Name: monitoring dynamic growth of retinal vessels in oxygen-induced retinopathy mouse model
Uploaded: 2021-04-02T14:00:00
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我们感谢我们实验室和中山眼科中心眼科动物实验室的所有成员的技术援助。我们还要感谢刘春桥教授的实验支持。这项工作得到了中国国家自然科学基金（NSFC：81670872;北京市）、广东省自然科学基金（批准号：2019A1515011347）、中山市眼科中心眼科国家重点实验室高水平医院建设项目（批准号303020103;中国广东省广州市）。

所有涉及使用小鼠的程序均由中国中山大学中山眼科中心动物实验伦理委员会批准（授权编号：2020-082），并符合中山市眼科中心动物护理和使用委员会批准的指南和视觉和眼科协会（ARVO）关于动物用于眼科和视觉研究的声明。
1. 小鼠OIR模型的归纳
<ol><li>使用眼睛先天性畸形率较低的小鼠，例如C57BL / 6J小鼠，并以雄性/雌性= 1：2的比例交配它们。让同一天出生的幼崽在P7开?...

小鼠对OIR的易感性受到许多因素的影响。不同遗传背景和品系的幼崽无法比较。在BALB/c白化小鼠中，血管迅速重新生长到VO区，新生血管簇38明显减少，这给研究带来了一些困难。在C57BL / 6小鼠中，与BALB / cJ小鼠品系39，40相比，光感受器损伤增加。不同类型的转基因小鼠41，42，<sup cl...

视网膜新生血管形成（RNV）被定义为新的病理血管起源于现有视网膜静脉的状态，通常沿着视网膜内表面延伸并生长到玻璃体（或在某些情况下的视网膜下空间）1。它是许多缺血性视网膜病的标志和共同特征，包括早产儿视网膜病变 （ROP）、视网膜静脉阻塞 （RVO） 和增殖性糖尿病视网膜病变 （PDR）2。
大量临床和实验观察表明，缺血是视网膜新生血管形成的主要原因3，4。在ROP中，新生儿在封闭的培养箱中暴露于高水平氧气以提高存活率，这也是阻止血管生长的重要驱动因素。治疗完成后，新生儿的视网膜经历相对缺氧期5。其他情况见于RVO中中央或分支视网膜静脉的闭塞，并且还观察到视网膜毛细血管的损伤，这是由PDR2中的微血管病引起的。缺氧通过缺氧诱导的因子-1α（HIF-1α）信号通路进一步增加血管生成因子（如血管内皮生长因子（VEGF））的表达，进而引导血管内皮细胞生长到缺氧区域并形成新血管6，7。
ROP是早产儿血管增殖性视网膜病变的一种，是儿童失明的主要原因8，9，其特征是视网膜缺氧，视网膜新生血管形成和纤维增生10，11，12。在1950年代，研究人员发现，高浓度的氧气可以显着改善早产儿的呼吸道症状13，14。因此，氧疗在当时越来越多地用于早产儿15。然而，在早产儿广泛使用氧疗的同时，ROP的发病率逐年增加。从那时起，研究人员将氧气与ROP联系起来，探索各种动物模型以了解ROP和RNV16的发病机制。
在人类中，大多数视网膜脉管系统的发育在出生前完成，而在啮齿动物中，视网膜脉管系统在出生后发育，为研究视网膜脉管系统中的血管生成提供了一个可访问的模型系统2。随着研究的不断进展，氧诱导视网膜病变（OIR）模型已成为模拟缺血引起的病理性血管生成的主要模型。OIR模型的研究中没有特定的动物物种，该模型已经在各种动物物种中开发，包括小猫17，大鼠18，小鼠19，比格犬幼犬20和斑马鱼21。所有模型都具有相同的机制，即它们在视网膜发育早期暴露于高氧，然后返回常氧环境。Smith等人观察到，将小鼠幼崽暴露于P7的高氧中5天会导致中央视网膜血管回归的极端形式，并将它们带回P12处的室内空气中，逐渐触发新生血管簇，向玻璃体生长19。这是一个标准化的OIR小鼠模型，也称为史密斯模型。Connor等人在2009年进一步优化了协议，提供了一种普遍适用的方法来量化VO（血管闭塞）和NV（新生血管形成）的面积，提高了模型22的接受度和利用率。OIR小鼠模型因其体积小、繁殖快、遗传背景清晰、重复性好、成功率高等特点，仍然是现在应用最广泛的模型。
在小鼠中，视网膜血管形成在出生后开始，血管从视神经头向视网膜内向锯齿状动脉内生长。在正常的视网膜发育过程中，第一条视网膜血管在出生时从视神经头发芽，形成一个扩张的网络（初级神经丛），在出生后第 7 天（P7）23 左右到达外围。然后血管开始长入视网膜形成深层，穿透视网膜，并在内核层（INL）周围建立层流网络，就像人类24一样。到产后第三周（P21）结束时，更深的神经丛发育几乎完成。对于OIR小鼠模型，血管闭塞总是出现在中央视网膜中，因为在高氧暴露期间中央区域的大量未成熟血管网络迅速退化。因此，病理性新生血管的生长也发生在中外周视网膜，这是非灌注区和血管区的边界。然而，人类视网膜血管几乎在出生前就已经形成。至于早产儿，当暴露于高氧25，26时，周围视网膜没有完全血管化。所以血管闭塞和新生血管形成主要出现在周边视网膜27，28。尽管存在这些差异，但小鼠OIR模型密切概括了缺血诱导的新生血管形成期间发生的病理事件。
OIR模型的诱导可分为两个阶段29：在第1阶段（高氧阶段），由于VEGF下降和内皮细胞凋亡，视网膜血管发育因血管闭塞和退化而停止或延迟24，30;在第 2 阶段（缺氧阶段），在室内空气条件下视网膜氧气供应将变得不足29，这对于神经发育和体内平衡19，31 至关重要。这种缺血情况通常会导致不受调节的异常新生血管形成。
目前，常用的建模方法是交替的高/低氧暴露：母亲和它们的幼崽在P7下暴露在75%的氧气下5天，然后在室内空气中暴露5天，直到P17显示出可比的结果22，这是OIR小鼠模型诱导的终点。（图1）。除了模拟ROP，这种缺血介导的病理性新生血管也可用于研究其他缺血性视网膜疾病。该模型的主要测量包括量化VO和NV的面积，通过免疫荧光染色或FITC-葡聚糖灌注从视网膜平面安装中分析。由于致命的操作，每只老鼠只能研究一次。目前，在血管消退和病理血管生成过程中连续观察视网膜血管系统动态变化的方法很少32.在本文中，我们提供了OIR模型诱导的详细方案，视网膜平面安装的分析以及荧光素眼底血管造影（FFA）的工作流程，这将有助于更全面地了解OIR小鼠模型两个阶段的血管动力学变化。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL sterile syringe</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0550</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Transgen Biotech</td>
			<td>&#160;FG701-01</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive microscope slides</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CC 2019</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td></td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide gas</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slide</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14127</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI staining solution</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228549</td>
			<td>For labeling nucleus on retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olmpus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss</td>
			<td>AxioImager.Z2</td>
			<td>For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting media</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>&#160;0100-01</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxypropyl Methylcellulose</td>
			<td>Maya</td>
			<td>89161</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin B4 594 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21413</td>
			<td>For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice C57/BL6J</td>
			<td>GemPharmatech of Jiangsu Province</td>
			<td></td>
			<td>For OIR model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors-straight blade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503242</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.4 straight forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>&#160;501978-6</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7475</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 sensor</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For monitoring the level of O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyCycler</td>
			<td>Biospherix</td>
			<td>A84XOV</td>
			<td>For OIR model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-1KG</td>
			<td>For tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda lime</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTRALIS HRA+OCT</td>
			<td>Heidelberg</td>
			<td>HC00500002</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPSS Statistics 22.0</td>
			<td>IBM</td>
			<td></td>
			<td>For statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tansference decloring shaker</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td>ZD-2008</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (Low attachment)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3261-20EA</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;SLBW6818</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Imaging Software</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>For image acquisition and export</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring dynamic growth of retinal vessels in oxygen-induced retinopathy mouse model

氧诱导性视网膜病变 （OIR） 广泛用于研究缺血性视网膜疾病的异常血管生长，包括早产儿视网膜病变 （ROP）、增殖性糖尿病视网膜病变 （PDR） 和视网膜静脉阻塞 （RVO）。大多数OIR研究在特定时间点观察到视网膜新生血管形成;然而，活小鼠在时间过程中的动态血管生长对于理解OIR相关的血管疾病至关重要，但尚未得到充分研究。在这里，我们描述了诱导OIR小鼠模型的分步方案，强调了潜在的陷阱，并提供了一种改进的方法，以使用免疫荧光染色快速量化血管闭塞（VO）和新生血管形成（NV）区域。更重要的是，我们通过在OIR小鼠模型中进行荧光素眼底血管造影（FFA）来监测活小鼠从P15到P25的血管再生。将FFA应用于OIR小鼠模型使我们能够观察血管再生过程中的重塑过程。

在OIR小鼠模型中，最重要和最基本的结果是VO和NV区域的量化。从P7开始在高氧环境中生活5天后，幼崽的中央视网膜显示出最大的非灌注区域。再过5 d在缺氧的刺激下，视网膜新生血管逐渐产生，荧光比周围正常血管更强烈。P17之后，病理性新生血管化的荧光信号随着视网膜的重塑而迅速消退（图5A）。通过控制幼崽的窝产仔数和出生后体重增加，OIR小鼠模型的VO和NV面积表现...

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Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

该协议描述了用于制备和免疫荧光染色小鼠视网膜平板支架和分析的详细方法。还详细描述了荧光素眼底血管造影（FFA）对小鼠幼崽和图像处理的使用。

监测氧诱导视网膜病变小鼠模型中视网膜血管的动态生长

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...

该方案可以帮助研究人员轻松分离小鼠的视网膜，并观察OIR小鼠模型视网膜脉管系统的动态变化。这种方法的主要优点是保持分离视网膜的完整性，并允许每只小鼠作为自己的对照，这使得结果更具可比性。第一次尝试这种方法的研究人员在进行五次定向成像时可能会遇到困难，因为将幼崽放置在正确的位置有点困难。要收集组织以进行视网膜整体安装，请使用弯曲剪刀将眼球与安乐死的 C57-Black/6 幼犬的眼眶组织断开。然后，将弯曲的镊子插入眼球的后部，夹住视神经并迅速将眼睛从眼眶中抬出。将眼球放入预冷的PBS中，以去除表面的任何毛发和血液。收集完所有眼球后，将清洁的眼球转移到含有4%多聚甲醛的两毫升微量离心管中，并在室温下孵育15分钟，每分钟孵育12至15转。在孵育结束时，在解剖显微镜下将一滴PBS添加到培养皿的中心，并将一个眼球放入滴中。用一对镊子握住眼球，用一毫升注射器针头小心地刺穿角膜缘处的角膜。将一把剪刀的尖端插入穿刺中，并沿着角膜缘切割角膜，注意不要割断视网膜。使用镊子去除虹膜和晶状体，并将剩余的眼罩置于4%多聚甲醛中，在摇床上室温孵育45分钟。在孵育结束时，将固定眼罩放在新培养皿中心的一滴新鲜的PBS中。用一对镊子握住眼罩，用第二对镊子轻轻分开视网膜和巩膜层。将剪刀的尖端放在视网膜和巩膜层之间，然后将巩膜切向视神经。从视网膜上剥离巩膜以获得视网膜杯。使用镊子，松开径向透明质血管和周边视网膜之间的连接。使用切断吸头的两毫升移液器将视网膜杯转移到 48 孔板的一个孔中，在摇床上的室温 PBS 下进行三次五分钟的洗涤。最后一次洗涤后，将杯子在 PBS 中的 1% Triton X-100 和 5% 普通驴血清中在 4 摄氏度下孵育过夜。要用异凝集素 B4 标记视网膜脉管系统，将视网膜在 48 孔板的一个孔中孵育在 400 微升补充有异凝集素 B4-594 的 400 微升 0.1% 正常驴血清中，在摇床上以 4 摄氏度过夜。如有必要，可以同时添加另一种一抗。第二天，在摇床上用0.1%PBST洗涤三次20分钟洗涤视网膜。最后一次洗涤后，将视网膜与适当的高亲和力二抗在室温下孵育一小时，然后用DAPI标记样品20至25分钟。在孵育结束时，在室温下以0.1%PBST振荡洗涤视网膜，每次30分钟洗涤。最后一次洗涤后，将视网膜杯转移到干净的载玻片上，开口朝上，然后使用显微镜在三点钟、六点钟、九点钟和 12 点钟位置从外围向中心放射状切割视网膜，距离视神经头最多 1 到 1.5 毫米。每次洗涤用几滴PBS冲洗视网膜三次，然后使用干法纸干燥并压平视网膜。在盖玻片的中心加入一滴封片剂，直到液滴的直径覆盖盖玻片的一半。然后快速将盖玻片安装介质面朝下放在展开的视网膜上。一旦所有视网膜平面支架都准备好了，就可以通过共聚焦荧光显微镜对样品进行成像。对于体内成像，添加20微升散瞳眼药水，以实现持久的瞳孔扩张。五分钟后，将幼崽放在成像设备前面的小加热垫上，处于稳定位置。为了保持角膜中的水分，请在整个成像过程中定期添加人工泪液。接下来，单击设备上的红外眼底成像，将视神经头调整到屏幕中央。腹腔注射150微升0.5%荧光素钠盐溶液，立即点击成像设备触摸屏上的FA和注射按钮启动定时器。三分钟后，当视网膜的血液循环进入静脉期时，获得中央视网膜的第一个图像。将成像装置的晶状体水平移动到眼睛的鼻侧，直到视神经头位于图像采集区域一侧的中点，然后拍摄第二张图像。继续移动晶状体并以相同的方式获取颞视网膜、上视网膜和下视网膜的图像。要在适当的成像处理程序中处理视网膜图像，请打开“文件”菜单并单击“新建”以创建具有黑色背景的新画布。打开中央视网膜的图像。然后单击“文件”以添加第二个图像。将第二张图像的不透明度调整为 60%，然后移动图像并调整其大小，直到两个图像重叠。单击在自由变换和变形模式之间切换，并在必要时对容器进行细微调整。然后将第二张图像的不透明度设置回 100%选择两个图像，然后单击“自动混合图层”。选中“全景”作为混合方法，并选中“无缝色调和颜色”和“内容感知填充透明区域”框。单击“确定”完成前两个图像的拼接。接下来，添加第三张图像，并将该图像拼接到前两张图像，如图所示，直到拼接单个视网膜的所有五张图像。处理完分析中的所有图像后，使用裁剪工具将FFA图像裁剪为均匀大小，以便观察不同发育时间点视网膜脉管系统动力学的变化。暴露于高氧 5 天后，出生后第 12 天幼崽的中央视网膜显示出较大的非灌注区域。在转移到缺氧条件下五天后，视网膜逐渐新生血管化，表现出比周围正常血管中观察到的更强的荧光信号增加。出生后第 17 天后，病理性新生血管迅速消退，到出生后第 25 天视网膜显示完全正常的外观。通过控制幼崽的窝产仔数和出生后体重增加，可以实现氧诱导视网膜病变模型的良好重复性和稳定性。据观察，血管闭塞通常在产后第 12 天达到峰值，在出生后第 25 天消失，而新生血管形成在出生后第 17 天达到峰值，并在出生后第 25 天消退。在出生后第15至25天氧诱导的视网膜病变小鼠中，与正常小鼠的视网膜相比，视网膜血管直径增加并变得非常折磨人。左手的镊子主要起辅助作用。注意不要挤压眼球，这可能会使其变形或破裂。

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