Name: monitoring dynamic growth of retinal vessels in oxygen-induced retinopathy mouse model
Uploaded: 2021-04-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model at JoVE.com

We bedanken alle leden van ons laboratorium en het oogheelkundig dierenlaboratorium van Zhongshan Ophthalmic Center voor hun technische assistentie. We bedanken ook Prof. Chunqiao Liu voor experimentele ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (NSFC: 81670872; Beijing, China), de Natural Science Foundation van de provincie Guangdong, China (Grant No.2019A1515011347), en high-level ziekenhuisbouwproject van state key laboratory of ophthalmology in Zhongshan Ophthalmic Center (Grant No. 303020103; Guangzhou, provincie Guangdong, China).

Alle procedures met betrekking tot het gebruik van muizen zijn goedgekeurd door de dierexperimentele ethische commissie van Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University, China (geautoriseerd nummer: 2020-082), en in overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen van animal care and use committee van Zhongshan Ophthalmic Center en de Association Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research.
1. Inductie van muis OIR-model</p...

De gevoeligheid van muizen voor OIR wordt beïnvloed door vele factoren. De pups met verschillende genetische achtergronden en stammen kunnen niet worden vergeleken. Bij BALB/c albino muizen groeien bloedvaten snel terug in het VO-gebied met significante verminderde neovasculaire plukjes38, wat het onderzoek enigszins bemoeilijkt. Bij C57BL/6-muizen is er sprake van verhoogde fotoreceptorschade in vergelijking met BALB/cJ-muizenstam39,40. ...

Retinale neovascularisatie (RNV), die wordt gedefinieerd als een toestand waarin nieuwe pathologische vaten afkomstig zijn van bestaande retinale aderen, strekt zich meestal uit langs het binnenoppervlak van het netvlies en groeit onder sommige omstandigheden uit tot de glasvochtige (of subretinale ruimte)1. Het is een kenmerk en gemeenschappelijk kenmerk van veel ischemische retinopathieën, waaronder retinopathie van prematuriteit (ROP), retinale ader occlusie (RVO) en proliferatieve diabetische retinopathie (PDR)2.
Talrijke klinische en experimentele waarnemingen hebben aangetoond dat ischemie de belangrijkste oorzaak is van retinale neovascularisatie 3,4. Bij ROP worden pasgeborenen blootgesteld aan zuurstof op hoog niveau in gesloten couveuses om de overlevingskansen te verhogen, wat ook een belangrijke drijfveer is voor het stoppen van vasculaire groei. Nadat de behandeling is voltooid, ervaren de netvliezen van pasgeborenen een relatief hypoxische periode5. Andere situaties worden gezien in de occlusie van centrale of branch retinale aderen in RVO en schade aan retinale haarvaten wordt ook waargenomen die wordt veroorzaakt door microangiopathie in PDR2. Hypoxie verhoogt verder de expressie van angiogene factoren zoals vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) via de hypoxie-geïnduceerde factor-1α (HIF-1α) signaalroute die op zijn beurt vasculaire endotheelcellen begeleiden om in het hypoxische gebied te groeien en nieuwe bloedvaten te vormen 6,7.
ROP is een soort vasculaire proliferatieve retinopathie bij te vroeg geboren baby's en een belangrijke oorzaak van kinderblindheid 8,9, die wordt gekenmerkt door retinale hypoxie, retinale neovascularisatie en fibreuze hyperplasie 10,11,12. In de jaren 1950 ontdekten onderzoekers dat een hoge concentratie zuurstof de ademhalingssymptomen van premature baby's aanzienlijk kan verbeteren13,14. Als gevolg hiervan werd zuurstoftherapie in toenemende mate gebruikt bij premature baby's op dat moment15. Gelijktijdig met het wijdverbreide gebruik van zuurstoftherapie bij te vroeg geboren baby's, nam de incidentie van ROP echter jaar na jaar toe. Sindsdien hebben onderzoekers zuurstof gekoppeld aan ROP en verschillende diermodellen onderzocht om de pathogenese van ROP en RNV16 te begrijpen.
Bij de mens wordt de meeste retinale vasculatuurontwikkeling voltooid vóór de geboorte, terwijl bij knaagdieren de retinale vasculatuur zich na de geboorte ontwikkelt, wat een toegankelijk modelsysteem biedt om angiogenese in de retinale vasculatuur te bestuderen2. Met de voortdurende voortgang van het onderzoek zijn zuurstof-geïnduceerde retinopathie (OIR) modellen belangrijke modellen geworden voor het nabootsen van pathologische angiogenese als gevolg van ischemie. Er zijn geen specifieke diersoorten in de studie van het OIR-model en het model is ontwikkeld bij verschillende diersoorten, waaronder kitten17, rat18, muis19, beagle puppy20 en zebravis21. Alle modellen delen hetzelfde mechanisme waarmee ze worden blootgesteld aan hyperoxie tijdens de vroege retinale ontwikkeling en vervolgens terugkeren naar de normoxische omgeving. Smith et al. merkten op dat het blootstellen van muispups aan hyperoxie van P7 gedurende 5 dagen een extreme vorm van vaatregressie in het centrale netvlies veroorzaakte en ze terugbracht naar de kamerlucht op P12, geleidelijk neovasculaire plukjes veroorzaakte, die naar het glasachtig lichaam groeiden19. Dit was een gestandaardiseerd OIR-muismodel dat ook wel Smith-model wordt genoemd. Connor et al. hebben het protocol verder geoptimaliseerd en een universeel toepasbare methode geleverd om het gebied van VO (vaso-obliteratie) en NV (neovascularisatie) in 2009 te kwantificeren, waardoor de acceptatie en het gebruik van het model22 is toegenomen. Het OIR-muismodel is nu nog steeds het meest gebruikte model vanwege zijn kleine formaat, snelle reproductie, duidelijke genetische achtergrond, goede herhaalbaarheid en hoge slagingspercentage.
Bij muizen begint retinale vascularisatie na de geboorte met de ingroei van bloedvaten van de oogzenuwkop in het binnenste netvlies naar de ora serrata. Tijdens de normale retinale ontwikkeling ontspruiten de eerste retinale vaten rond de geboorte uit de oogzenuwkop en vormen ze een uitdijend netwerk (de primaire plexus) dat de periferie bereikt rond postnatale dag 7 (P7) 23. Dan beginnen de vaten in het netvlies te groeien om een diepe laag te vormen, het netvlies binnen te dringen en een laminair netwerk rond de binnenste nucleaire laag (INL) te vormen zoals bij de mens24. Tegen het einde van de derde postnatale week (P21) is de diepere plexusontwikkeling bijna voltooid. Voor het OIR-muismodel verschijnt vasculaire occlusie altijd in het centrale netvlies vanwege de snelle degeneratie van een groot aantal onrijpe vasculaire netwerken in het centrale gebied tijdens blootstelling aan hyperoxia. De groei van pathologische neovascularisatie vindt dus ook plaats in het midden-perifere netvlies, wat de grens is van het niet-perfusiegebied en het vasculaire gebied. Menselijke retinale vaten hebben zich echter bijna voor de geboorte gevormd. Wat premature baby's betreft, is het perifere netvlies niet volledig gevasculariseerd bij blootstelling aan hyperoxie25,26. Vasculaire occlusie en neovascularisatie komen dus vooral voor in het perifere netvlies27,28. Ondanks deze verschillen recapituleert het muis OIR-model nauw de pathologische gebeurtenissen die optreden tijdens door ischemie geïnduceerde neovascularisatie.
De inductie van het OIR-model kan worden onderverdeeld in twee fasen29: in fase 1 (hyperoxiefase) wordt de retinale vasculaire ontwikkeling gestopt of vertraagd met occlusie en regressie van bloedvaten als gevolg van de afname van VEGF en de apoptose van endotheelcellen24,30; in fase 2 (hypoxiefase) zal de retinale zuurstoftoevoer onvoldoende worden onder kamerluchtomstandigheden29, wat essentieel is voor neurale ontwikkeling en homeostase 19,31. Deze ischemische situatie resulteert meestal in ongereguleerde, abnormale neovascularisatie.
Momenteel is de veelgebruikte modelleringsmethode afwisselend hoge / lage zuurstofblootstelling: moeders en hun pups worden gedurende 5 dagen blootgesteld aan 75% zuurstof op P7 gevolgd door 5 dagen in kamerlucht totdat P17 vergelijkbare resultaten liet zien22, wat het eindpunt is van OIR-muismodelinductie. (Figuur 1). Naast het simuleren van ROP, kan deze ischemie-gemedieerde pathologische neovascularisatie ook worden gebruikt om andere ischemische retinale ziekten te bestuderen. De belangrijkste metingen van dit model omvatten het kwantificeren van het gebied van VO en NV, die worden geanalyseerd van retinale platte mounts door immunofluorescentiekleuring of FITC-dextran-perfusie. Elke muis kan slechts één keer worden bestudeerd vanwege de dodelijke operatie. Op dit moment zijn er weinig methoden om dynamische veranderingen van retinale vasculatuur continu te observeren tijdens het proces van vasculaire regressie en pathologische angiogenese32. In dit artikel geven we een gedetailleerd protocol van OIR-modelinductie, analyse van retinale flat mounts en een workflow van fluoresceïne fundusangiografie (FFA) op muizen, wat nuttig zou zijn om een uitgebreider begrip te krijgen van vasculaire dynamische veranderingen tijdens twee fasen van het OIR-muismodel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL sterile syringe</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0550</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Transgen Biotech</td>
			<td>&#160;FG701-01</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive microscope slides</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CC 2019</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td></td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide gas</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slide</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14127</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI staining solution</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228549</td>
			<td>For labeling nucleus on retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olmpus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss</td>
			<td>AxioImager.Z2</td>
			<td>For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting media</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>&#160;0100-01</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxypropyl Methylcellulose</td>
			<td>Maya</td>
			<td>89161</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin B4 594 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21413</td>
			<td>For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice C57/BL6J</td>
			<td>GemPharmatech of Jiangsu Province</td>
			<td></td>
			<td>For OIR model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors-straight blade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503242</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.4 straight forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>&#160;501978-6</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7475</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 sensor</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For monitoring the level of O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyCycler</td>
			<td>Biospherix</td>
			<td>A84XOV</td>
			<td>For OIR model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-1KG</td>
			<td>For tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda lime</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTRALIS HRA+OCT</td>
			<td>Heidelberg</td>
			<td>HC00500002</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPSS Statistics 22.0</td>
			<td>IBM</td>
			<td></td>
			<td>For statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tansference decloring shaker</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td>ZD-2008</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (Low attachment)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3261-20EA</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;SLBW6818</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Imaging Software</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>For image acquisition and export</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring dynamic growth of retinal vessels in oxygen-induced retinopathy mouse model

Zuurstof-geïnduceerde retinopathie (OIR) wordt veel gebruikt om abnormale vaatgroei bij ischemische retinale ziekten te bestuderen, waaronder retinopathie van prematuriteit (ROP), proliferatieve diabetische retinopathie (PDR) en retinale ader occlusie (RVO). De meeste OIR-studies observeren retinale neovascularisatie op specifieke tijdstippen; de dynamische vaatgroei in levende muizen langs een tijdsverloop, die essentieel is voor het begrijpen van de OIR-gerelateerde vaatziekten, is echter onderbelicht. Hier beschrijven we een stapsgewijs protocol voor de inductie van het OIR-muismodel, waarbij we de potentiële valkuilen benadrukken en een verbeterde methode bieden om snel gebieden van vaso-obliteratie (VO) en neovascularisatie (NV) te kwantificeren met behulp van immunofluorescentiekleuring. Wat nog belangrijker is, we hebben de hergroei van bloedvaten in levende muizen van P15 tot P25 gevolgd door fluoresceïne fundusangiografie (FFA) uit te voeren in het OIR-muismodel. De toepassing van FFA op het OIR-muismodel stelt ons in staat om het verbouwingsproces tijdens de hergroei van het vat te observeren.

In het OIR-muismodel is het belangrijkste en belangrijkste resultaat de kwantificering van het VO- en NV-gebied. Na 5 dagen vanaf P7 in de hyperoxie-omgeving te hebben geleefd, vertoonde het centrale netvlies van de pups het grootste niet-perfusiegebied. Onder de stimulatie van hypoxie in nog eens 5 dagen werd geleidelijk retinale neovascularisatie geproduceerd die intenser fluoresceerde dan omliggende normale bloedvaten. Na P17 nam het fluorescentiesignaal van pathologische neovascularisatie snel af als de remodellering...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model at JoVE.com

Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor de bereiding en immunofluorescentiekleuring van retinale flat mounts en analyse van muizen. Het gebruik van fluoresceïne fundusangiografie (FFA) voor muizenpups en beeldverwerking worden ook in detail beschreven.

Monitoring van dynamische groei van retinale vaten in zuurstof-geïnduceerde retinopathie muismodel

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...

Dit protocol kan onderzoekers helpen de netvliezen van muizen gemakkelijk te scheiden en de dynamische veranderingen in de retinale vasculatuur van het OIR-muismodel te observeren. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn het behoud van de integriteit van de gescheiden netvliezen en het toestaan van elke muis om als zijn eigen controle te dienen, waardoor de resultaten meer vergelijkbaar zijn. Onderzoekers die deze methode voor de eerste keer proberen, kunnen moeite hebben tijdens het maken van de vijf oriëntatiebeelden omdat het een beetje moeilijk is om pups in de juiste positie te plaatsen.Om het weefsel te verzamelen voor retinale montage, gebruikt u een gebogen schaar om de oogbollen los te koppelen van het orbitale weefsel van een geëuthanaseerde C57-Black / 6-pup. Plaats vervolgens gebogen tangen in het achterste deel van de oogbol, klem de oogzenuw vast en til het oog snel uit de baan. Plaats de oogbollen in voorgekoelde PBS om eventuele haren en bloed van het oppervlak te verwijderen.Wanneer alle oogbollen zijn verzameld, breng de gereinigde oogbollen over naar een microcentrifugebuis van twee milliliter met 4% paraformaldehyde en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en 12 tot 15 omwentelingen per minuut. Voeg aan het einde van de incubatie een druppel PBS toe aan het midden van een kweekschaal onder een ontleedmicroscoop en plaats een oogbol in de druppel. Houd de oogbol vast met een tang en gebruik een naald met een spuit van één milliliter om het hoornvlies voorzichtig bij de cornea limbus te prikken.Steek de punt van een schaar in de punctie en knip het hoornvlies langs de cornea limbus, waarbij u voorzichtig bent om het netvlies niet te knippen. Gebruik een tang om de iris en lens te verwijderen en plaats de resterende oogschelp in 4% paraformaldehyde voor een incubatie van 45 minuten bij kamertemperatuur op de shaker. Plaats aan het einde van de incubatie de vaste oogschelp in een verse druppel PBS in het midden van een nieuw cultuurgerecht.Houd de oogschelp vast met één tang en gebruik een tweede paar tangen om de retina- en scleralagen voorzichtig te scheiden. Plaats de punt van de schaar tussen het netvlies en de scleralagen en knip de sclera naar de oogzenuw. Verwijder de sclera van het netvlies om de retinale cup te verkrijgen.Laat met behulp van een tang de verbinding tussen de radiale hyaluoïde vaten en het perifere netvlies los. Gebruik een pipet van twee milliliter met de punt afgesneden om de retinale beker over te brengen in een putje van een 48-well plaat gedurende drie wasbeurten van vijf minuten in PBS op kamertemperatuur op de shaker. Na de laatste wasbeurt incubeer je de cup in 1%Triton X-100 en 5%normaal ezelsserum in PBS 's nachts bij vier graden Celsius.Om de retinale vasculatuur te labelen met isolectine B4, incubeer het netvlies in één putje van een 48-well plaat in 400 microliter 0,1% normaal ezelserum aangevuld met isolectine B4-594 's nachts bij 4 graden Celsius op een shaker. Indien nodig kan tegelijkertijd een ander primair antilichaam worden toegevoegd. Was de volgende dag het netvlies met drie wasbeurten van 20 minuten in 0,1% PBST op de shaker.Na de laatste wasbeurt incubeer het netvlies met een geschikt secundair antilichaam met hoge affiniteit gedurende één uur bij kamertemperatuur voordat u het monster gedurende 20 tot 25 minuten met DAPI labelt. Was aan het einde van de incubatie het netvlies met drie wasbeurten van 30 minuten in 0,1% PBST bij kamertemperatuur met schudden. Breng na de laatste wasbeurt de retinale cup over naar een schone dia met de opening naar boven gericht en gebruik de microscoop om het netvlies radiaal te snijden op de drie,zes, negen en 12 uur posities van de periferie naar het midden, tot één tot 1,5 millimeter van de oogzenuwkop.Spoel het netvlies drie keer met een paar druppels PBS per wasbeurt voordat u luchtgelegd papier gebruikt om het netvlies te drogen en plat te maken. Voeg een druppel montagemedium toe aan het midden van de coverslip totdat de diameter van de druppel de helft van de coverslip bedekt. Plaats vervolgens snel de coverslip montagemediumzijde naar beneden op het uitgespreide netvlies.Zodra alle retinale flat mounts zijn voorbereid, kunnen de monsters worden afgebeeld met confocale fluorescentiemicroscopie. Voeg voor in vivo beeldvorming 20 microliter mydriatische oogdruppels toe om langdurige pupilverwijding te bereiken. Plaats de pups na vijf minuten in een stabiele positie op een klein verwarmingskussen voor het beeldvormingsapparaat.Om vocht in de hoornvliezen te behouden, voegt u regelmatig kunstmatige tranen toe tijdens de beeldvormingsprocedure. Klik vervolgens op Infrared Fundus Imaging op het apparaat om de oogzenuwkop naar het midden van het scherm aan te passen. Intraperitoneaal injecteren 150 microliter 0,5% fluoresceïne natriumzoutoplossing en klik onmiddellijk op de FA- en injectieknoppen op het aanraakscherm van het beeldvormingsapparaat om de timer te starten.Na drie minuten, wanneer de bloedcirculatie van het netvlies de veneuze fase is ingegaan, verwerft u het eerste beeld van het centrale netvlies. Verplaats de lens van het beeldvormingsapparaat horizontaal naar de nasale kant van het oog totdat de oogzenuwkop zich in het midden van één kant van het beeldacquisitiegebied bevindt en maak de tweede afbeelding. Blijf de lens bewegen en verkrijg beelden van het temporale, superieure en inferieure netvlies op dezelfde manier.Als u de retinale afbeeldingen wilt verwerken in een geschikt beeldverwerkingsprogramma, opent u het menu Bestand en klikt u op Nieuw om een nieuw canvas met een zwarte achtergrond te maken. Open het beeld van het centrale netvlies. Klik vervolgens op Bestand om een tweede afbeelding toe te voegen.Pas de dekking van de tweede afbeelding aan op 60% en verplaats en wijzig het formaat van de afbeelding totdat de twee afbeeldingen elkaar overlappen. Klik op Schakelen tussen vrije transformatie- en verdraaiingsmodi en breng indien nodig subtiele aanpassingen aan de vaten aan. Stel vervolgens de dekking van de tweede afbeelding weer in op 100% Selecteer beide afbeeldingen en klik op Lagen automatisch overvloeien.Schakel Panorama in als overvloeimethode en vink ook de selectievakjes aan voor Naadloze tonen en kleuren en Transparante gebieden met behoud van inhoud vullen. Klik op OK om het naaien van de eerste twee afbeeldingen te voltooien. Voeg vervolgens de derde afbeelding toe en naai deze afbeelding aan de eerste twee afbeeldingen zoals gedemonstreerd totdat alle vijf de afbeeldingen van een enkel netvlies zijn gestikt.Wanneer alle afbeeldingen uit de analyse zijn verwerkt, gebruikt u de Crop Tool om de FFA-afbeeldingen bij te snijden tot een uniforme grootte om observatie van de veranderingen in de retinale vasculatuurdynamiek op verschillende ontwikkelingstijdpunten te vergemakkelijken. Na vijf dagen blootstelling aan hyperoxie vertonen de centrale netvliezen van postnatale dag 12 pups een groot niet-perfusiegebied. Bij overdracht naar vijf dagen hypoxische omstandigheden neovasculariseren de netvliezen geleidelijk, waarbij een toename van fluorescentiesignaal wordt vertoond dat sterker is dan dat waargenomen in de omliggende normale bloedvaten.Na postnatale dag 17 neemt de pathologische neovascularisatie snel af en vertoont het netvlies een volledig normaal uiterlijk op postnatale dag 25. Een goede herhaalbaarheid en stabiliteit van zuurstof-geïnduceerde retinopathie model kan worden bereikt door het strooisel grootte en postnatale gewichtstoename van de pups te regelen. Zoals waargenomen, piekt de vaso-obliteratie meestal op postnatale dag 12 en verdwijnt op postnatale dag 25, terwijl de neovascularisatie piekt op postnatale dag 17 en terugvalt op postnatale dag 25.Op postnatale dag 15 tot 25 zuurstof-geïnduceerde retinopathie muizen, neemt de retinale bloedvatdiameter toe en wordt zeer martelend in vergelijking met die waargenomen voor de netvliezen van normale muizen. De tang in de linkerhand speelt vooral een ondersteunende rol. Zorg ervoor dat u niet in de oogbol knijpt, die deze kan vervormen of scheuren.

Research

JoVE Journal

Biology

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

Toepassing van de Light-cured Dental lijm hars voor permanente montage elektroden of Microdialyseprobes bij chronische experimenten

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

Whole-cell Opnames van Licht prikkelende synaptische Stromingen opgeroepen in het netvlies Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo beeldvorming en therapeutische behandelingen in een orthotope Muis Model van eierstokkanker

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Isolatie van het netvlies stamcellen van de muis Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Monitoring dynamische veranderingen in het mitochondriaal calciumgehalte Tijdens Apoptosis Met behulp van een genetisch gecodeerd Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Lange-termijn Lethal toxiciteit Test met de Schaal- Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Validatie van een muismodel voor LINC Complexen verstoren in een cel-specifieke manier

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

En Voorbereiding van Muis Bloedvaten

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Een grafische gebruikersinterface voor software-assisted tracking van eiwitconcentratie in dynamische cellulaire protrusies

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Trans-inner Cell Mass injectie van embryonale stamcellen tot hogere Chimerism tarieven leidt

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...