Name: monitoring dynamic growth of retinal vessels in oxygen-induced retinopathy mouse model
Uploaded: 2021-04-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model at JoVE.com

نشكر جميع الأعضاء من مختبرنا ومختبر العيون في مركز تشونغشان لطب العيون على مساعدتهم التقنية. كما نشكر البروفيسور تشونكياو ليو على الدعم التجريبي. تم دعم هذا العمل من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC: 81670872; بكين، الصين)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة قوانغدونغ، الصين (المنحة رقم 2019A1515011347)، ومشروع بناء مستشفى رفيع المستوى من مختبر الدولة الرئيسي لطب العيون في مركز تشونغشان لطب العيون (المنحة رقم 303020103؛ قوانغتشو ، مقاطعة قوانغدونغ ، الصين).

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على استخدام الفئران من قبل لجنة أخلاقيات التجارب الحيوانية التابعة لمركز تشونغشان للعيون ، جامعة صن يات صن ، الصين (الرقم المعتمد: 2020-082) ، ووفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة للجنة رعاية واستخدام الحيوانات التابعة لمركز تشونغشان للعيون وبيان جمعي?...

تتأثر قابلية الفئران ل OIR بالعديد من العوامل. لا يمكن مقارنة الجراء من خلفية وراثية مختلفة وسلالات. في الفئران البيضاء BALB / c ، تنمو الأوعية مرة أخرى في منطقة VO بسرعة مع انخفاض كبير في خصلات الأوعية الدموية الجديدة38 ، والتي تجلب بعض الصعوبات للبحث. في الفئران C57BL / 6 ، هناك زيادة ف?...

عادة ما تمتد الأوعية الدموية الجديدة في الشبكية (RNV)، والتي تعرف بأنها حالة تنشأ فيها أوعية مرضية جديدة من الأوردة الشبكية الموجودة، على طول السطح الداخلي للشبكية وتنمو في الجسم الزجاجي (أو الفضاء تحت الشبكية في ظل بعض الظروف)1. وهو سمة مميزة وسمة مشتركة للعديد من اعتلالات الشبكية الإقفارية، بما في ذلك اعتلال الشبكية الخداجي (ROP)، وانسداد الوريد الشبكي (RVO)، واعتلال الشبكية السكري التكاثري (PDR)2.
أشارت العديد من الملاحظات السريرية والتجريبية إلى أن نقص التروية هو السبب الرئيسي لتوسع الأوعية الدموية الجديدة في الشبكية 3,4. في شرطة عمان السلطانية، يتعرض حديثي الولادة لأكسجين عالي المستوى في حاضنات مغلقة لزيادة معدلات البقاء على قيد الحياة، وهو أيضا محرك مهم لوقف نمو الأوعية الدموية. بعد الانتهاء من العلاج ، تعاني شبكية العين من الأطفال حديثي الولادة من فترة نقص الأكسجة نسبيا5. وينظر إلى حالات أخرى في انسداد الأوردة الشبكية المركزية أو الفرعية في RVO ويلاحظ أيضا تلف الشعيرات الدموية في الشبكية الذي يسببه اعتلال الأوعية الدقيقة في PDR2. يزيد نقص الأكسجة من التعبير عن العوامل الوعائية المنشأ مثل عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF) من خلال مسار إشارات العامل الناجم عن نقص الأكسجة -1α (HIF-1α) والذي بدوره يوجه الخلايا البطانية الوعائية للنمو في منطقة نقص الأكسجة وتشكيل أوعية جديدة 6,7.
ROP هو نوع من اعتلال الشبكية التكاثري الوعائي عند الأطفال الخدج وسبب رئيسي لعمى الأطفال8,9 ، والذي يتميز بنقص الأكسجة في الشبكية ، والأوعية الدموية الجديدة في الشبكية وتضخم التنسج الليفي10,11,12. في 1950s ، وجد الباحثون أن التركيز العالي للأكسجين يمكن أن يحسن بشكل كبير الأعراض التنفسية للأطفال الخدج13,14. ونتيجة لذلك ، تم استخدام العلاج بالأكسجين بشكل متزايد في الأطفال الخدج في ذلك الوقت15. ومع ذلك ، بالتزامن مع الاستخدام الواسع النطاق للعلاج بالأكسجين في الأطفال الخدج ، زاد حدوث ROP عاما بعد عام. ومنذ ذلك الحين، ربط الباحثون الأكسجين بشرطة عمان السلطانية، مستكشفين نماذج حيوانية مختلفة لفهم التسبب في ROP و RNV16.
في الإنسان ، يتم الانتهاء من معظم تطوير الأوعية الدموية في الشبكية قبل الولادة بينما في القوارض تتطور الأوعية الدموية الشبكية بعد الولادة ، مما يوفر نظاما نموذجيا يمكن الوصول إليه لدراسة تكوين الأوعية الدموية في الأوعية الدموية الشبكية2. مع التقدم المستمر للبحث ، أصبحت نماذج اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين (OIR) نماذج رئيسية لمحاكاة تولد الأوعية الدموية المرضية الناتجة عن نقص التروية. لا توجد أنواع حيوانية محددة في دراسة نموذج OIR وقد تم تطوير النموذج في أنواع حيوانية مختلفة ، بما في ذلك القطالصغير 17 ، والفئران18 ، والفأر19 ، وجرو البيجل20 ، والزرد21. تشترك جميع النماذج في نفس الآلية التي تتعرض من خلالها لفرط التأكسج أثناء تطور الشبكية المبكر ثم تعود إلى البيئة المعيارية. لاحظ سميث وآخرون أن تعريض الجراء الفئران لفرط التأكسج من P7 لمدة 5 أيام أدى إلى شكل متطرف من انحدار الأوعية الدموية في شبكية العين المركزية وإعادتها إلى هواء الغرفة في P12 أدى تدريجيا إلى خصلات الأوعية الدموية الجديدة ، والتي نمت نحو الجسم الزجاجي19. كان هذا نموذج ماوس OIR موحد يسمى أيضا نموذج سميث. وقام كونور وآخرون بتحسين البروتوكول وقدموا طريقة قابلة للتطبيق عالميا لتحديد مساحة VO (طمس الأوعية) و NV (الأوعية الدموية الجديدة) في عام 2009 ، مما زاد من قبول واستخدام النموذج22. لا يزال نموذج الماوس OIR هو النموذج الأكثر استخداما على نطاق واسع الآن بسبب صغر حجمه ، وتكاثره السريع ، وخلفيته الوراثية الواضحة ، وقابليته للتكرار الجيد ، ومعدل نجاحه العالي.
في الفئران ، تبدأ الأوعية الدموية في الشبكية بعد الولادة مع نمو الأوعية من رأس العصب البصري إلى شبكية العين الداخلية نحو أورا سيراتا. أثناء نمو الشبكية الطبيعي، تنبت الأوعية الشبكية الأولى من رأس العصب البصري حول الولادة، وتشكل شبكة موسعة (الضفيرة الأولية) التي تصل إلى المحيط حول يوم ما بعد الولادة 7 (P7)23. ثم تبدأ الأوعية في النمو في شبكية العين لتشكيل طبقة عميقة ، واختراق شبكية العين ، وإنشاء شبكة صفائحية حول الطبقة النووية الداخلية (INL) كما هو الحال في الإنسان24. بحلول نهاية الأسبوع الثالث بعد الولادة (P21) ، اكتمل تقريبا تطور الضفيرة الأعمق. بالنسبة لنموذج الماوس OIR ، يظهر انسداد الأوعية الدموية دائما في شبكية العين المركزية بسبب الانحطاط السريع لعدد كبير من شبكات الأوعية الدموية غير الناضجة في المنطقة الوسطى أثناء التعرض لفرط التأكسج. لذلك ، يحدث نمو الأوعية الدموية الجديدة المرضية أيضا في شبكية العين المحيطية الوسطى ، وهي حدود المنطقة غير التروية ومنطقة الأوعية الدموية. ومع ذلك ، فقد تشكلت أوعية الشبكية البشرية تقريبا قبل الولادة. أما بالنسبة للأطفال الخدج، فإن شبكية العين الطرفية ليست وعائية بالكامل عند تعرضها لفرط التأكسج25,26. لذلك يظهر انسداد الأوعية الدموية والأوعية الدموية الجديدة بشكل رئيسي في شبكية العين الطرفية27,28. على الرغم من هذه الاختلافات ، فإن نموذج OIR للفأر يلخص عن كثب الأحداث المرضية التي تحدث أثناء الأوعية الدموية الجديدة الناجمة عن نقص التروية.
يمكن تقسيم تحريض نموذج OIR إلى مرحلتين29: في المرحلة 1 (مرحلة فرط التأكسج) ، يتم إيقاف نمو الأوعية الدموية في شبكية العين أو تخلفه مع انسداد وانحدار الأوعية الدموية نتيجة لانخفاض VEGF وموت الخلايا المبرمج للخلايا البطانية 24,30 ؛ في المرحلة 2 (مرحلة نقص الأكسجة) ، ستصبح إمدادات الأكسجين في شبكية العين غير كافية في ظل ظروف هواء الغرفة29 ، وهو أمر ضروري للنمو العصبي والتوازن 19,31. عادة ما يؤدي هذا الوضع الإقفاري إلى توسع الأوعية الدموية الجديدة غير المنظم وغير الطبيعي.
حاليا ، طريقة النمذجة شائعة الاستخدام هي بالتناوب بين التعرض العالي / المنخفض للأكسجين: تتعرض الأمهات وصغارهن للأكسجين بنسبة 75٪ لمدة 5 أيام في P7 تليها 5 أيام في هواء الغرفة حتى أظهر P17 نتائج مماثلة22 ، وهي نقطة النهاية لتحريض نموذج الماوس OIR. (الشكل 1). بالإضافة إلى محاكاة ROP ، يمكن أيضا استخدام هذا التنسيب المرضي بوساطة نقص التروية لدراسة أمراض الشبكية الإقفارية الأخرى. تشمل القياسات الرئيسية لهذا النموذج تحديد مساحة VO و NV ، والتي يتم تحليلها من حوامل مسطحة في الشبكية عن طريق تلطيخ التألق المناعي أو تروية FITC-dextran. يمكن دراسة كل فأر مرة واحدة فقط بسبب العملية المميتة. في الوقت الحاضر ، هناك طرق قليلة لمراقبة التغيرات الديناميكية للأوعية الدموية في الشبكية بشكل مستمر أثناء عملية الانحدار الوعائي وتكوين الأوعية الدموية المرضية32. في هذه الورقة ، نقدم بروتوكولا مفصلا لتحريض نموذج OIR ، وتحليل الحوامل المسطحة في الشبكية بالإضافة إلى سير عمل تصوير الأوعية الدموية بقاع العين (FFA) على الفئران والذي سيكون مفيدا في الحصول على فهم أكثر شمولا للتغيرات الديناميكية الوعائية خلال مرحلتين من نموذج فأر OIR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL sterile syringe</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0550</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Transgen Biotech</td>
			<td>&#160;FG701-01</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive microscope slides</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CC 2019</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td></td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide gas</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slide</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14127</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI staining solution</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228549</td>
			<td>For labeling nucleus on retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olmpus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss</td>
			<td>AxioImager.Z2</td>
			<td>For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting media</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>&#160;0100-01</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxypropyl Methylcellulose</td>
			<td>Maya</td>
			<td>89161</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin B4 594 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21413</td>
			<td>For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice C57/BL6J</td>
			<td>GemPharmatech of Jiangsu Province</td>
			<td></td>
			<td>For OIR model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors-straight blade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503242</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.4 straight forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>&#160;501978-6</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7475</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 sensor</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For monitoring the level of O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyCycler</td>
			<td>Biospherix</td>
			<td>A84XOV</td>
			<td>For OIR model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-1KG</td>
			<td>For tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda lime</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTRALIS HRA+OCT</td>
			<td>Heidelberg</td>
			<td>HC00500002</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPSS Statistics 22.0</td>
			<td>IBM</td>
			<td></td>
			<td>For statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tansference decloring shaker</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td>ZD-2008</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (Low attachment)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3261-20EA</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;SLBW6818</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Imaging Software</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>For image acquisition and export</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring dynamic growth of retinal vessels in oxygen-induced retinopathy mouse model

يستخدم اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين (OIR) على نطاق واسع لدراسة نمو الأوعية غير الطبيعي في أمراض الشبكية الإقفارية، بما في ذلك اعتلال الشبكية الخداجي (ROP)، واعتلال الشبكية السكري التكاثري (PDR)، وانسداد الوريد الشبكي (RVO). معظم دراسات OIR تلاحظ الأوعية الدموية الجديدة في شبكية العين في نقاط زمنية محددة. ومع ذلك ، فإن نمو الأوعية الديناميكي في الفئران الحية على طول مسار زمني ، وهو أمر ضروري لفهم أمراض الأوعية المرتبطة ب OIR ، لم تتم دراسته بشكل كاف. هنا ، نصف بروتوكولا خطوة بخطوة لتحريض نموذج الماوس OIR ، مع تسليط الضوء على المزالق المحتملة ، وتوفير طريقة محسنة لتحديد مناطق طمس الأوعية (VO) والأوعية الدموية الجديدة (NV) بسرعة باستخدام تلطيخ التألق المناعي. الأهم من ذلك ، قمنا بمراقبة إعادة نمو الأوعية في الفئران الحية من P15 إلى P25 عن طريق إجراء تصوير الأوعية الدموية قاع العين بالفلوريسين (FFA) في نموذج فأر OIR. يسمح لنا تطبيق FFA على نموذج الماوس OIR بمراقبة عملية إعادة التشكيل أثناء إعادة نمو السفينة.

في نموذج الماوس OIR ، فإن النتيجة الأكثر أهمية وأساسية هي التحديد الكمي لمنطقة VO و NV. بعد العيش في بيئة فرط التأكسج لمدة 5 أيام من P7 ، أظهرت شبكية العين المركزية للجراء أكبر منطقة غير تروية. تحت تحفيز نقص الأكسجة في 5 أيام أخرى ، تم إنتاج الأوعية الدموية الجديدة في الشبكية تدريجيا والتي تألقت ب...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model at JoVE.com

Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

يصف هذا البروتوكول طريقة مفصلة لإعداد وتلطيخ التألق المناعي للحوامل المسطحة لشبكية العين لدى الفئران وتحليلها. يتم وصف استخدام تصوير الأوعية الدموية قاع العين بالفلوريسين (FFA) لجراء الفئران ومعالجة الصور بالتفصيل أيضا.

مراقبة النمو الديناميكي لأوعية الشبكية في نموذج فأر اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...

يمكن أن يساعد هذا البروتوكول الباحثين على فصل شبكية العين بسهولة للفئران ومراقبة التغيرات الديناميكية في الأوعية الدموية الشبكية لنموذج فأر OIR. المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي الحفاظ على سلامة شبكية العين المنفصلة والسماح لكل فأر بالعمل كعنصر تحكم خاص به ، مما يجعل النتائج أكثر قابلية للمقارنة. قد يكافح الباحثون الذين يجربون هذه الطريقة لأول مرة أثناء أخذ صور التوجيه الخمسة لأنه من الصعب بعض الشيء وضع الجراء في الموضع الصحيح.لجمع الأنسجة لتركيب الشبكية بالكامل، استخدم مقص منحني لفصل مقل العيون عن النسيج المداري لجرو C57-Black/6 الرحيم. ثم أدخل ملقطا منحنيا في الجزء الخلفي من مقلة العين ، مع تثبيت العصب البصري ورفع العين بسرعة من المدار. ضع مقل العيون في PBS المبرد مسبقا لإزالة أي شعر ودم من السطح.عندما يتم جمع جميع مقل العيون ، انقل مقل العيون النظيف إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة مليلترين يحتوي على 4٪ بارافورمالديهايد ، واحتضنه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و 12 إلى 15 دورة في الدقيقة. في نهاية الحضانة ، أضف قطرة من PBS إلى مركز طبق ثقافة تحت مجهر تشريح ، وضع مقلة عين واحدة في القطرة. عند إمساك مقلة العين بزوج من الملقط ، استخدم إبرة حقنة سعة ملليلتر واحد لثقب القرنية بعناية في طرف القرنية.أدخل طرف زوج من المقصات في الثقب ، واقطع القرنية على طول طرف القرنية ، مع الحرص على عدم قطع شبكية العين. استخدم الملقط لإزالة القزحية والعدسة، وضع كوب العين المتبقي في 4٪ بارافورمالديهايد لحضانة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الخلاط. في نهاية الحضانة ، ضع كوب العين الثابت في قطرة جديدة من PBS في وسط طبق ثقافي جديد.امسك كأس العين بزوج واحد من الملقط ، استخدم زوجا ثانيا من الملقط لفصل طبقات شبكية العين والصلبة بلطف. ضع طرف المقص بين طبقات الشبكية والصلبة ، واقطع الصلبة باتجاه العصب البصري. قشر الصلبة من شبكية العين للحصول على كوب الشبكية.باستخدام الملقط ، حرر الاتصال بين الأوعية الهيالويد الشعاعية والشبكية المحيطية. استخدم ماصة سعة مليلترين مع قطع الطرف لنقل كوب الشبكية إلى بئر واحد من صفيحة 48 بئرا لمدة ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة PBS على الخلاط. بعد الغسيل الأخير ، احتضن الكوب في 1٪ Triton X-100 و 5٪ مصل الحمير العادي في PBS بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية.لتسمية الأوعية الدموية في الشبكية بالإيزوليكتين B4 ، احتضن شبكية العين في بئر واحد من صفيحة 48 بئرا في 400 ميكرولتر 0.1٪ مصل حمار طبيعي مكمل بالإيزولوكتين B4-594 بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية على شاكر. إذا لزم الأمر ، يمكن إضافة جسم مضاد أولي آخر في نفس الوقت. في اليوم التالي ، اغسل شبكية العين بثلاث غسلات لمدة 20 دقيقة بنسبة 0.1٪ PBST على الخلاط.بعد الغسيل الأخير ، احتضن شبكية العين بجسم مضاد ثانوي مناسب عالي التقارب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة قبل وضع علامة على العينة باستخدام DAPI لمدة 20 إلى 25 دقيقة. في نهاية الحضانة ، اغسل شبكية العين بثلاث غسلات لمدة 30 دقيقة في 0.1٪ PBST في درجة حرارة الغرفة مع الاهتزاز. بعد الغسل الأخير ، انقل كوب الشبكية إلى شريحة نظيفة مع توجيه الفتحة لأعلى ، واستخدم المجهر لقطع شبكية العين شعاعيا في مواضع الساعة الثالثة والسادسة والتاسعة و12 من المحيط نحو المركز ، حتى واحد إلى 1.5 ملم من رأس العصب البصري.شطف شبكية العين ثلاث مرات مع بضع قطرات من PBS لكل غسل قبل استخدام الورق وضعت في الهواء لتجفيف وتسطيح الشبكية. أضف قطرة من وسط التركيب إلى وسط الغطاء حتى يغطي قطر القطيرة نصف الغطاء الانزلاقي. ثم ضع بسرعة الغطاء المتصاعد على الجانب المتوسط لأسفل على شبكية العين المنتشرة.بمجرد إعداد جميع حوامل الشبكية المسطحة ، يمكن تصوير العينات بواسطة المجهر الفلوري البؤري. للتصوير في الجسم الحي ، أضف 20 ميكرولتر من قطرات العين التي لا تعد ولا تحصى لتحقيق توسع حدقة العين لفترة طويلة. بعد خمس دقائق ، ضع الجراء في وضع مستقر على وسادة تدفئة صغيرة أمام جهاز التصوير.للحفاظ على الرطوبة في القرنيات، أضف بانتظام دموعا اصطناعية طوال عملية التصوير. بعد ذلك ، انقر فوق تصوير قاع العين بالأشعة تحت الحمراء على الجهاز لضبط رأس العصب البصري إلى وسط الشاشة. حقن داخل الصفاق 150 ميكرولتر من محلول ملح الصوديوم الفلوريسين بنسبة 0.5٪ ، وانقر على الفور فوق زري FA و Injection على لوحة اللمس في جهاز التصوير لبدء تشغيل المؤقت.بعد ثلاث دقائق ، عندما تدخل الدورة الدموية للشبكية المرحلة الوريدية ، احصل على الصورة الأولى للشبكية المركزية. حرك عدسة جهاز التصوير أفقيا إلى الجانب الأنفي من العين حتى يقع رأس العصب البصري في منتصف جانب واحد من منطقة التقاط الصورة، والتقط الصورة الثانية. استمر في تحريك العدسة واحصل على صور للشبكية الصدغية والمتفوقة والسفلية بنفس الطريقة.لمعالجة صور الشبكية في برنامج معالجة تصوير مناسب، افتح القائمة ملف وانقر فوق جديد لإنشاء لوحة قماشية جديدة بخلفية سوداء. افتح صورة الشبكية المركزية. ثم انقر فوق ملف لإضافة صورة ثانية.اضبط عتامة الصورة الثانية إلى 60٪ وحرك الصورة وقم بتغيير حجمها حتى تتداخل الصورتان. انقر فوق التبديل بين أوضاع التحويل الحر والاعوجاج ، وقم بإجراء تعديلات دقيقة على الأوعية إذا لزم الأمر. ثم اضبط عتامة الصورة الثانية مرة أخرى على 100٪ حدد كلتا الصورتين، وانقر فوق طبقات المزج التلقائي.حدد البانوراما كطريقة مزج، وحدد أيضا مربعات النغمات والألوان السلسة والمساحات الشفافة للتعبئة الواعية بالمحتوى. انقر فوق موافق لإكمال خياطة الصورتين الأوليين. بعد ذلك ، أضف الصورة الثالثة ، وقم بخياطة هذه الصورة إلى أول صورتين كما هو موضح حتى يتم خياطة جميع الصور الخمس من شبكية العين الواحدة.عندما تتم معالجة جميع الصور من التحليل ، استخدم أداة المحاصيل لاقتصاص صور FFA إلى حجم موحد لتسهيل مراقبة التغيرات في ديناميكيات الأوعية الدموية في الشبكية في نقاط زمنية مختلفة للنمو. بعد خمسة أيام من التعرض لفرط التأكسج ، تظهر الشبكية المركزية للجراء بعد يوم ما بعد الولادة 12 منطقة كبيرة غير تروية. عند الانتقال إلى خمسة أيام من حالات نقص الأكسجة ، تصبح الشبكية تدريجيا وعيا وعائيا جديدا ، مما يدل على زيادة في إشارة التألق أقوى من تلك التي لوحظت في الأوعية الطبيعية المحيطة.بعد يوم ما بعد الولادة 17 ، يتراجع الوليد الوعائي المرضي بسرعة وتظهر شبكية العين مظهرا طبيعيا تماما بحلول اليوم 25 بعد الولادة. يمكن تحقيق قابلية جيدة للتكرار والاستقرار لنموذج اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين من خلال التحكم في حجم القمامة وزيادة الوزن بعد الولادة للجراء. كما لوحظ ، فإن طمس الأوعية الدموية عادة ما يبلغ ذروته في اليوم 12 بعد الولادة ويختفي في اليوم 25 بعد الولادة بينما يبلغ طمس الأوعية الدموية الجديدة ذروته في اليوم 17 بعد الولادة ويتراجع بحلول يوم ما بعد الولادة 25.في يوم ما بعد الولادة 15 إلى 25 الفئران اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين، يزيد قطر الأوعية الدموية في الشبكية ويصبح معذبا للغاية مقارنة بتلك التي لوحظت لشبكية العين لدى الفئران الطبيعية. يلعب الملقط الموجود في اليد اليسرى بشكل أساسي دورا داعما. احرص على عدم الضغط على مقلة العين ، والتي يمكن أن تشوهها أو تمزقها.

Research

JoVE Journal

Biology

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

تطبيق فاتح الشفاء الراتنج لاصق الأسنان أو تركيب لأقطاب مجسات Microdialysis في التجارب المزمنة

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

مستدعى خلية كاملة تسجيلات الضوء التيارات متشابك مثير في شريحة الشبكية

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

في الجسم الحي التصوير والعلاجات العلاجية في الفأر نموذج مثلي من سرطان المبيض

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

عزل الخلايا الجذعية من شبكية العين بالعين ماوس

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

رصد التغيرات الدينامية في مستويات الكالسيوم الميتوكوندريا خلال موت الخلايا المبرمج باستخدام جهاز استشعار الكالسيوم مشفرة وراثيا

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

على المدى الطويل اختبار السمية المهلكة مع القشريات الأرتيميا franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

التحقق من صحة نموذج الفأر لعرقلة ينك مجمعات بطريقة خلية محددة

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

في إعداد الوجه من ماوس سفن الدم

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

حقن الخلية الداخلية عبر كتلة من الخلايا الجذعية الجنينية يؤدي إلى ارتفاع في أسعار تشيميريسم

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...