Name: a mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein r-methylation analysis
Uploaded: 2022-04-28T12:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis at JoVE.com

MM og EM er ph.d.-studenter ved European School of Molecular Medicine (SEMM). EM er mottaker av et 3-årig FIRC-AIRC-stipend (prosjektkode: 22506). Globale analyser av R-metylproteomer i TB-gruppen støttes av AIRC IG Grant (Prosjektkode: 21834).

1. Celledyrking og proteinekstraksjon (tid: 3 - 4 uker kreves)
<ol><li>Dyrk HeLa-celler parallelt i medier som leveres med henholdsvis lett (L) eller tung (H) metionin (se tabell 1 for mediesammensetning). Ved minst åtte celledelinger samler du en aliquot av celler fra hver SILAC-kanal og utfører inkorporeringstesten. MERK: For å sjekke inkorporeringseffektiviteten, test ved LC-MS / MS-analyse at prosentandelen tung metionin (Met-4) i Heavy-kanalen er så nær som mulig til 100%. Analyser en aliq...

<ol>
	<li>Bulau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+arginine+methylation+in+free+versus+protein-incorporated+amino+acids+in+vitro+and+in+vivo+using+protein+hydrolysis+and+high-performance+liquid+chromatography.">Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography.</a> Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).</li><li>Blanc, R. S., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+methylation:+the+coming+of+age.">Arginine methylation: the coming of age.</a> Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).</li><li>Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+arginine+methylation+sites+in+human+cells+reveals+dynamic+regulation+during+transcriptional+arrest.">Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).</li><li>Yang, Y., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methyltransferases+and+cancer.">Protein arginine methyltransferases and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).</li><li>Bezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+constitutive+and+alternative+splicing+by+PRMT5+reveals+a+role+for+Mdm4+pre-mRNA+in+sensing+defects+in+the+spliceosomal+machinery.">Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery.</a> Genes &amp; Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).</li><li>Auclair, Y., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+arginine+methylation+in+the+DNA+damage+response.">The role of arginine methylation in the DNA damage response.</a> DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).</li><li>Spadotto, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT1-mediated+methylation+of+the+microprocessor-associated+proteins+regulates+microRNA+biogenesis.">PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).</li><li>Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+computational+approaches+for+the+large-scale+analysis+of+protein+arginine+methylation+by+mass+spectrometry.">Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry.</a> Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).</li><li>Ong, S. -. E., Mittler, G., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+and+quantifying+in+vivo+methylation+sites+by+heavy+methyl+SILAC.">Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC.</a> Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).</li><li>Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+mass+spectrometry-based+identifications+of+enzyme-mediated+protein+methylation+are+subject+to+high+false+discovery+rates.">Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).</li><li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methylation+in+mammals:+who,+what,+and+why.">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).</li><li>Larsen, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+analysis+of+arginine+monomethylation+reveals+widespread+occurrence+in+human+cells.">Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells.</a> Science Signaling. 9 (443), (2016).</li><li>Massignani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hmSEEKER:+Identification+of+hmSILAC+doublets+in+MaxQuant+output+data.">hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data.</a> Proteomics. 19 (5), 1800300 (2019).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+the+sulfhydryl+reductants+tris(2-carboxyethyl)phosphine+and+dithiothreitol+for+use+in+protein+biochemistry.">A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry.</a> Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).</li><li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry.">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li><li>Huesgen, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LysargiNase+mirrors+trypsin+for+protein+C-terminal+and+methylation-site+identification.">LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification.</a> Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896 (2007).</li><li>Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+protein+methylation+profiling+by+combined+chemical+and+immunoaffinity+approaches+reveals+novel+PRMT1+targets.">Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).</li><li>Bremang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+identification+and+characterisation+of+lysine+and+arginine+methylation+in+the+human+proteome.">Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome.</a> Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).</li><li>Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+arginine+methylation+in+primary+T+cells+reveals+regulatory+roles+in+cell+signalling.">Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).</li><li>Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+basic+residue+content+on+fragment+ion+peak+intensities+in+low-energy+collision-induced+dissociation+spectra+of+peptides.">Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides.</a> Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).</li><li>Guthals, A., Bandeira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+identification+by+tandem+mass+spectrometry+with+alternate+fragmentation+modes.">Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).</li><li>Swaney, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supplemental+activation+method+for+high-efficiency+electron-transfer+dissociation+of+doubly+protonated+peptide+precursors.">Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors.</a> Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).</li><li>Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle-down+proteomics+reveals+dense+sites+of+methylation+and+phosphorylation+in+arginine-rich+RNA-binding+proteins.">Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins.</a> Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).</li><li>Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-line+high-pH+reversed-phase+fractionation+for+in-depth+phosphoproteomics.">Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics.</a> Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).</li><li>Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pH+reversed-phase+chromatography+with+fraction+concatenation+for+2D+proteomic+analysis.">High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis.</a> Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).</li><li>Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+protein+methylation+profiling+by+combined+chemical+and+immunoaffinity+approaches+reveals+novel+PRMT1+targets.">Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).</li><li>Uhlmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+large-scale+identification+of+protein+arginine+methylation.">A method for large-scale identification of protein arginine methylation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-free+approach+for+the+global+analysis+of+protein+methylation.">Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation.</a> Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).</li><li>Moore, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+molecular+affinity+strategy+for+global+detection+and+proteomic+analysis+of+lysine+methylation.">A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation.</a> Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+proteomics+approach+for+global+analysis+of+lysine+monomethylome+profiling.">A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).</li><li>Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+arginine+methylation+sites+in+human+cells+reveals+dynamic+regulation+during+transcriptional+arrest.">Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).</li><li>Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MethylQuant:+A+Tool+for+Sensitive+Validation+of+Enzyme-Mediated+Protein+Methylation+Sites+from+Heavy-Methyl+SILAC+Data.">MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).</li></ol>

Den høye konfidensidentifiseringen av in vivo protein / peptidmetylering ved global MS-basert proteomikk er utfordrende, på grunn av risikoen for høy FDR, med flere aminosyresubstitusjoner og metylesterifisering som oppstår under prøvepreparering som er isobarisk til metylering og kan forårsake feil oppgaver i fravær av ortogonale MS-valideringsstrategier. Den substøkiometriske naturen til denne PTM kompliserer ytterligere oppgaven med global metylproteomikk, men kan overvinnes med selektiv anrikning av ...

Arginin (R)-metylering er en posttranslasjonell modifikasjon (PTM) som dekorerer rundt 1% av pattedyrproteomet1. Protein Arginine Methyltransferases (PRMTs) er enzymene som katalyserer R-metyleringsreaksjon ved avsetning av en eller to metylgrupper til nitrogen (N) atomer av guanidino-gruppen i sidekjeden til R på en symmetrisk eller asymmetrisk måte. Hos pattedyr kan PRMT grupperes i tre klasser - type I, type II og type III - avhengig av deres evne til å deponere både monometylering (MMA) og asymmetrisk di-metylering (ADMA), MMA og symmetrisk di-metylering (SDMA) eller bare MMA, henholdsvis 2,3. PRMT-er retter seg hovedsakelig mot R-rester som ligger innenfor glycin- og argininrike regioner, kjent som GAR-motiver, men noen PRMT-er, som PRMT5 og CARM1, kan metylatprolin-glycin-metioninrike (PGM) motiver4. R-metylering har dukket opp som en proteinmodulator av flere biologiske prosesser, for eksempel RNA-spleising5, DNA-reparasjon6, miRNA-biogenese7 og oversettelse2, og fremmer forskningen på denne PTM.
Massespektrometri (MS) er anerkjent som den mest effektive teknologien for systematisk å studere global R-metylering ved protein-, peptid- og stedsoppløsning. Imidlertid krever denne PTM noen spesielle forholdsregler for sin identifisering av MS med høy tillit. For det første er R-metylering substøkiometrisk, med den umodifiserte formen av peptidene som er mye mer rikelig enn de modifiserte, slik at massespektrometre som opererer i DDA-modus (Data Dependent Acquisition) vil fragmentere høyintensitets umodifiserte peptider oftere enn deres metylerte kolleger med lavere intensitet8. Videre lider de fleste MS-baserte arbeidsflyter for R-metylert stedsidentifikasjon av begrensninger på bioinformatisk analysenivå. Faktisk er beregningsidentifikasjonen av metylpeptider utsatt for høye falske oppdagelsesrater (FDR), fordi denne PTM er isobarisk til forskjellige aminosyresubstitusjoner (f.eks. Glycin til alanin) og kjemisk modifikasjon, som metylesterifisering av aspartat og glutamat9. Derfor har metoder basert på isotopmerking av metylgrupper, som Heavy Methyl Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell culture (hmSILAC), blitt implementert som ortogonale strategier for sikker MS-identifisering av in vivo metyleringer, noe som reduserer frekvensen av falske positivemerknader betydelig.
Nylig har ulike proteom-brede protokoller for å studere R-metylerte proteiner blitt optimalisert. Utviklingen av antistoffbaserte strategier for immunaffinitetsberikelse av R-metylpeptider har ført til annotering av flere hundre R-metylerte steder i humane celler11,12. Videre rapporterte mange studier 3,13 at kobling av antistoffbasert anrikning med peptidseparasjonsteknikker som HpH-RP-kromatografifraksjonering kan øke det totale antallet identifiserte metylpeptider.
Denne artikkelen beskriver en eksperimentell strategi designet for systematisk og høy konfidensidentifikasjon av R-metylerte steder i humane celler, basert på ulike biokjemiske og analytiske trinn: proteinekstraksjon fra hmSILAC-merkede celler, parallell dobbel enzymatisk fordøyelse med Trypsin- og LysargiNase-proteaser, etterfulgt av HpH-RP kromatografisk fraksjonering av fordøyde peptider, kombinert med antistoffbasert immunaffinitetsberikelse av MMA-, SDMA-, og ADMA-holdige peptider. Alle affinitetsberikede peptider analyseres deretter ved høyoppløselig væskekromatografi (LC)-MS/MS i DDA-modus, og rå MS-data behandles av MaxQuant-algoritmen for identifisering av R-metylpeptider. Til slutt behandles MaxQuant-utgangsresultatene med hmSEEKER, et internt utviklet bioinformatikkverktøy for å søke par tunge og lette metylpeptider. Kort fortalt leser og filtrerer hmSEEKER metylpeptididentifikasjoner fra msms-filen, matcher deretter hvert metylpeptid til den tilsvarende MS1-toppen i allPeptides-filen, og til slutt søker toppen av den tunge / lette peptidmotparten. For hvert antatte tunge lyspar beregnes Log2 H / L-forholdet (LogRatio), Retention Time difference (dRT) og Mass Error (ME) parametere, og dubletter som ligger innenfor brukerdefinerte avskjæringer er merket som sanne positiver. Arbeidsflyten til den biokjemiske protokollen er beskrevet i figur 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate (AMBIC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>497363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colloidal Coomassie staining Instant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini, EDTA-free</td>
			<td>Roche-Sigma Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Protease Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO ThermoFisher</td>
			<td>26400-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3483-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>GIBCO ThermoFisher</td>
			<td>requested</td>
			<td>&#160;with stabile glutamine and without methionine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nano LC 1200 chromatography system</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray HPLC Columns</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ES907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerolo</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jupiter C12-RP column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4396-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5308</td>
			<td>Light (L) Methionine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine-(methyl-13C,d3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299154</td>
			<td>Heavy (H) Methionine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysargiNase</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>EMS0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtip Cell Disruptor Sonifier 250</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>GIBCO ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP</td>
			<td>Roche-Sigma Aldrich</td>
			<td>4906837001</td>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Tips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>87782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85175</td>
			<td>LC-MS Solvent B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85170</td>
			<td>LC-MS Solvent A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; Water, LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein&#160; All Blue Prestained Protein Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan antibodies &#945;-ADMA</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan antibodies &#945;-MMA</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan antibodies &#945;-SDMA</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 HPLC</td>
			<td>Dionex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Concentrator 5301</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Speed vac</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein r-methylation analysis

Protein arginin (R) -metylering er en utbredt protein post-translasjonell modifikasjon (PTM) involvert i regulering av flere cellulære veier, inkludert RNA-behandling, signaltransduksjon, DNA-skaderespons, miRNA-biogenese og oversettelse.
I de senere år, takket være biokjemisk og analytisk utvikling, har massespektrometri (MS) -basert proteomikk dukket opp som den mest effektive strategien for å karakterisere det cellulære metylproteomet med enkeltstedsoppløsning. Imidlertid er identifisering og profilering in vivo protein R-metylering ved MS fortsatt utfordrende og feilutsatt, hovedsakelig på grunn av den substøkiometriske karakteren av denne modifikasjonen og tilstedeværelsen av forskjellige aminosyresubstitusjoner og kjemisk metylesterifisering av sure rester som er isobariske til metylering. Dermed er det nødvendig med anrikningsmetoder for å forbedre identifiseringen av R-metylpeptider og ortogonale valideringsstrategier for å redusere falske oppdagelsesrater (FDR) i metylproteomikkstudier.
Her beskrives en protokoll spesielt utviklet for høy konfidens R-metyl-peptider identifikasjon og kvantifisering fra cellulære prøver, som par metabolsk merking av celler med tung isotopkodet metionin (hmSILAC) og dobbel protease i løsningen fordøyelse av hele celleekstrakt, etterfulgt av off-line High-pH reversert fase (HpH-RP) kromatografifraksjonering og affinitetsberikelse av R-metylpeptider ved bruk av anti-pan-R-metylantistoffer. Ved høyoppløselig MS-analyse behandles rådata først med MaxQuant-programvarepakken, og resultatene analyseres deretter av hmSEEKER, en programvare designet for grundig søk av MS-topppar som tilsvarer lett og tungt metylpeptid i MaxQuant-utdatafilene.

Artikkelen beskriver en arbeidsflyt for identifisering av det globale proteinet R-metylering med høy konfidens, som er basert på kombinasjonen av den enzymatiske fordøyelsen av proteinekstraktet med to forskjellige proteaser parallelt, etterfulgt av HpH-RP væskekromatografifraksjonering av proteolytiske peptider og immunoaffinitetsberikelse av R-metylpeptider med anti-pan-R-metylantistoffer (figur 1).
Cellene ble dyrket i nærvær av metionin, enten naturlig (...

Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis at JoVE.com

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

Protein arginin (R) -metylering er en utbredt post-translasjonell modifikasjon som regulerer flere biologiske veier. Massespektrometri er den beste teknologien for å globalt profilere R-metyl-proteomet, når det kombineres med biokjemiske tilnærminger for modifisert peptidberikelse. Arbeidsflyten designet for identifisering av global R-metylering i humane celler med høy tillit er beskrevet her.

En massespektrometribasert proteomikktilnærming for global og høykonfidensprotein R-metyleringsanalyse

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Denne protokollen er svært viktig fordi den representerer den nyeste arbeidsflyten for global analyse av proteinargininmetylering ved massespektrometri. Dette er den eneste metoden for å identifisere og profilere R-metylert protein med en enkelt stiloppløsning som ikke er oppnåelig med andre biokjemiske teknikker. Når kombinert med bruk av PRMT-hemmere, hvorav flere er i kliniske studier og anti-kreftmedisiner, tillater denne protokollen en grundig analyse av deres virkningsmekanisme.For å begynne, utfør reduksjon av tiolgruppen av proteiner ved bruk av en stamløsning av DTT oppløst i ultrarent vann ved en endelig konsentrasjon på 4,5 millimolar og la reaksjonen gå i 30 minutter ved 55 grader Celsius. Utfør alkylering av tiolgruppen av proteiner ved å tilsette iodoacetamid i en konsentrasjon på 10 millimolar og inkubere i 15 minutter ved romtemperatur i mørket. For å verifisere proteolyseeffektiviteten, lagre en aliquot av proteinekstrakt for etterfølgende analyse på SDS-PAGE Coomassie-farget gel og sammenlign den med en tilsvarende mengde prøve ved fordøyelsen.Fortynn det gjenværende proteinekstraktet med fire volumer på 20 millimolar HEPES ved pH 8,0 for å nå en endelig ureakonsentrasjon på to molarer. Del prøven i to deler, og legg deretter sekvenseringsgrad modifisert trypsin til den ene og LysargiNase protease til den andre. La prøvene stå over natten ved 37 grader Celsius i en ThermoMixer ved 600 rotasjoner per minutt for å tillate enzymatisk fordøyelse.For hver kromatografiske gradient samler du alle fraksjonene i en dyp 96-brønnsplate. Slå sammen brøkene som er samlet inn før starten av gradienten til en enkelt brøk som heter pre. Sammenkoble de 60 fraksjonene fra den høye pH-reverserte fasevæskekromatografiske gradienten ved å samle dem på en ikke-sammenhengende måte til 14 endelige fraksjoner.For å oppnå ikke-sammenhengende sammenkobling, slå sammen de høye pH-reverserte fasefraksjonene som beskrevet i tekstmanuskriptet. Slå sammen brøkene som samles inn etter graderingen, til en unik brøk kalt post. Utfør sekvensiell immunaffinitetsanrikning av det modifiserte peptidet separat for de to prøvene fra trypsin- og LysargiNase-fordøyelser.Fortynn 10X konsentrert immunaffinitetsrensing eller IAP-buffer 10 ganger. Sentrifuger de lyofiliserte peptidene ved 2.000 G i fem minutter for å spinne ned peptidene til bunnen av røret. Resuspend peptidene med 250 mikroliter fortynnet IAP-buffer per 15 milliliter rør og overfør til et 1, 5 milliliter lavt bindingsrør.Bruk et lakmuspapir for å kontrollere at pH-verdien er større enn seks. Hold en liten aliquot av hver brøkdel som input for den påfølgende MS-analysen. Del hver fraksjon i to deler for å utføre immunberikelse av asymmetrisk dimetylerte, eller ADMA, og symmetrisk dimetylerte eller SDMA, peptider parallelt.Forbered tre hetteglass med de utvalgte anti-pan R-metylerte antistoffene konjugert til protein A-agaroseperler per 10 milligram av det første proteinekstraktet. Klargjør riktig mengde antistoff konjugert til agaroseperler ved å sentrifugere hvert hetteglass med 2 000 G i 30 sekunder og fjerne bufferen fra perlene. Vask perlene tre ganger med en milliliter 1X PBS ved å sentrifugere dem ved 2.000 G i 30 sekunder.Etter siste vask, resuspend perlene i 40 mikroliter 1X PBS for hvert hetteglass, samle dem og til slutt dele dem likt i 16 fraksjoner. Tilsett 250 mikroliter 1X IAP-buffer til hvert rør og bland ved å invertere. Inkuber deretter rørene på et roterende hjul i to timer ved fire grader Celsius.Etter inkubasjonen sentrifugerer 1,5 milliliter rør som inneholder peptider og panne R-metylantistoff konjugerte perler ved 2.000 G i 30 sekunder for å pelletere perlene og overføre gjennomstrømningen fra hver fraksjon til et rent 1,5 milliliter lavbindingsrør. Tilsett perlene til gjennomstrømningen konjugert til antistoffer mot R-monometylering og gjenta resuspenderingen i PBS, inkubasjon med IAP-buffer og sentrifugering. Under inkubasjonen av peptidprøvene med monometyliserings- eller MMA-perler, vask fraksjonene som tidligere var immunprecipitated med anti-ADMA og SDMA med 250 mikroliter IAP-buffer to ganger og kast supernatanten etter hver vask.Vask deretter med LC-MS klasse vann tre ganger. Elute affinitetsberikede SDMA- eller ADMA-peptider fra agaroseperlene ved å tilsette 50 mikroliter 0,15 TFA til hvert rør. La denne løsningen stå i 10 minutter ved romtemperatur, og inverter rørene hvert annet til tredje minutt.Overfør den første eluering til rene 1,5 milliliter lavbindingsrør og gjenta eluering med 50 mikroliter 0,15 TFA. Samle de to elueringsfraksjonene i ett rør. Gjenta denne prosessen for R-mono-metylerte peptider som ble inkubert med anti-MMA antistoffperler.Etter å ha blandet de lette og tunge merkede cellene, ble proteiner ekstrahert og utsatt for fordøyelse av trypsin og LysargiNase. En SDS-PAGE Coomassie-farget gel ble brukt til å verifisere effektiv enzymatisk fordøyelse av totale proteiner i peptider. Effektiviteten av rensetrinnet utført av C18 Sep-Pak-kolonnen ble evaluert, og bekreftet fraværet av peptider i gjennomstrømningen av C18-kolonnen og i første og andre vask, samt deres forventede tilstedeværelse i eluenten.Riktig MET4-inkorporering i den tunge kanalen og korrekt tung eller lett blanding ble evaluert. Kromatogrammet fra offline høy pH reversert fase væskekromatografifraksjonering av peptider og den påfølgende ikke-sammenhengende sammenkoblingen av fraksjoner er vist her. Peptider ble detektert av 250 nanometer UV, mens potensielt gjenværende ufordøyd proteiner ble evaluert av 280 nanometer UV. De fullstendige MS-spektrene av peptider som representerer ekte positiv metylpeptidnotasjon ble oppnådd.M over Z-forskjellene observert mellom de tre toppene er i samsvar med tilstedeværelsen av enzymatisk metylerte rester. De fullstendige MS-spektrene av peptider som representerer falsk positiv metylpeptidmerknad ble oppnådd. M over Z-forskjellene observert mellom det lette metylerte peptidet og dets straffende tunge motpart avviker fra forventet verdi med 0,0312.Protokollarbeidsflyten er generelt lineær, men det er noen få trinn som krever spesiell oppmerksomhet. For eksempel IPH-kromatografiseparasjon med ikke-sammenhengende fraksjonssammenkobling, samt IP-oppsettet. Den samme protokollen kan kobles til enten standard SILAC eller etikettfri kvantifisering for å profilere argininmetyleringsdynamikk som svar på en rekke forstyrrelser.Denne protokollen baner vei for karakterisering av omfanget og dynamikken av proteinmetylering i flere celletyper og modellsystemer som støtter alle aspekter av grunnleggende og translasjonell forskning fokusert på PRMT.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løse affinitetsrenset protein komplekser av Blå Native PAGE og Protein korrelasjon Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Et tandem-væskekromatografi-massespektrometri basert tilnærming for Metabolitt Analyse av<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolasjon for Quantitative massespektrometri analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein fordøyelse, ultrafiltrasjon og størrelse utelukkelse kromatografi å optimalisere isolering av Exosomes fra menneskelig blod Plasma og Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi for høy gjennomstrømning påvisning av lav affinitet reseptor-Ligand interaksjoner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Utarbeidelse av Chloroplast sub deler fra Arabidopsis for analyse av Protein lokalisering av Immunoblotting eller Proteomikk

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning av protein ubiquitination nettsteder av peptid berikelse og masse spektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Umålrettet flytende kromatografi-massespektrometribasert metabolomikkanalyse av hvetekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...