Name: monitoring dynamic growth of retinal vessels in oxygen-induced retinopathy mouse model
Uploaded: 2021-04-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model at JoVE.com

אנו מודים לכל החברים מהמעבדה שלנו וממעבדת בעלי החיים של Zhongshan Ophthalmic Center על הסיוע הטכני שלהם. אנו מודים גם לפרופ' צ'ונקיאו ליו על התמיכה הניסיונית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC: 81670872; בייג'ינג, סין), הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג, סין (מענק מס '2019A1515011347), ופרויקט בניית בית חולים ברמה גבוהה ממעבדת מפתח המדינה לרפואת עיניים במרכז העיניים ז'ונגשאן (מענק מס '303020103; גואנגג'ואו, מחוז גואנגדונג, סין).

כל ההליכים הכרוכים בשימוש בעכברים אושרו על ידי ועדת האתיקה הניסויית בבעלי חיים של מרכז העיניים Zhongshan, אוניברסיטת סון יאט-סן, סין (מספר מורשה: 2020-082), ובהתאם להנחיות המאושרות של ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של מרכז העיניים Zhongshan והצהרת האגודה לחקר ראייה ועיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים בחקר עי...

הרגישות של עכברים ל- OIR מושפעת מגורמים רבים. לא ניתן להשוות בין גורים בעלי רקע גנטי וזנים שונים. בעכברי לבקנים BALB/c, כלי הדם צומחים מחדש לאזור ה-VO במהירות עם הפחתה משמעותית של ציצים ניאו-וסקולריים38, מה שמביא כמה קשיים למחקר. בעכברי C57BL/6 יש נזק מוגבר לפוטורצפטור בהשוואה לזן עכבר BALB...

ניאו-וסקולריזציה של הרשתית (RNV), המוגדרת כמצב שבו כלי דם פתולוגיים חדשים מקורם בוורידים קיימים ברשתית, משתרעת בדרך כלל לאורך המשטח הפנימי של הרשתית וגדלה לתוך הזגוגית (או החלל התת-קרקעי בתנאים מסוימים)1. זהו סימן היכר ומאפיין נפוץ של רטינופתיות איסכמיות רבות, כולל רטינופתיה של פגות (ROP), חסימת ורידים ברשתית (RVO) ורטינופתיה סוכרתית מתפשטת (PDR)2.
תצפיות קליניות וניסיוניות רבות הצביעו על כך שאיסכמיה היא הגורם העיקרי לניאו-וסקולריזציה של הרשתית 3,4. ב- ROP, ילודים נחשפים לחמצן ברמה גבוהה באינקובטורים סגורים כדי להגדיל את שיעורי ההישרדות, שהוא גם מניע חשוב לעצירת צמיחת כלי הדם. לאחר סיום הטיפול, הרשתיות של תינוקות חווים תקופה היפוקסית יחסית5. מצבים אחרים נראים בחסימה של ורידים ברשתית מרכזית או מסועפת ב- RVO ונזק של נימי הרשתית נצפה גם אשר נגרמת על ידי מיקרואנגיופתיה ב PDR2. היפוקסיה מגבירה עוד יותר את הביטוי של גורמים אנגיוגניים כגון גורם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF) דרך מסלול האיתות המושרה על ידי היפוקסיה-1α (HIF-1α) אשר בתורו מנחה את תאי אנדותל כלי הדם לגדול לתוך האזור ההיפוקסי וליצור כלי דם חדשים 6,7.
ROP הוא סוג של רטינופתיה שגשוגית וסקולרית בפגים וגורם מוביל לעיוורון ילדות8,9, המאופיין בהיפוקסיה ברשתית, ניאו-וסקולריזציה של הרשתית והיפרפלזיה סיבית10,11,12. בשנות ה-50 של המאה ה-20, חוקרים מצאו כי ריכוז גבוה של חמצן יכול לשפר באופן משמעותי את התסמינים הנשימתיים של פגים13,14. כתוצאה מכך, טיפול בחמצן היה בשימוש הולך וגובר בפגים באותה תקופה15. עם זאת, במקביל לשימוש הנרחב בטיפול בחמצן בפגים, שכיחות ה-ROP עלתה משנה לשנה. מאז, חוקרים קישרו חמצן ל-ROP, וחקרו מודלים שונים של בעלי חיים כדי להבין את הפתוגנזה של ROP ו-RNV16.
באדם, רוב התפתחות כלי הדם ברשתית מסתיימת לפני הלידה ואילו במכרסמים כלי הדם ברשתית מתפתחים לאחר הלידה, ומספקים מערכת מודל נגישה לחקר אנגיוגנזה בכלי הדם ברשתית2. עם ההתקדמות המתמשכת של המחקר, מודלים של רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן (OIR) הפכו למודלים מרכזיים לחיקוי אנגיוגנזה פתולוגית הנובעת מאיסכמיה. אין מיני בעלי חיים ספציפיים במחקר של מודל OIR והמודל פותח במיני בעלי חיים שונים, כולל חתלתול 17, חולדה18, עכבר19, גור ביגל 20 ודג זברה21. כל המודלים חולקים את אותו מנגנון שבאמצעותו הם נחשפים להיפראוקסיה במהלך התפתחות הרשתית המוקדמת ולאחר מכן מוחזרים לסביבה הנורמוקסית. סמית' ואחרים הבחינו בכך שחשיפת גורי עכברים להיפרוקסיה מ-P7 במשך 5 ימים גרמה לצורה קיצונית של רגרסיה של כלי הדם ברשתית המרכזית והחזרתם לאוויר החדר ב-P12 עוררה בהדרגה ציצים ניאו-וסקולריים, שגדלו לכיוון הגוף הזגוגי19. זה היה דגם עכבר OIR סטנדרטי שנקרא גם כמודל סמית'. Connor et al. המשיכו לייעל את הפרוטוקול וסיפקו שיטה ישימה אוניברסלית לכימות האזור של VO (מחיקה של vaso) ו- NV (neovascularization) בשנת 2009, מה שהגדיל את הקבלה והניצול של מודל22. מודל עכבר OIR הוא עדיין המודל הנפוץ ביותר כיום בגלל גודלו הקטן, רבייה מהירה, רקע גנטי ברור, יכולת חזרה טובה ושיעור הצלחה גבוה.
בעכברים, כלי הדם ברשתית מתחילים לאחר הלידה עם צמיחה של כלי דם מראש עצב הראייה לתוך הרשתית הפנימית לכיוון ora serrata. במהלך התפתחות רשתית תקינה, כלי הרשתית הראשונים נובטים מראש עצב הראייה סביב הלידה, ויוצרים רשת מתרחבת (מקלעת ראשונית) המגיעה לפריפריה סביב היום שלאחר הלידה 7(P7)23. לאחר מכן כלי הדם מתחילים לגדול לתוך הרשתית כדי ליצור שכבה עמוקה, לחדור את הרשתית, וליצור רשת למינרית סביב השכבה הגרעינית הפנימית (INL) כמו באדם24. בסוף השבוע השלישי שלאחר הלידה (P21), פיתוח מקלעת עמוקה יותר כמעט הושלם. עבור מודל עכבר OIR, חסימת כלי הדם מופיעה תמיד ברשתית המרכזית בגלל התנוונות מהירה של מספר רב של רשתות כלי דם לא בשלות באזור המרכז במהלך חשיפה להיפרוקסיה. לכן, הצמיחה של neovascularization פתולוגי מתרחשת גם ברשתית ההיקפית האמצעית, שהיא הגבול של האזור שאינו זלוף ואת אזור כלי הדם. עם זאת, כלי רשתית אנושיים כמעט נוצרו לפני הלידה. באשר לפגים, הרשתית ההיקפית אינה וסקולרית לחלוטין כאשר היא נחשפת להיפרוקסיה25,26. אז חסימת כלי דם וניאו-וסקולריזציה מופיעות בעיקר ברשתית ההיקפית27,28. למרות הבדלים אלה, מודל OIR העכבר משחזר מקרוב את האירועים הפתולוגיים המתרחשים במהלך ניאו-וסקולריזציה הנגרמת על ידי איסכמיה.
ניתן לחלק את האינדוקציה של מודל OIR לשני שלבים29: בשלב 1 (שלב היפרוקסיה), התפתחות כלי הדם ברשתית נעצרת או מפגרת עם חסימה ורגרסיה של כלי הדם כתוצאה מהירידה ב- VEGF והאפופטוזיס של תאי האנדותל 24,30; בשלב 2 (שלב ההיפוקסיה), אספקת החמצן ברשתית תהפוך לבלתי מספקת בתנאי אוויר בחדר29, החיוניים להתפתחות עצבית ולהומאוסטזיס 19,31. מצב איסכמי זה גורם בדרך כלל לניאו-וסקולריזציה לא מפוקחת ולא תקינה.
נכון לעכשיו, שיטת המידול הנפוצה היא חשיפה לחמצן גבוה/נמוך לסירוגין: אמהות והגורים שלהן נחשפים ל-75% חמצן במשך 5 ימים ב-P7 ולאחר מכן 5 ימים באוויר החדר עד ש-P17 הדגים תוצאות דומות22, שהיא נקודת הקצה של אינדוקציה של מודל עכבר OIR. (איור 1). בנוסף להדמיית ROP, זה neovascularization פתולוגי בתיווך איסכמיה יכול לשמש גם כדי לחקור מחלות רשתית איסכמיות אחרות. המדידות העיקריות של מודל זה כוללות כימות השטח של VO ו- NV, אשר מנותחים מתוך תושבות שטוחות רשתית על ידי צביעת אימונופלואורסצנציה או זלוף FITC-dextran. כל עכבר יכול להיחקר רק פעם אחת בגלל הפעולה הקטלנית. כיום, ישנן כמה שיטות לבחון שינויים דינמיים של כלי הדם ברשתית ברציפות במהלך תהליך של רגרסיה וסקולרית ואנגיוגנזה פתולוגית32. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של אינדוקציה של מודל OIR, ניתוח של תושבות שטוחות ברשתית, כמו גם זרימת עבודה של אנגיוגרפיה פלואורסצנטית פונדוס (FFA) על עכברים אשר יהיה מועיל להשיג הבנה מקיפה יותר של שינויים דינמיים של כלי הדם במהלך שני שלבים של מודל עכבר OIR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL sterile syringe</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>YA0550</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Transgen Biotech</td>
			<td>&#160;FG701-01</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive microscope slides</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CC 2019</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td></td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide gas</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slide</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14127</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI staining solution</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228549</td>
			<td>For labeling nucleus on retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olmpus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6377</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss</td>
			<td>AxioImager.Z2</td>
			<td>For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G Mounting media</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>&#160;0100-01</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxypropyl Methylcellulose</td>
			<td>Maya</td>
			<td>89161</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin B4 594 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21413</td>
			<td>For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice C57/BL6J</td>
			<td>GemPharmatech of Jiangsu Province</td>
			<td></td>
			<td>For OIR model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissecting scissors-straight blade</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503242</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.4 straight forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>&#160;501978-6</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7475</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 sensor</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For monitoring the level of O2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OxyCycler</td>
			<td>Biospherix</td>
			<td>A84XOV</td>
			<td>For OIR model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-1KG</td>
			<td>For tissue fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda lime</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTRALIS HRA+OCT</td>
			<td>Heidelberg</td>
			<td>HC00500002</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPSS Statistics 22.0</td>
			<td>IBM</td>
			<td></td>
			<td>For statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tansference decloring shaker</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td>ZD-2008</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (Low attachment)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3261-20EA</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;SLBW6818</td>
			<td>For preparation of retinal flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Imaging Software</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td>For image acquisition and export</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring dynamic growth of retinal vessels in oxygen-induced retinopathy mouse model

רטינופתיה הנגרמת על-ידי חמצן (OIR) נמצאת בשימוש נרחב לחקר צמיחת כלי דם חריגה במחלות רשתית איסכמיות, כולל רטינופתיה של פגות (ROP), רטינופתיה סוכרתית מתרבה (PDR) וחסימת ורידים ברשתית (RVO). רוב מחקרי OIR מתבוננים בניאו-וסקולריזציה של הרשתית בנקודות זמן ספציפיות; עם זאת, הצמיחה הדינמית של כלי שיט בעכברים חיים לאורך מסלול זמן, החיונית להבנת מחלות כלי הדם הקשורות ל-OIR, לא נחקרה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שלב אחר שלב להשראת מודל עכבר OIR, המדגיש את המלכודות הפוטנציאליות, ומספק שיטה משופרת לכימות מהיר של אזורים של מחיקת כלי דם (VO) וניאו-וסקולריזציה (NV) באמצעות צביעת אימונופלואורסצנציה. חשוב מכך, עקבנו אחר צמיחה מחדש של כלי דם בעכברים חיים מ-P15 עד P25 על-ידי ביצוע אנגיוגרפיה פלואורסצנטית פונדוס (FFA) במודל עכבר OIR. היישום של FFA למודל העכבר OIR מאפשר לנו לבחון את תהליך השיפוץ במהלך צמיחה מחדש של כלי שיט.

במודל עכבר OIR, התוצאה החשובה והבסיסית ביותר היא כימות אזור ה- VO וה- NV. לאחר שחיו בסביבת היפרוקסיה במשך 5 ימים מ-P7, הרשתית המרכזית של הגורים הראתה את האזור הגדול ביותר ללא זילוף. תחת גירוי של היפוקסיה בעוד 5 ימים, neovascularization הרשתית הופק בהדרגה אשר פלואורסצנטי בעוצמה רבה יותר מאשר סביב כלי הדם הרג...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model at JoVE.com

Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת להכנה וצביעה אימונופלואורסצנטית של תושבות שטוחות רשתית של עכברים וניתוח. השימוש באנגיוגרפיה פלואורסצנטית פונדוס (FFA) עבור גורי עכברים ועיבוד תמונה מתוארים בפירוט גם כן.

ניטור צמיחה דינמית של כלי רשתית במודל עכבר רטינופתיה המושרה על ידי חמצן

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...

פרוטוקול זה יכול לסייע לחוקרים להפריד בקלות את הרשתיות של עכברים ולבחון את השינויים הדינמיים בכלי הדם ברשתית של מודל עכבר OIR. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם שימור שלמות הרשתיות המופרדות ומתן אפשרות לכל עכבר לשמש כבקרה משלו, מה שהופך את התוצאות להשוואה יותר. חוקרים שמנסים את השיטה הזו בפעם הראשונה עשויים להתקשות בזמן שהם לוקחים את חמש הדמיות האוריינטציה מכיוון שקצת קשה למקם את הגורים בתנוחה הנכונה.כדי לאסוף את הרקמה להרכבה מלאה של הרשתית, השתמש במספריים מעוקלים כדי לנתק את גלגלי העיניים מהרקמה המסלולית של גור C57-Black/6 שעבר המתת חסד. לאחר מכן, הכנס מלקחיים מעוקלים לחלק האחורי של גלגל העין, הידוק עצב הראייה והרמת העין במהירות מהמסלול. הניחו את גלגלי העיניים ב-PBS מקורר מראש כדי להסיר שיער ודם מפני השטח.לאחר שכל גלגלי העיניים נאספו, העבירו את גלגלי העיניים המנוקים לצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר המכיל 4% פרפורמלדהיד, ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ו-12 עד 15 סיבובים לדקה. בסוף הדגירה, הוסיפו טיפה של PBS למרכז צלחת תרבית תחת מיקרוסקופ מנתח, והכניסו גלגל עין אחד לתוך הטיפה. מחזיק את גלגל העין עם זוג מלקחיים, להשתמש מחט מזרק של מיליליטר אחד כדי לנקב בזהירות את הקרנית בלימבוס הקרנית.הכנס את הקצה של זוג מספריים לתוך לנקב, לחתוך את הקרנית לאורך לימבוס הקרנית, נזהר לא לחתוך את הרשתית. השתמשו במלקחיים כדי להסיר את הקשתית והעדשה, והניחו את שארית העינית ב-4% פרפורמלדהיד לדגירה של 45 דקות בטמפרטורת החדר על השייקר. בסוף הדגירה, הניחו את העין הקבועה בטיפה טרייה של PBS במרכז מנת תרבות חדשה.החזיקו את העין עם זוג מלקחיים אחד, השתמשו בזוג מלקחיים שני כדי להפריד בעדינות את שכבות הרשתית והסקלרה. מניחים את קצה המספריים בין שכבות הרשתית והסקלרה, וחותכים את הסקלרה לכיוון עצב הראייה. יש לקלף את הסקלרה מהרשתית כדי לקבל את הרשתית.באמצעות מלקחיים, לשחרר את החיבור בין כלי hyaloid רדיאלי ורשתית היקפית. השתמשו בפיפטה של שני מיליליטר כשהקצה חתוך כדי להעביר את הרשתית לבאר אחת של צלחת של 48 בארות לשלוש שטיפות של חמש דקות בטמפרטורת החדר PBS על השייקר. לאחר הכביסה האחרונה, יש לדגום את הגביע ב-1% טריטון X-100 ו-5% סרום חמורים רגיל ב-PBS למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.כדי לסמן את כלי הדם ברשתית עם איזולקטין B4, יש לדגור את הרשתית בבאר אחת של צלחת 48 באר ב-400 מיקרוליטרים 0.1% סרום חמורים רגיל בתוספת איזולקטין B4-594 למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על שייקר. במידת הצורך, ניתן להוסיף נוגדן ראשוני נוסף בו זמנית. ביום שלמחרת, יש לשטוף את הרשתית עם שלוש שטיפות של 20 דקות ב-0.1% PBST על השייקר.לאחר הכביסה האחרונה, לדגור על הרשתית עם נוגדן משני מתאים בעל זיקה גבוהה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר לפני תיוג הדגימה עם DAPI למשך 20 עד 25 דקות. בסוף הדגירה, שטפו את הרשתית בשלוש כביסות של 30 דקות ב-0.1% PBST בטמפרטורת החדר עם רעידות. לאחר השטיפה האחרונה, העבירו את הרשתית למגלשה נקייה כשהפתח פונה כלפי מעלה, והשתמשו במיקרוסקופ כדי לחתוך את הרשתית באופן רדיאלי בתנוחות שלוש, שש, תשע ו-12 מהפריפריה לכיוון המרכז, עד 1 עד 1.5 מילימטרים מראש עצב הראייה.שטפו את הרשתית שלוש פעמים עם כמה טיפות של PBS בכל שטיפה לפני שתשתמשו בנייר מונחה באוויר לייבוש ושיטוח הרשתית. הוסיפו טיפה של מדיום הרכבה למרכז הכיסוי עד שקוטר הטיפה מכסה מחצית ממכסה את הכיסוי. לאחר מכן הניחו במהירות את החלק הבינוני של הכיסוי על הרשתית החיצונית.לאחר הכנת כל התושבות השטוחות של הרשתית, ניתן לדמות את הדגימות על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית. להדמיית in vivo, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של טיפות עיניים מידריאטיות כדי להשיג התרחבות אישונים לאורך זמן. לאחר חמש דקות, הניחו את הגורים בתנוחה יציבה על כרית חימום קטנה מול מכשיר ההדמיה.כדי לשמור על הלחות בקרניות, יש להוסיף באופן קבוע קרעים מלאכותיים לאורך הליך ההדמיה. לאחר מכן, לחץ על הדמיית פונדוס אינפרא אדום במכשיר כדי להתאים את ראש עצב הראייה למרכז המסך. הזרקת 150 מיקרוליטר של תמיסת מלח נתרן 0.5% פלואורסצין, ולחץ מיד על לחצני FA והזרקה בלוח המגע של מכשיר ההדמיה כדי להפעיל את הטיימר.לאחר שלוש דקות, כאשר זרימת הדם של הרשתית נכנסה לשלב הוורידי, לרכוש את התמונה הראשונה של הרשתית המרכזית. הזז את עדשת מכשיר ההדמיה אופקית לצד האף של העין עד שראש עצב הראייה ממוקם בנקודת האמצע של צד אחד של אזור רכישת התמונה, וצלם את התמונה השנייה. המשך להזיז את העדשה ולקבל תמונות של הרשתית הטמפורלית, העליונה והנחותה באותו אופן.לעיבוד תמונות הרשתית בתוכנית עיבוד הדמיה מתאימה, פתחו את התפריט 'קובץ' ולחצו על 'חדש' ליצירת בד ציור חדש עם רקע שחור. פתח את התמונה של הרשתית המרכזית. לאחר מכן לחץ על קובץ כדי להוסיף תמונה שנייה.התאימו את אטימות התמונה השנייה ל-60%, הזיזו את התמונה ושנו את גודלה עד ששתי התמונות יחפפו. לחצו על 'עבור בין מצבי שינוי צורה חופשי' ו'עיקום', ובצעו התאמות עדינות בכלי הדם במידת הצורך. לאחר מכן החזירו את האטימות של התמונה השנייה ל- 100% בחרו בשתי התמונות, ולחצו על 'מיזוג שכבות אוטומטי'.סמן את פנורמה כשיטת המיזוג, וסמן גם את התיבות עבור גוונים וצבעים חלקים ומילוי מודע לתוכן אזורים שקופים. לחץ על אישור כדי להשלים את התפירה של שתי התמונות הראשונות. לאחר מכן, הוסף את התמונה השלישית, ותפור תמונה זו לשתי התמונות הראשונות כפי שהודגם עד שכל חמש התמונות מרשתית אחת נתפרו.לאחר עיבוד כל התמונות מניתוח, השתמש בכלי החיתוך כדי לחתוך את תמונות ה- FFA לגודל אחיד כדי להקל על התצפית על השינויים בדינמיקה של כלי הדם ברשתית בנקודות זמן התפתחותיות שונות. לאחר חמישה ימים של חשיפה להיפרוקסיה, הרשתיות המרכזיות של גורים לאחר יום 12 מדגימות אזור גדול ללא זילוף. עם המעבר לחמישה ימים של תנאים היפוקסיים, הרשתיות בהדרגה neovascularize, מראה עלייה באות פלואורסצנטי חזק יותר מזה שנצפה בכלי הדם הרגילים שמסביב.לאחר יום 17 לאחר הלידה, הניאו-וסקולריזציה הפתולוגית נסוגה במהירות והרשתית מדגימה מראה נורמלי לחלוטין ביום 25 שלאחר הלידה. ניתן להשיג חזרה טובה ויציבות של מודל רטינופתיה המושרה על ידי חמצן על ידי שליטה בגודל ההמלטה ועלייה במשקל לאחר הלידה של הגורים. כפי שנצפה, הכחדת כלי הדם מגיעה לשיאה בדרך כלל ביום 12 שלאחר הלידה ונעלמת ביום 25 שלאחר הלידה, בעוד שהניאו-וסקולריזציה מגיעה לשיאה ביום 17 שלאחר הלידה ונסוגה ביום 25 שלאחר הלידה.ביום שלאחר הלידה 15 עד 25 עכברי רטינופתיה המושרה על ידי חמצן, קוטר כלי הדם ברשתית עולה ונעשה מייסר מאוד בהשוואה לזה שנצפה עבור הרשתיות של עכברים רגילים. המלקחיים ביד שמאל משחקים בעיקר בתפקיד תומך. היזהר לא לסחוט את גלגל העין, אשר יכול לעוות או לקרוע אותו.

Research

JoVE Journal

Biology

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

יישום של שרף אור נרפא, דבק שיניים אלקטרודות הרכבה או בדיקות Microdialysis בניסויים כרונית

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

שלמות התא הקלטות של אור עורר זרמים Synaptic מעוררים פורסים את רשתית

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

בידוד של גזע תאים רשתית העין של העכבר

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

לטווח ארוך רעילות מבחן קטלני עם לסרטן הארטמיה franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

אימות של מודל עכבר לשבש מכלולי LINC באופן ספציפי בתא

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

הכנת פנים של כלי דם עכבר

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

תא הטרנס-הפנימית המוני הזרקה של תאי גזע עובריים מוביל שיעור גבוה יותר של Chimerism

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...