Name: a mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein r-methylation analysis
Uploaded: 2022-04-28T12:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis at JoVE.com

MM och EM är doktorander inom European School of Molecular Medicine (SEMM). EM är mottagare av ett 3-årigt FIRC-AIRC-stipendium (projektkod: 22506). Globala analyser av R-metylproteomer i TB-gruppen stöds av AIRC IG Grant (Project Code: 21834).

1. Cellodling och proteinextraktion (tid: 3 - 4 veckor krävs)
<ol><li>Odla HeLa-celler parallellt i medier som levereras med antingen lätt (L) respektive tungt (H) metionin (se tabell 1 för mediesammansättning). Vid minst åtta celldelningar, samla en alikvot av celler från varje SILAC-kanal och utför inkorporeringstestet. OBS: För att kontrollera inkorporeringseffektiviteten, testa med LC-MS / MS-analys att andelen tungt metionin (Met-4) i Heavy-kanalen är så nära som möjligt till 100%. ...

<ol>
	<li>Bulau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+arginine+methylation+in+free+versus+protein-incorporated+amino+acids+in+vitro+and+in+vivo+using+protein+hydrolysis+and+high-performance+liquid+chromatography.">Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography.</a> Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).</li><li>Blanc, R. S., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+methylation:+the+coming+of+age.">Arginine methylation: the coming of age.</a> Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).</li><li>Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+arginine+methylation+sites+in+human+cells+reveals+dynamic+regulation+during+transcriptional+arrest.">Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).</li><li>Yang, Y., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methyltransferases+and+cancer.">Protein arginine methyltransferases and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).</li><li>Bezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+constitutive+and+alternative+splicing+by+PRMT5+reveals+a+role+for+Mdm4+pre-mRNA+in+sensing+defects+in+the+spliceosomal+machinery.">Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery.</a> Genes &amp; Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).</li><li>Auclair, Y., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+arginine+methylation+in+the+DNA+damage+response.">The role of arginine methylation in the DNA damage response.</a> DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).</li><li>Spadotto, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT1-mediated+methylation+of+the+microprocessor-associated+proteins+regulates+microRNA+biogenesis.">PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).</li><li>Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+computational+approaches+for+the+large-scale+analysis+of+protein+arginine+methylation+by+mass+spectrometry.">Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry.</a> Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).</li><li>Ong, S. -. E., Mittler, G., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+and+quantifying+in+vivo+methylation+sites+by+heavy+methyl+SILAC.">Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC.</a> Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).</li><li>Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+mass+spectrometry-based+identifications+of+enzyme-mediated+protein+methylation+are+subject+to+high+false+discovery+rates.">Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).</li><li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methylation+in+mammals:+who,+what,+and+why.">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).</li><li>Larsen, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+analysis+of+arginine+monomethylation+reveals+widespread+occurrence+in+human+cells.">Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells.</a> Science Signaling. 9 (443), (2016).</li><li>Massignani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hmSEEKER:+Identification+of+hmSILAC+doublets+in+MaxQuant+output+data.">hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data.</a> Proteomics. 19 (5), 1800300 (2019).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+the+sulfhydryl+reductants+tris(2-carboxyethyl)phosphine+and+dithiothreitol+for+use+in+protein+biochemistry.">A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry.</a> Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).</li><li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry.">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li><li>Huesgen, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LysargiNase+mirrors+trypsin+for+protein+C-terminal+and+methylation-site+identification.">LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification.</a> Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896 (2007).</li><li>Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+protein+methylation+profiling+by+combined+chemical+and+immunoaffinity+approaches+reveals+novel+PRMT1+targets.">Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).</li><li>Bremang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+identification+and+characterisation+of+lysine+and+arginine+methylation+in+the+human+proteome.">Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome.</a> Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).</li><li>Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+arginine+methylation+in+primary+T+cells+reveals+regulatory+roles+in+cell+signalling.">Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).</li><li>Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+basic+residue+content+on+fragment+ion+peak+intensities+in+low-energy+collision-induced+dissociation+spectra+of+peptides.">Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides.</a> Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).</li><li>Guthals, A., Bandeira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+identification+by+tandem+mass+spectrometry+with+alternate+fragmentation+modes.">Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).</li><li>Swaney, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supplemental+activation+method+for+high-efficiency+electron-transfer+dissociation+of+doubly+protonated+peptide+precursors.">Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors.</a> Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).</li><li>Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle-down+proteomics+reveals+dense+sites+of+methylation+and+phosphorylation+in+arginine-rich+RNA-binding+proteins.">Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins.</a> Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).</li><li>Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-line+high-pH+reversed-phase+fractionation+for+in-depth+phosphoproteomics.">Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics.</a> Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).</li><li>Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pH+reversed-phase+chromatography+with+fraction+concatenation+for+2D+proteomic+analysis.">High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis.</a> Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).</li><li>Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+protein+methylation+profiling+by+combined+chemical+and+immunoaffinity+approaches+reveals+novel+PRMT1+targets.">Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).</li><li>Uhlmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+large-scale+identification+of+protein+arginine+methylation.">A method for large-scale identification of protein arginine methylation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-free+approach+for+the+global+analysis+of+protein+methylation.">Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation.</a> Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).</li><li>Moore, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+molecular+affinity+strategy+for+global+detection+and+proteomic+analysis+of+lysine+methylation.">A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation.</a> Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+proteomics+approach+for+global+analysis+of+lysine+monomethylome+profiling.">A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).</li><li>Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+arginine+methylation+sites+in+human+cells+reveals+dynamic+regulation+during+transcriptional+arrest.">Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).</li><li>Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MethylQuant:+A+Tool+for+Sensitive+Validation+of+Enzyme-Mediated+Protein+Methylation+Sites+from+Heavy-Methyl+SILAC+Data.">MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).</li></ol>

Den höga konfidensidentifieringen av in vivo-protein / peptidmetylering genom global MS-baserad proteomik är utmanande på grund av risken för hög FDR, med flera aminosyrasubstitutioner och metylförestring som inträffar under provberedning som är isobarisk för metylering och kan orsaka felaktiga uppdrag i avsaknad av ortogonala MS-valideringsstrategier. Den substoichiometriska karaktären hos denna PTM komplicerar ytterligare uppgiften för global metylproteomik, men kan övervinnas med selektiv anriknin...

Arginin (R)-metylering är en post translationell modifiering (PTM) som dekorerar cirka 1% av däggdjursproteomet1. Protein argininmetyltransferaser (PRMT) är de enzymer som katalyserar R-metyleringsreaktion genom avsättning av en eller två metylgrupper till kväve (N) -atomerna i guanidinogruppen i sidokedjan av R på ett symmetriskt eller asymmetriskt sätt. Hos däggdjur kan PRMT grupperas i tre klasser - typ I, typ II och typ III - beroende på deras förmåga att deponera både monometylering (MMA) och asymmetrisk dimetylering (ADMA), MMA och symmetrisk dimetylering (SDMA) eller endast MMA respektive 2,3. PRMTs riktar sig främst mot R-rester som ligger inom glycin- och argininrika regioner, så kallade GAR-motiv, men vissa PRMT, såsom PRMT5 och CARM1, kan metylera prolin-glycin-metioninrika (PGM) motiv4. R-metylering har framträtt som en proteinmodulator för flera biologiska processer, såsom RNA-skarvning5, DNA-reparation6, miRNA-biogenes7 och översättning2, vilket främjar forskningen om denna PTM.
Masspektrometri (MS) är erkänd som den mest effektiva tekniken för att systematiskt studera global R-metylering vid protein-, peptid- och platsupplösning. Denna PTM kräver dock vissa särskilda försiktighetsåtgärder för att den ska kunna identifieras med hög konfidens av medlemsstaterna. För det första är R-metylering substoichiometrisk, med den omodifierade formen av peptiderna som är mycket rikligare än de modifierade, så att masspektrometrar som arbetar i DDA-läget (Data Dependent Acquisition) kommer att fragmentera högintensiva omodifierade peptider oftare än deras metylerade motsvarigheter med lägre intensitet8. Dessutom lider de flesta MS-baserade arbetsflöden för R-metylerad platsidentifiering av begränsningar på bioinformatisk analysnivå. Faktum är att beräkningsidentifieringen av metylpeptider är benägen för höga falska upptäcktshastigheter (FDR), eftersom denna PTM är isobarisk för olika aminosyrasubstitutioner (t.ex. glycin i alanin) och kemisk modifiering, såsom metylförestring av aspartat och glutamat9. Därför har metoder baserade på isotopmärkning av metylgrupper, såsom tung metylstabil isotopmärkning med aminosyror i cellodling (hmSILAC), implementerats som ortogonala strategier för säker MS-identifiering av in vivo-metyleringar, vilket avsevärt minskar frekvensen av falska positiva anteckningar10.
Nyligen har olika proteomomfattande protokoll för att studera R-metylerade proteiner optimerats. Utvecklingen av antikroppsbaserade strategier för immunaffinitetsberikning av R-metylpeptider har lett till annotering av flera hundra R-metylerade platser i humana celler11,12. Dessutom rapporterade många studier 3,13 att koppling av antikroppsbaserad anrikning med peptidseparationstekniker såsom HpH-RP-kromatografifraktionering kan öka det totala antalet identifierade metylpeptider.
Denna artikel beskriver en experimentell strategi utformad för systematisk och hög konfidensidentifiering av R-metylerade platser i mänskliga celler, baserat på olika biokemiska och analytiska steg: proteinextraktion från hmSILAC-märkta celler, parallell dubbel enzymatisk matsmältning med trypsin- och lysarginasproteaser, följt av HpH-RP-kromatografisk fraktionering av smälta peptider, i kombination med antikroppsbaserad immunaffinitetsberikning av MMA-, SDMA-, och ADMA-innehållande peptider. Alla affinitetsberikade peptider analyseras sedan med högupplöst vätskekromatografi (LC)-MS/MS i DDA-läge, och råa MS-data bearbetas av MaxQuant-algoritmen för identifiering av R-metylpeptider. Slutligen bearbetas MaxQuant-utdataresultaten med hmSEEKER, ett egenutvecklat bioinformatikverktyg för att söka par av tunga och lätta metylpeptider. Kortfattat läser och filtrerar hmSEEKER metylpeptididentifieringar från msms-filen, matchar sedan varje metylpeptid till dess motsvarande MS1-topp i allPeptides-filen och söker slutligen toppen av den tunga / lätta peptidmotparten. För varje förmodat tungt lätt par beräknas parametrarna Log2 H/L-förhållande (LogRatio), Retention Time difference (dRT) och Mass Error (ME) och dubbletter som finns inom användardefinierade cut-offs märks som sanna positiva. Arbetsflödet för det biokemiska protokollet beskrivs i figur 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate (AMBIC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>497363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colloidal Coomassie staining Instant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini, EDTA-free</td>
			<td>Roche-Sigma Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Protease Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO ThermoFisher</td>
			<td>26400-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3483-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>GIBCO ThermoFisher</td>
			<td>requested</td>
			<td>&#160;with stabile glutamine and without methionine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nano LC 1200 chromatography system</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray HPLC Columns</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ES907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerolo</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jupiter C12-RP column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4396-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5308</td>
			<td>Light (L) Methionine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine-(methyl-13C,d3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299154</td>
			<td>Heavy (H) Methionine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysargiNase</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>EMS0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtip Cell Disruptor Sonifier 250</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>GIBCO ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP</td>
			<td>Roche-Sigma Aldrich</td>
			<td>4906837001</td>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Tips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>87782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85175</td>
			<td>LC-MS Solvent B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85170</td>
			<td>LC-MS Solvent A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; Water, LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein&#160; All Blue Prestained Protein Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan antibodies &#945;-ADMA</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan antibodies &#945;-MMA</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan antibodies &#945;-SDMA</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 HPLC</td>
			<td>Dionex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Concentrator 5301</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Speed vac</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein r-methylation analysis

Protein arginin (R)-metylering är ett utbrett protein post-translationell modifiering (PTM) som är involverat i regleringen av flera cellulära vägar, inklusive RNA-bearbetning, signaltransduktion, DNA-skaderespons, miRNA-biogenes och översättning.
Under de senaste åren, tack vare biokemisk och analytisk utveckling, har masspektrometri (MS) -baserad proteomik framstått som den mest effektiva strategin för att karakterisera det cellulära metylproteomet med enplatsupplösning. Identifiering och profilering av in vivo-protein R-metylering med MS är dock fortfarande utmanande och felbenägen, främst på grund av den substoichiometriska karaktären hos denna modifiering och närvaron av olika aminosyrasubstitutioner och kemisk metylförestring av sura rester som är isobariska för metylering. Således krävs anrikningsmetoder för att förbättra identifieringen av R-metylpeptider och ortogonala valideringsstrategier för att minska falska upptäcktshastigheter (FDR) i metylproteomikstudier.
Här beskrivs ett protokoll som är speciellt utformat för identifiering och kvantifiering av R-metylpeptider med hög konfidens från cellulära prover, som kopplar samman metabolisk märkning av celler med tungt isotopkodat metionin (hmSILAC) och dubbel proteas i lösningsuppslutning av helcellsextrakt, följt av off-line High-pH Reversed Phase (HpH-RP) kromatografifraktionering och affinitetsanrikning av R-metylpeptider med användning av anti-pan-R-metylantikroppar. Vid högupplöst MS-analys bearbetas rådata först med MaxQuant-programvarupaketet och resultaten analyseras sedan av hmSEEKER, en programvara som är utformad för djupgående sökning av MS-topppar som motsvarar lätt och tung metylpeptid i MaxQuant-utdatafilerna.

Artikeln beskriver ett arbetsflöde för högkonfidensidentifiering av globalt protein R-metylering, som är baserat på kombinationen av den enzymatiska matsmältningen av proteinextraktet med två distinkta proteaser parallellt, följt av HpH-RP vätskekromatografifraktionering av proteolytiska peptider och immunaffinitetsanrikning av R-metylpeptider med anti-pan-R-metylantikroppar (Figur 1).
Cellerna odlades i närvaro av metionin, antingen naturligt (Light, L,...

Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis at JoVE.com

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

Protein arginin (R)-metylering är en vidsträckt post-translationell modifiering som reglerar flera biologiska vägar. Masspektrometri är den bästa tekniken för att globalt profilera R-metylproteomet, när det kopplas till biokemiska metoder för modifierad peptidanrikning. Arbetsflödet som är utformat för högkonfidensidentifiering av global R-metylering i mänskliga celler beskrivs här.

En masspektrometribaserad proteomikmetod för global och högkonfidensprotein R-metyleringsanalys

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Detta protokoll är mycket betydelsefullt eftersom det representerar det senaste arbetsflödet för den globala analysen av protein argininmetylering med masspektrometri. Detta är den enda metoden för att identifiera och profilera R-metylerat protein med en enda stilupplösning som inte kan uppnås med andra biokemiska tekniker. I kombination med användningen av PRMT-hämmare, varav flera är i kliniska prövningar och läkemedel mot cancer, möjliggör detta protokoll en djupgående analys av deras verkningsmekanism.För att börja, utför reduktion av tiolgruppen av proteiner med användning av en stamlösning av DTT upplöst i ultrarent vatten vid en slutlig koncentration av 4,5 millimolar och låt reaktionen gå i 30 minuter vid 55 grader Celsius. Utför alkylering av tiolgruppen av proteiner genom tillsats av jodoacetamid i en koncentration av 10 millimolar och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur i mörkret. För att verifiera proteolyseffektiviteten, spara en alikvot av proteinextrakt för efterföljande analys på SDS-PAGE Coomassie-färgad gel och jämför den med en motsvarande mängd prov vid matsmältningen.Späd det återstående proteinextraktet med fyra volymer 20 millimolar HEPES vid pH 8,0 för att nå en slutlig ureakoncentration av två molar. Dela provet i två delar och lägg sedan till sekvenseringsgradmodifierat trypsin till den ena och LysargiNasproteas till den andra. Lämna proverna över natten vid 37 grader Celsius i en ThermoMixer vid 600 rotationer per minut för att möjliggöra enzymatisk matsmältning.För varje kromatografisk gradient, samla alla fraktioner i en djup 96-brunnsplatta. Slå samman de bråktal som samlats in före övertoningens början till en enda fraktion med namnet pre. Sammanfoga de 60 fraktionerna från den vätskekromatografiska gradienten med högt pH-omvänd fas genom att på ett icke-sammanhängande sätt sammanföra dem till 14 slutliga fraktioner.För att erhålla icke-sammanhängande sammanfogning, slå samman de omvända fasfraktionerna med högt pH enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Slå samman de bråktal som samlats in efter övertoningen till en unik fraktion med namnet post. Utför sekventiell immunaffinitetsberikning av den modifierade peptiden separat för de två proverna från trypsin- och lysargiNassmältningar.Späd 10X koncentrerad immunaffinitetsrening eller IAP-buffert 10 gånger. Centrifugera de frystorkade peptiderna vid 2 000 G i fem minuter för att snurra ner peptiderna till botten av röret. Återsuspendera peptiderna med 250 mikroliter utspädd IAP-buffert per 15 ml rör och överför till ett 1,5 ml lågbindande rör.Använd ett lakmuspapper för att kontrollera att pH är högre än sex. Håll en liten alikvot av varje fraktion som indata för den efterföljande MS-analysen. Dela varje fraktion i två delar för att utföra immunanrikning av asymmetriskt dimetylerade, eller ADMA, och symmetriskt dimetylerade, eller SDMA, peptider parallellt.Förbered tre injektionsflaskor med de valda anti-pan R-metylerade antikropparna konjugerade med protein A agarospärlor per 10 milligram av det ursprungliga proteinextraktet. Bered rätt mängd antikropp konjugerad mot agarospärlor genom att centrifugera varje injektionsflaska vid 2 000 G i 30 sekunder och ta bort bufferten från pärlorna. Tvätta pärlorna tre gånger med en milliliter 1X PBS genom att centrifugera dem vid 2 000 G i 30 sekunder.Efter den sista tvätten, återsuspendera pärlorna i 40 mikroliter 1X PBS för varje injektionsflaska, slå ihop dem och dela dem slutligen lika i 16 fraktioner. Tillsätt 250 mikroliter 1X IAP-buffert till varje rör och blanda genom att invertera. Inkubera sedan rören på ett roterande hjul i två timmar vid fyra grader Celsius.Efter inkubationen centrifugerar du de 1,5 milliliter rör som innehåller peptider och pan R-metylantikroppskonjugerade pärlor vid 2 000 G i 30 sekunder för att pelletera pärlorna och överföra genomströmningen från varje fraktion till ett rent 1,5 ml lågbindande rör. Tillsätt pärlorna till genomströmningen konjugerad till antikroppar mot R-monometylering och upprepa återsuspensionen till PBS, inkubation med IAP-buffert och centrifugering. Under inkubationen av peptidproverna med monometylerings- eller MMA-pärlor, tvätta fraktionerna som tidigare immunoprecipiterades med anti-ADMA och SDMA med 250 mikroliter IAP-buffert två gånger och kassera supernatanten efter varje tvätt.Tvätta sedan med LC-MS-vatten tre gånger. Elute affinitetsberikade SDMA- eller ADMA-peptider från agarospärlorna genom att tillsätta 50 mikroliter 0,15 TFA till varje rör. Lämna denna lösning i 10 minuter vid rumstemperatur och invertera rören varannan till var tredje minut.Överför den första elueringen till rena 1,5 ml lågbindande rör och upprepa elueringen med 50 mikroliter 0,15 TFA. Slå samman de två elueringsfraktionerna i ett rör. Upprepa denna process för R-monometylerade peptider som inkuberades med anti-MMA-antikroppspärlorna.Efter blandning av de lätta och tunga märkta cellerna extraherades proteiner och utsattes för matsmältning av trypsin och LysargiNase. En SDS-PAGE Coomassie-färgad gel användes för att verifiera den effektiva enzymatiska matsmältningen av totala proteiner i peptider. Effektiviteten hos reningssteget som utfördes av C18 Sep-Pak-kolonnen utvärderades, vilket bekräftade frånvaron av peptider i genomströmningen av C18-kolonnen och i den första och andra tvätten samt deras förväntade närvaro i elueringsmedlet.Korrekt MET4-inkorporering i den tunga kanalen och korrekt tung eller lätt blandning utvärderades. Kromatogrammet från den offline höga pH-vätskekromatografifraktioneringen av peptider och den efterföljande icke-sammanhängande sammanfogningen av fraktioner visas här. Peptider detekterades med 250 nanometer UV, medan potentiellt återstående osmälta proteiner utvärderades med 280 nanometer UV. De fullständiga MS-spektra av peptider som representerar sann positiv metylpeptidannotering erhölls.De skillnader mellan M och Z som observerats mellan de tre topparna överensstämmer med närvaron av enzymatiskt metylerade rester. De fullständiga MS-spektra av peptider som representerar falskt positiv metylpeptidannotering erhölls. Skillnaderna mellan M och Z som observerats mellan den lätta metylerade peptiden och dess straffande tunga motsvarighet avviker från det förväntade värdet med 0,0312.Protokollarbetsflödet är överlag linjärt, men det finns några steg som kräver särskild uppmärksamhet. Till exempel IPH-kromatografiseparationen med icke-sammanhängande fraktionssammanfogning, liksom IP-inställningen. Samma protokoll kan kopplas till antingen standard SILAC eller etikettfri kvantifiering för att profilera argininmetyleringsdynamik som svar på en mängd olika störningar.Detta protokoll banar väg för karakteriseringen av omfattningen och dynamiken av proteinmetylering i flera celltyper och modellsystem som stöder alla aspekter av grundläggande och translationell forskning med fokus på PRMT.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

En Tandem vätskekromatografi-masspektrometri baserad strategi för metabolit analys av<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolation för Kvantitativ masspektrometri Analys

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Provberedning för Mass Spectrometry-baserade identifiering av RNA-bindande regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein matsmältningen, ultrafiltrering och storlek utslagning kromatografi att optimera isolering av Exosomes från mänsklig blodplasma och Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extracellulära Protein Mikroarrayteknik för hög genomströmning upptäckt av låg affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Beredning av kloroplast sub fack från Arabidopsis för analys av Protein lokalisering av Immunoblotting eller proteomik

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detektion av protein ubiquitination platser av peptidanrikning och masspektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Oriktad flytande kromatografi-Mass Pektrometri-Baserade metabolomika analys av vetekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...