明します(図1)。
細胞は、天...

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A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

タンパク質アルギニン(R)-メチル化は、複数の生物学的経路を調節する広範な翻訳後修飾です。質量分析は、修飾ペプチド濃縮のための生化学的アプローチと組み合わせると、R-メチルプロテオームをグローバルにプロファイリングするための最良の技術です。ここでは、ヒト細胞における全体的なR-メチル化を高信頼で同定するために設計されたワークフローについて説明します。

質量分析に基づくプロテオミクスアプローチによるグローバルで信頼性の高いタンパク質R-メチル化分析

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

このプロトコルは、質量分析によるタンパク質アルギニンメチル化のグローバル分析のための最先端のワークフローを表すため、非常に重要です。これは、他の生化学的手法では達成できない単一のスタイル分解能でR-メチル化タンパク質を同定およびプロファイリングする唯一の方法です。PRMT阻害剤(そのうちのいくつかは臨床試験中および抗がん剤)の使用と組み合わせると、このプロトコルはそれらの作用機序の詳細な分析を可能にする。まず、終濃度4.5ミリモルの超純水に溶解したDTTの原液を用いてタンパク質のチオール基の還元を行い、55°Cで30分間反応させます。ヨードアセトアミドを10ミリモルの濃度で添加し、暗所で室温で15分間インキュベートすることにより、タンパク質のチオール基のアルキル化を行う。タンパク質分解効率を検証するには、SDS-PAGEクーマシー染色ゲルでその後の分析のためにタンパク質抽出物のアリコートを保存し、消化時に対応する量のサンプルと比較します。残りのタンパク質抽出物をpH 8.0で4容量の20ミリモルHEPESで希釈して、最終尿素濃度2モルに達します。サンプルを2つの部分に分割し、シーケンシンググレードの修飾トリプシンを一方に、LysargiNaseプロテアーゼをもう一方に追加します。酵素消化を可能にするために、サンプルを摂氏37度で600回転のサーモミキサーで一晩放置します。クロマトグラフィーグラジエントごとに、すべての画分を深い96ウェルプレートに集めます。勾配の開始前に収集された分数を、preという名前の1つの分数にプールします。高pH逆相液体クロマトグラフィーグラジエントからの60個のフラクションを、連続していない方法で14個の最終フラクションにプールすることにより、連結します。非連続連結を得るためには、テキスト原稿に記載されているように、高pH逆相画分をプールする。勾配の後に収集された分数を、postという名前の一意の分数にプールします。トリプシンおよびリサルギナーゼ消化からの2つのサンプルに対して、修飾ペプチドの連続免疫親和性濃縮を別々に実行します。10倍濃縮イムノアフィニティー精製またはIAPバッファーを10倍に希釈します。凍結乾燥ペプチドを2, 000 Gで5分間遠心分離し、ペプチドをチューブの底までスピンダウンします。15ミリリットルのチューブあたり250マイクロリットルの希釈IAPバッファーでペプチドを再懸濁し、1.5ミリリットルの低結合チューブに移します。リトマス紙を使用して、pHが6を超えていることを確認します。後続のMS分析の入力として、各フラクションの少量のアリコートを保持します。各画分を2つの部分に分割して、非対称ジメチル化(ADMA)ペプチドと対称ジメチル化(SDMA)ペプチドの免疫濃縮を並行して行う。プロテインAアガロースビーズに結合した選択された抗パンR-メチル化抗体のバイアルを、初期タンパク質抽出物10ミリグラムあたり3つ調製する。各バイアルを2, 000 Gで30秒間遠心分離し、ビーズからバッファーを除去することにより、アガロースビーズに結合した正しい量の抗体を調製します。ビーズを2, 000 Gで30秒間遠心分離することにより、1ミリリットルの1X PBSで3回洗浄します。最後の洗浄後、ビーズを各バイアルの40マイクロリットルの1X PBSに再懸濁し、プールしてから、最後に16の画分に均等に分割します。各チューブに250マイクロリットルの1X IAPバッファーを加え、反転させて混合します。次に、回転ホイールでチューブを摂氏4度で2時間インキュベートします。インキュベーション後、ペプチドとパンR-メチル抗体結合ビーズを含む1.5ミリリットルのチューブを2, 000 Gで30秒間遠心分離してビーズをペレット化し、各フラクションからのフロースルーを清潔な1.5ミリリットルの低結合チューブに移します。R-monoメチル化に対する抗体に結合させたフロースルーにビーズを加え、PBSへの再懸濁、IAPバッファーとのインキュベーション、遠心分離を繰り返します。モノメチル化またはMMAビーズとのペプチドサンプルのインキュベーション中に、抗ADMAおよびSDMAで以前に免疫沈降した画分を250マイクロリットルのIAPバッファーで2回洗浄し、各洗浄後に上清を廃棄します。その後、LC-MSグレードの水で3回洗浄します。アガロースビーズからアフィニティー濃縮SDMAまたはADMAペプチドを溶出するには、各チューブに50マイクロリットルの0.15 TFAを加えます。この溶液を室温で10分間放置し、2〜3分ごとにチューブを反転させます。最初の溶出液を清潔な1.5ミリリットルの低結合チューブに移し、50マイクロリットルの0.15 TFAで溶出を繰り返します。2つの溶出画分を1本のチューブにプールします。抗MMA抗体ビーズと一緒にインキュベートしたR-モノメチル化ペプチドについて、このプロセスを繰り返します。軽標識細胞と重標識細胞を混合した後、タンパク質を抽出し、トリプシンおよびリサルギナーゼによる消化を行った。SDS-PAGEクーマシー染色ゲルを使用して、ペプチド中の総タンパク質の効率的な酵素消化を検証しました。C18 Sep-Pakカラムで行った精製工程の効率を評価し、C18カラムのフロースルーおよび1回目と2回目の洗浄、および溶離液中にペプチドが存在しないことを確認しました。重いチャネルへの適切なMET4の組み込みと、正しい重または軽混合が評価されました。ペプチドのオフライン高pH逆相液体クロマトグラフィー分画およびその後の画分の非連続連結からのクロマトグラムをここに示す。ペプチドは250ナノメートルのUVで検出され、潜在的に残っている未消化のタンパク質は280ナノメートルのUVで評価されました。真陽性メチルペプチドアノテーションを表すペプチドの完全なMSスペクトルが得られた。3つのピーク間で観察されるMオーバーZの差は、酵素的にメチル化された残基の存在と一致する。偽陽性のメチルペプチドアノテーションを表すペプチドの完全なMSスペクトルが得られた。軽メチル化ペプチドとその懲罰的重ペプチドとの間に観察されたMオーバーZ差は、期待値から0.0312だけずれている。プロトコルのワークフローは全体的に直線的ですが、特別な注意が必要な手順がいくつかあります。例えば、非連続画分連結によるIPHクロマトグラフィー分離、およびIPセットアップ。同じプロトコルを標準的なSILACまたはラベルフリー定量のいずれかと組み合わせて、さまざまな摂動に応答するアルギニンメチル化ダイナミクスをプロファイリングできます。このプロトコルは、PRMTに焦点を当てた基礎研究とトランスレーショナル研究のすべての側面をサポートするいくつかの細胞タイプとモデルシステムにおけるタンパク質メチル化の範囲とダイナミクスの特性評価への道を開きます。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

代謝産物分析のためのタンデム液体クロマトグラフィー - 質量分析に基づくアプローチ<em&gt;黄色ブドウ球菌</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

定量的質量分析のための脂肪滴の分離

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

エクソソームおよび人間の血液からの分離を最適化するためにタンパク質の消化が、限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィー

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

低親和性受容体-リガンド相互作用のハイスループット検出の細胞外タンパク質マイクロ アレイ技術

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

免疫ブロットやプロテオミクスによるタンパク質局在の解析シロイヌナズナから葉緑体小班の準備

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

無標的液体クロマトグラフィー-質量分析法ベースの小麦粒のメタボロミクス分析

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...