Name: a mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein r-methylation analysis
Uploaded: 2022-04-28T12:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis at JoVE.com

MM ve EM, Avrupa Moleküler Tıp Okulu (SEMM) bünyesindeki doktora öğrencileridir. EM, 3 yıllık FIRC-AIRC bursunun sahibidir (Proje Kodu: 22506). TB grubundaki R-metil-proteomların küresel analizleri AIRC IG Hibe (Proje Kodu: 21834) ile desteklenmektedir.

1. Hücre kültürü ve protein ekstraksiyonu (zaman: 3 - 4 hafta gerekli)
<ol><li>HeLa hücrelerini, sırasıyla Hafif (L) veya Ağır (H) Metiyonin ile sağlanan ortamlarda paralel olarak büyütün (ortam bileşimi için Tablo 1'e bakınız). En az sekiz hücre bölünmesi üzerine, her SILAC kanalından bir hücre aliquot toplayın ve birleştirme testini gerçekleştirin. NOT: Birleştirme verimliliğini kontrol etmek için, LC-MS/MS analizi ile Ağır kanaldaki ağır Metiyonin (Met-4) yüzdes...

<ol>
	<li>Bulau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+arginine+methylation+in+free+versus+protein-incorporated+amino+acids+in+vitro+and+in+vivo+using+protein+hydrolysis+and+high-performance+liquid+chromatography.">Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography.</a> Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).</li><li>Blanc, R. S., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+methylation:+the+coming+of+age.">Arginine methylation: the coming of age.</a> Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).</li><li>Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+arginine+methylation+sites+in+human+cells+reveals+dynamic+regulation+during+transcriptional+arrest.">Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).</li><li>Yang, Y., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methyltransferases+and+cancer.">Protein arginine methyltransferases and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).</li><li>Bezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+constitutive+and+alternative+splicing+by+PRMT5+reveals+a+role+for+Mdm4+pre-mRNA+in+sensing+defects+in+the+spliceosomal+machinery.">Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery.</a> Genes &amp; Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).</li><li>Auclair, Y., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+arginine+methylation+in+the+DNA+damage+response.">The role of arginine methylation in the DNA damage response.</a> DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).</li><li>Spadotto, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT1-mediated+methylation+of+the+microprocessor-associated+proteins+regulates+microRNA+biogenesis.">PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).</li><li>Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+computational+approaches+for+the+large-scale+analysis+of+protein+arginine+methylation+by+mass+spectrometry.">Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry.</a> Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).</li><li>Ong, S. -. E., Mittler, G., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+and+quantifying+in+vivo+methylation+sites+by+heavy+methyl+SILAC.">Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC.</a> Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).</li><li>Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+mass+spectrometry-based+identifications+of+enzyme-mediated+protein+methylation+are+subject+to+high+false+discovery+rates.">Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).</li><li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+arginine+methylation+in+mammals:+who,+what,+and+why.">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).</li><li>Larsen, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+analysis+of+arginine+monomethylation+reveals+widespread+occurrence+in+human+cells.">Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells.</a> Science Signaling. 9 (443), (2016).</li><li>Massignani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hmSEEKER:+Identification+of+hmSILAC+doublets+in+MaxQuant+output+data.">hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data.</a> Proteomics. 19 (5), 1800300 (2019).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+the+sulfhydryl+reductants+tris(2-carboxyethyl)phosphine+and+dithiothreitol+for+use+in+protein+biochemistry.">A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry.</a> Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).</li><li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry.">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li><li>Huesgen, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LysargiNase+mirrors+trypsin+for+protein+C-terminal+and+methylation-site+identification.">LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification.</a> Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).</li><li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+micro-purification,+enrichment,+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips.">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896 (2007).</li><li>Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+protein+methylation+profiling+by+combined+chemical+and+immunoaffinity+approaches+reveals+novel+PRMT1+targets.">Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).</li><li>Bremang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+identification+and+characterisation+of+lysine+and+arginine+methylation+in+the+human+proteome.">Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome.</a> Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).</li><li>Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+arginine+methylation+in+primary+T+cells+reveals+regulatory+roles+in+cell+signalling.">Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).</li><li>Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+basic+residue+content+on+fragment+ion+peak+intensities+in+low-energy+collision-induced+dissociation+spectra+of+peptides.">Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides.</a> Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).</li><li>Guthals, A., Bandeira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+identification+by+tandem+mass+spectrometry+with+alternate+fragmentation+modes.">Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).</li><li>Swaney, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supplemental+activation+method+for+high-efficiency+electron-transfer+dissociation+of+doubly+protonated+peptide+precursors.">Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors.</a> Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).</li><li>Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle-down+proteomics+reveals+dense+sites+of+methylation+and+phosphorylation+in+arginine-rich+RNA-binding+proteins.">Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins.</a> Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).</li><li>Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-line+high-pH+reversed-phase+fractionation+for+in-depth+phosphoproteomics.">Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics.</a> Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).</li><li>Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pH+reversed-phase+chromatography+with+fraction+concatenation+for+2D+proteomic+analysis.">High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis.</a> Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).</li><li>Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+protein+methylation+profiling+by+combined+chemical+and+immunoaffinity+approaches+reveals+novel+PRMT1+targets.">Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).</li><li>Uhlmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+large-scale+identification+of+protein+arginine+methylation.">A method for large-scale identification of protein arginine methylation.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-free+approach+for+the+global+analysis+of+protein+methylation.">Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation.</a> Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).</li><li>Moore, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+molecular+affinity+strategy+for+global+detection+and+proteomic+analysis+of+lysine+methylation.">A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation.</a> Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+proteomics+approach+for+global+analysis+of+lysine+monomethylome+profiling.">A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).</li><li>Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+arginine+methylation+sites+in+human+cells+reveals+dynamic+regulation+during+transcriptional+arrest.">Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).</li><li>Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MethylQuant:+A+Tool+for+Sensitive+Validation+of+Enzyme-Mediated+Protein+Methylation+Sites+from+Heavy-Methyl+SILAC+Data.">MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).</li></ol>

Global MS bazlı proteomikler tarafından in vivo protein/peptit metilasyonunun yüksek güvenilirlikle tanımlanması, yüksek FDR riski nedeniyle, metilasyona izobarik olan ve ortogonal MS doğrulama stratejilerinin yokluğunda yanlış atamalara neden olabilen numune hazırlama sırasında meydana gelen çeşitli amino asit ikameleri ve metil-esterifikasyonu ile zordur. Bu PTM'nin substokiyometrik doğası, küresel metil-proteomiklerin görevini daha da karmaşıklaştırır, ancak modifiye peptidlerin seçi...

Arginin ( R ) -metilasyon, memeli proteomunun yaklaşık% 1'ini süsleyen bir translasyonel modifikasyondur (PTM)1. Protein Arginin Metiltransferazlar (PRMT'ler), R'nin yan zincirinin guanidinos grubunun azot (N) atomlarına simetrik veya asimetrik bir şekilde bir veya iki metil grubunun birikmesiyle R-metilasyon reaksiyonunu katalize eden enzimlerdir. Memelilerde, PRMT'ler hem mono-metilasyon (MMA) hem de asimetrik di-metilasyon (ADMA), MMA ve simetrik di-metilasyon (SDMA) veya sadece MMA'yı biriktirme yeteneklerine bağlı olarak üç sınıfa ayrılabilir - sırasıyla 2,3. PRMT'ler esas olarak GAR motifleri olarak bilinen glisin ve arginin bakımından zengin bölgelerde bulunan R kalıntılarını hedef alır, ancak PRMT5 ve CARM1 gibi bazı PRMT'ler prolin-glisin-metiyonin bakımından zengin (PGM) motifleri metilleştirebilir4. R-metilasyon, RNA ekleme5, DNA onarımı6, miRNA biyogenezi7 ve çeviri2 gibi çeşitli biyolojik süreçlerin bir protein modülatörü olarak ortaya çıkmış ve bu PTM üzerindeki araştırmaları teşvik etmiştir.
Kütle Spektrometresi (MS), protein, peptit ve saha çözünürlüğünde küresel R-metilasyonunu sistematik olarak incelemek için en etkili teknoloji olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, bu PTM, MS tarafından yüksek güvenilirlikle tanımlanması için bazı özel önlemler gerektirir. İlk olarak, R-metilasyonu substokiyometriktir, peptitlerin değiştirilmemiş formu modifiye edilmiş olanlardan çok daha bol miktarda bulunur, böylece Veriye Bağımlı Edinme (DDA) modunda çalışan kütle spektrometreleri, yüksek yoğunluklu modifiye edilmemiş peptitleri, düşük yoğunluklu metillenmiş muadillerinden daha sık parçalayacaktır8. Ayrıca, R-metillenmiş saha tanımlaması için MS tabanlı iş akışlarının çoğu, biyoinformatik analiz düzeyinde sınırlamalardan muzdariptir. Gerçekten de, metil-peptitlerin hesaplamalı olarak tanımlanması yüksek Yanlış Keşif Oranlarına (FDR) eğilimlidir, çünkü bu PTM çeşitli amino asit ikamelerine (örneğin, glisin içine alanin) ve aspartat ve glutamatın metil-esterifikasyonu gibi kimyasal modifikasyonlara izobariktir9. Bu nedenle, Hücre kültüründe Amino Asitlerle Ağır Metil Kararlı İzotop Etiketleme (hmSILAC) gibi metil gruplarının izotop etiketlemesine dayanan yöntemler, in vivo metilasyonların güvenli MS-tanımlanması için ortogonal stratejiler olarak uygulanmış ve yanlış pozitif ek açıklamaların oranını önemli ölçüde azaltmıştır10.
Son zamanlarda, R-metillenmiş proteinleri incelemek için çeşitli proteom çapında protokoller optimize edilmiştir. R-metil-peptitlerin immüno-afinite zenginleştirilmesi için antikor tabanlı stratejilerin geliştirilmesi, insan hücrelerinde yüzlerce R-metillenmiş bölgenin ek açıklamasına yol açmıştır11,12. Ayrıca, birçok çalışma 3,13, antikor bazlı zenginleştirmenin HpH-RP kromatografi fraksiyonasyonu gibi peptid ayırma teknikleriyle birleştirilmesinin tanımlanan toplam metil-peptit sayısını artırabileceğini bildirmiştir.
Bu makalede, çeşitli biyokimyasal ve analitik adımlara dayanarak, insan hücrelerinde R-metillenmiş bölgelerin sistematik ve yüksek güvenilirlikle tanımlanması için tasarlanmış deneysel bir strateji açıklanmaktadır: hmSILAC etiketli hücrelerden protein ekstraksiyonu, Tripsin ve LysargiNase proteazları ile paralel çift enzimatik sindirim, ardından sindirilmiş peptitlerin HpH-RP kromatografik fraksiyonasyonu, MMA-, SDMA'nın antikor bazlı immüno-afinite zenginleştirmesi ile birleştiğinde, ve ADMA içeren peptitler. Tüm afiniteyle zenginleştirilmiş peptitler daha sonra DDA modunda yüksek çözünürlüklü Sıvı Kromatografisi (LC)-MS / MS ile analiz edilir ve ham MS verileri, R-metil-peptitlerin tanımlanması için MaxQuant algoritması tarafından işlenir. Son olarak, MaxQuant çıktı sonuçları, ağır ve hafif metil-peptit çiftlerini aramak için şirket içinde geliştirilen bir biyoinformatik araç olan hmSEEKER ile işlenir. Kısaca, hmSEEKER msms dosyasından metil-peptitler tanımlamalarını okur ve filtreler, daha sonra her metil-peptidi allPeptides dosyasındaki karşılık gelen MS1 zirvesiyle eşleştirir ve son olarak ağır / hafif peptid muadilinin zirvesini arar. Her varsayılan ağır-hafif çift için, Log2 H/L oranı (LogRatio), Bekletme Süresi farkı (dRT) ve Kütle Hatası (ME) parametreleri hesaplanır ve kullanıcı tanımlı kesmeler içinde bulunan çiftler gerçek pozitif olarak etiketlenir. Biyokimyasal protokolün iş akışı Şekil 1'de açıklanmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate (AMBIC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>497363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colloidal Coomassie staining Instant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ISB1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Mini, EDTA-free</td>
			<td>Roche-Sigma Aldrich</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>Protease Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>GIBCO ThermoFisher</td>
			<td>26400-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3483-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>GIBCO ThermoFisher</td>
			<td>requested</td>
			<td>&#160;with stabile glutamine and without methionine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nano LC 1200 chromatography system</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray HPLC Columns</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ES907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerolo</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jupiter C12-RP column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4396-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5308</td>
			<td>Light (L) Methionine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine-(methyl-13C,d3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299154</td>
			<td>Heavy (H) Methionine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysargiNase</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>EMS0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtip Cell Disruptor Sonifier 250</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>GIBCO ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosSTOP</td>
			<td>Roche-Sigma Aldrich</td>
			<td>4906837001</td>
			<td>Phosphatase Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 Tips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>87782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85175</td>
			<td>LC-MS Solvent B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85170</td>
			<td>LC-MS Solvent A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#160; Water, LC-MS Grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein&#160; All Blue Prestained Protein Standards</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan antibodies &#945;-ADMA</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan antibodies &#945;-MMA</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTMScan antibodies &#945;-SDMA</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>13563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimate 3000 HPLC</td>
			<td>Dionex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Concentrator 5301</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Speed vac</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein r-methylation analysis

Protein Arginin ( R ) -metilasyonu, RNA işleme, sinyal iletimi, DNA hasar yanıtı, miRNA biyogenezi ve translasyon dahil olmak üzere çeşitli hücresel yolakların düzenlenmesinde rol oynayan yaygın bir protein post-translasyonel modifikasyonudur (PTM).
Son yıllarda, biyokimyasal ve analitik gelişmeler sayesinde, kütle spektrometresi (MS) bazlı proteomikler, hücresel metil-proteomu tek bölge çözünürlüğü ile karakterize etmek için en etkili strateji olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, MS tarafından in vivo protein R-metilasyonunun tanımlanması ve profillenmesi, esas olarak bu modifikasyonun substokiyometrik doğası ve çeşitli amino asit ikamelerinin varlığı ve metilasyona izobarik olan asidik kalıntıların kimyasal metil-esterifikasyonu nedeniyle zor ve hataya açık olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, R-metil-peptitlerin tanımlanmasını arttırmak için zenginleştirme yöntemleri ve metil-proteomik çalışmalarda Yanlış Keşif Oranlarını (FDR) azaltmak için ortogonal doğrulama stratejileri gereklidir.
Burada, hücresel örneklerden yüksek güvenilirliğe sahip R-metil-peptitlerin tanımlanması ve kantitasyonu için özel olarak tasarlanmış bir protokol tanımlanmıştır; bu, hücrelerin metabolik etiketlemesini, ağır izotop kodlu Metiyonin (hmSILAC) ve tüm hücre ekstraktının çift proteaz çözelti içi sindirimi ile birleştiren, ardından anti-pan-R-metil antikorları kullanılarak R-metil-peptitlerin çevrimdışı Yüksek pH Ters Faz (HpH-RP) kromatografi fraksiyonasyonu ve afinite zenginleştirmesi ile eşleştirilmiştir. Yüksek çözünürlüklü MS analizi üzerine, ham veriler önce MaxQuant yazılım paketi ile işlenir ve sonuçlar daha sonra MaxQuant çıktı dosyalarındaki hafif ve ağır metil-peptide karşılık gelen MS tepe çiftlerinin derinlemesine araştırılması için tasarlanmış bir yazılım olan hmSEEKER tarafından analiz edilir.

Makalede, protein ekstraktının enzimatik sindiriminin paralel olarak iki ayrı proteaz ile kombinasyonuna dayanan küresel protein R-metilasyonunun yüksek güvenilirlikte tanımlanması için bir iş akışı anlatılmaktadır, bunu proteolitik peptitlerin HpH-RP sıvı kromatografisi fraksiyonasyonu ve R-metil-peptidlerin anti-pan-R-metil antikorları ile immüno-afinite zenginleştirmesi izlemektedir (Şekil 1).
Hücreler, doğal (Hafif, L, Met-0) veya izotop...

Watch this Scientific Journal Video about A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis at JoVE.com

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

Protein Arginin ( R ) -metilasyonu, çoklu biyolojik yolları düzenleyen geniş çaplı bir translasyonel sonrası modifikasyondur. Kütle spektrometresi, modifiye peptid zenginleştirme için biyokimyasal yaklaşımlarla birleştirildiğinde, R-metil-proteomun küresel profilini çıkarmak için en iyi teknolojidir. İnsan hücrelerinde küresel R-metilasyonun yüksek güvenilirlikle tanımlanması için tasarlanan iş akışı burada açıklanmaktadır.

Global ve Yüksek Güvenilirlikli Protein R-Metilasyon Analizi için Kütle Spektrometrisine Dayalı Proteomik Yaklaşım

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Bu protokol oldukça önemlidir, çünkü kütle spektrometrisi ile protein arginin metilasyonunun küresel analizi için en gelişmiş iş akışını temsil eder. Bu, R-metillenmiş proteini, diğer biyokimyasal tekniklerle elde edilemeyen tek bir stil çözünürlüğü ile tanımlamak ve profillemek için tek yöntemdir. Birçoğu klinik çalışmalarda ve anti-kanser ilaçlarında bulunan PRMT inhibitörlerinin kullanımı ile birleştiğinde, bu protokol etki mekanizmalarının derinlemesine analizine izin verir.Başlamak için, ultra saf suda 4.5 milimolar nihai konsantrasyonda çözünmüş bir DTT stok çözeltisi kullanarak tiol protein grubunun indirgenmesini gerçekleştirin ve reaksiyonun 55 santigrat derecede 30 dakika boyunca gitmesine izin verin. 10 milimolar konsantrasyonda iyodoasetamid ekleyerek ve karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe ederek tiol protein grubunun alkilasyonunu gerçekleştirin. Proteoliz verimliliğini doğrulamak için, SDS-PAGE Coomassie boyalı jel üzerinde daha sonraki analizler için bir miktar protein ekstraktını saklayın ve sindirimden sonra karşılık gelen miktarda numune ile karşılaştırın.İki azı dişinin nihai üre konsantrasyonuna ulaşmak için kalan protein ekstraktını pH 8.0'da dört hacim 20 milimolar HEPES ile seyreltin. Numuneyi iki parçaya bölün, ardından birine sıralama dereceli modifiye tripsin ve diğerine LysargiNase proteaz ekleyin. Enzimatik sindirime izin vermek için numuneleri gece boyunca bir ThermoMixer'da dakikada 600 dönüşte 37 santigrat derecede bırakın.Her kromatografik gradyan için, tüm fraksiyonları derin bir 96 delikli plakada toplayın. Degradenin başlamasından önce toplanan fraksiyonları, pre adlı tek bir fraksiyonda toplayın. Yüksek pH ters fazlı sıvı kromatografik gradyandan 60 fraksiyonu, bitişik olmayan bir şekilde 14 son fraksiyonda toplayarak birleştirin.Bitişik olmayan birleştirme elde etmek için, metin makalesinde açıklandığı gibi yüksek pH ters faz fraksiyonlarını bir araya getirin. Degradeden sonra toplanan kesirleri, post adlı benzersiz bir kesirde toplayın. Tripsin ve LysargiNase sindirimlerinden alınan iki örnek için modifiye peptidin sıralı immüno-afinite zenginleştirmesini ayrı ayrı gerçekleştirin.10X konsantre immüno-afinite saflaştırmasını veya IAP tamponunu 10 kez seyreltin. Liyofilize peptitleri 2.000 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve peptitleri tüpün dibine doğru döndürün. Peptitleri 15 mililitrelik tüp başına 250 mikrolitre seyreltilmiş IAP tamponu ile yeniden askıya alın ve 1,5 mililitrelik düşük bağlayıcı bir tüpe aktarın.PH'ın altıdan büyük olduğunu kontrol etmek için bir turnusol kağıdı kullanın. Sonraki MS analizi için girdi olarak her fraksiyonun küçük bir aliquot'unu saklayın. Asimetrik olarak dimetillenmiş veya ADMA ve simetrik olarak dimetillenmiş veya SDMA peptitlerinin immüno-zenginleştirmesini paralel olarak gerçekleştirmek için her fraksiyonu iki parçaya bölün.İlk protein ekstraktının 10 miligramı başına protein A agaroz boncuklarına konjuge edilmiş seçilmiş anti-pan R-metillenmiş antikorların üç şişesini hazırlayın. Her bir şişeyi 2.000 G'de 30 saniye boyunca santrifüj ederek ve tamponu boncuklardan çıkararak agaroz boncuklarına konjuge edilmiş doğru miktarda antikor hazırlayın. Boncukları 30 saniye boyunca 2.000 G'de santrifüj ederek bir mililitre 1X PBS ile üç kez yıkayın.Son yıkamadan sonra, boncukları her şişe için 40 mikrolitre 1X PBS'de yeniden askıya alın, bir araya getirin ve son olarak 16 fraksiyona eşit olarak bölün. Her tüpe 250 mikrolitre 1X IAP tamponu ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. Daha sonra tüpleri dönen bir tekerlek üzerinde iki saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.Kuluçkadan sonra, peptitler ve pan R-metil antikoru konjuge boncukları içeren 1.5 mililitrelik tüpleri, boncukları peletlemek ve akışı her fraksiyondan temiz bir 1.5 mililitrelik düşük bağlayıcı tüpe aktarmak için 30 saniye boyunca 2.000 G'de santrifüj edin. Boncukları, R-mono metilasyona karşı antikorlara konjuge edilmiş akışa ekleyin ve PBS'ye yeniden süspansiyonu, IAP tamponu ile inkübasyonu ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Peptit örneklerinin mono-metilizasyon veya MMA boncukları ile inkübasyonu sırasında, daha önce anti-ADMA ve SDMA ile immünoprestite edilmiş fraksiyonları 250 mikrolitre IAP tamponu ile iki kez yıkayın ve her yıkamadan sonra süpernatantı atın.Daha sonra LC-MS sınıfı su ile üç kez yıkayın. Her tüpe 50 mikrolitre 0.15 TFA ekleyerek agaroz boncuklarından afinite zenginleştirilmiş SDMA veya ADMA peptitlerini salın. Bu çözeltiyi oda sıcaklığında 10 dakika bekletin, tüpleri her iki ila üç dakikada bir ters çevirin.İlk elüsyonu temiz 1,5 mililitrelik düşük bağlayıcı tüplere aktarın ve elüsyonu 50 mikrolitre 0,15 TFA ile tekrarlayın. İki elüsyon fraksiyonunu tek bir tüpte toplayın. Anti-MMA antikor boncukları ile inkübe edilen R-mono-metillenmiş peptitler için bu işlemi tekrarlayın.Hafif ve ağır etiketli hücreleri karıştırdıktan sonra, proteinler ekstrakte edildi ve tripsin ve LysargiNase tarafından sindirime tabi tutuldu. Peptitlerdeki toplam proteinlerin verimli enzimatik sindirimini doğrulamak için SDS-PAGE Coomassie boyalı bir jel kullanıldı. C18 Sep-Pak sütunu tarafından gerçekleştirilen saflaştırma adımının etkinliği değerlendirildi ve C18 kolonunun akışında ve birinci ve ikinci yıkamada peptidlerin bulunmadığı ve ayrıca elüentte beklenen mevcudiyetleri doğrulandı.Ağır kanala uygun MET4 entegrasyonu ve doğru ağır veya hafif karışım değerlendirildi. Peptitlerin çevrimdışı yüksek pH'lı ters faz sıvı kromatografisi fraksiyonasyonundan elde edilen kromatogram ve ardından fraksiyonların bitişik olmayan birleşimi burada gösterilmiştir. Peptitler 250 nanometre UV ile tespit edilirken, potansiyel olarak sindirilmemiş proteinler 280 nanometre UV ile değerlendirildi. Gerçek pozitif metil peptid ek açıklamasını temsil eden peptidlerin tam MS spektrumları elde edildi.Üç tepe noktası arasında gözlenen M üzerinden Z farklılıkları, enzimatik olarak metillenmiş kalıntının varlığı ile tutarlıdır. Yanlış pozitif metil peptid ek açıklamasını temsil eden peptidlerin tam MS spektrumları elde edildi. Hafif metillenmiş peptit ile cezalandırıcı ağır muadili arasında gözlenen M üzerinden Z farkları, beklenen değerden 0.0312 oranında sapmaktadır.Protokol iş akışı genel olarak doğrusaldır, ancak özel dikkat gerektiren birkaç adım vardır. Örneğin, bitişik olmayan fraksiyon birleştirme ile IPH kromatografisi ayrımı ve IP kurulumu. Aynı protokol, çeşitli pertürbasyona yanıt olarak arginin metilasyon dinamiklerinin profilini çıkarmak için standart SILAC veya etiketsiz nicelemeye bağlanabilir.Bu protokol, PRMT'lere odaklanan temel ve translasyonel araştırmaların tüm yönlerini destekleyen çeşitli hücre tiplerinde ve model sistemlerinde protein metilasyonunun kapsamının ve dinamiklerinin karakterizasyonuna yol açmaktadır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

metabolit analizi için bir Tandem Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi tabanlı yaklaşım<em&gt; Stafilokok aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Kantitatif Kütle Spektrometresi Analiz lipid Damlacık izolasyonu

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein sindirimi, Ultrafiltrasyon ve boyutu dışlama Kromatografi insan kan plazması ve Serum Exosomes yalıtım en iyi duruma getirmek için

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Kloroplast alt bölmeler Arabidopsis üzerinden hazırlanması Protein yerelleştirme Immunoblotting veya proteomik analizi için

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Hedefsiz Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi Tabanlı Metabolomik Buğday Tanesi Analizi

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...